Name: Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Scopri come rilevare l'anastasis in vivo con il biosensore CaspaseTracker utilizzando Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di tracciare il recupero cellulare dopo l'attivazione delle caspasi.

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Ringraziamo Darren Obbard per Drosophila immagine in figura 3 e nel manoscritto dei video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb per la preziosa discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e NCI K22 concedere CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang è stato un Hildi e Kay Curci Foundation Fellow della Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

1) preparazione del biosensore CaspaseTracker mosche
<ol><li>Anestetizzare mosche con CO2e utilizzare un pennello per trasferire 7 a 10 caspase-sensibile Gal4 (DQVD)19 femmine vergini e 7 a 10 G-traccia53 Gal4 reporter giovane maschi mosche (o viceversa) nella stessa fiala con alimento e pasta di lievito fresco. Nota: Croce di mosche Gal4 Caspase-sensibili (DQVD) e G-traccia produrrà CaspaseTracker mosche di progenie. Croce dellaCaspase - sensibili (DQVA)19 Gal4e mosche G-traccia fornirà controllo negativo Vola (vedi discussione). Pasta di lievito fresco serve come fonte di proteine per migliorare la produzione di uova, così che aumenta il numero di discendenti. Selezionare le femmine vergini e giovane maschio vola secondo loro fenotipi54.</li>
	<li>Incubare le mosche a 18 gradi Celsius (oC) durante la croce per 3-7 giorni e quindi trasferire le mosche per un nuovo flacone per impostare una nuova croce a 18 ° C. Continuare a incubare il flaconcino originale a 18 ° C fino a progenie Vola eclose. Nota: Trasferire le mosche del padre a new Fiale per evitare sovraffollamento della progenie al flacone originale. Mosche di genitore in grado di produrre progenie con cibo fresco e pasta di lievito i primi 2-3 interruttori, e quindi la produttività significativamente diminuirà con il tempo. Alzando le mosche 18 ° C può ridurre il segnale aspecifiche di biosensore CaspaseTracker (vedi discussione).</li>
	<li>Selezionare progenie Vola con fenotipi corretta54 per i seguenti esperimenti. Nota: I transgeni di Gal4 caspase-sensibile e G-traccia qui si trova il secondo cromosoma, equilibrato con bilanciatore CyO. Selezionare la progenie di ala non-ricci (senza CyO), che ha entrambi transgeni di caspase-sensibili Gal4 e G-traccia.</li>
</ol>2) applicazione di induzione di morte transitoria delle cellule CaspaseTracker biosensore mosche
<ol><li>Trasferire 10 a 20 appena obtecta donna Vola in un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco per 1 giorno a 18 ° C per consentire la produzione di uova camera da oogenesi. Nota: Mantenendo la femmina con mosche maschi potrebbe migliorare la produzione di uova da camera.</li>
	<li>Per indurre l'uovo di Colombo all'apoptosi da colpo di freddo, trasferimento la femmina Vola al nuovo flacone vuoto, che viene poi collocato a-7 ° C per 1 h. Nota: Cold shock danneggia le cellule inducendo la rottura della membrana plasmatica55,56.</li>
	<li>Per indurre l'uovo chambers all'apoptosi da inedia di proteina, trasferire le mosche femminile ad un nuovo flacone con cibo di agar di saccarosio e 1% 8% a 18 ° C per 3 giorni. Nota: Fame di proteine (senza proteine alimentari) può innescare uovo di Colombo per subire apoptosi57,58,59 e autofagia60,61. Interruttore Vola in un nuovo flacone con 8% di saccarosio e 1% di cibo agar ogni giorno per mantenere condizioni ottimali del saccarosio volare.</li>
	<li>Trasferire le mosche stressate per 3 giorni a 18 ° C per consentire loro di recuperare un nuovo flacone con alimento fresco e pasta di lievito fresco. Sezionare la fame e le mosche affamato-recuperati per ottenere l'uovo di Colombo alle ovaie come descritto62. Nota: Per sezionare Drosophila per ottenere le ovaie, anestetizzare mosche con CO2e utilizzare 2 paia di pinze per rimuovere la testa di Mosca e utilizzare le pinze per estrarre la base dell'addome per rimuovere le ovaie delle mosche.</li>
</ol>3) fissazione e colorazione di Uovo sezionato alloggiamenti per l'Imaging
<ol><li>Trasferire gli alloggiamenti di Uovo sezionato insieme con intorno salino di 0,5 mL tamponato fosfato (PBS) per provette da centrifuga 1 mL. Lasciare le uova a stabilirsi. Nota: Ricoprire le punte di pipetta di plastica con 1% albumina di siero bovino (BSA) dissolto in acqua o in PBS per impedire gli alloggiamenti di uovo a bastone sulla superficie di plastica delle punte. Eseguire le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching di proteina fluorescente rossa (RFP, noto anche come DsRed) e la proteina fluorescente verde (GFP) nelle camere di uovo.</li>
	<li>Rimuovere il PBS pipettando e quindi applicare paraformaldeide 4% 0,5 mL in PBS per fissare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente al buio per 20-30 min. Nota: Applicare la rotazione delicata in questa e le seguenti fasi di incubazione.</li>
	<li>Rimuovere il paraformaldeide pipettando e poi lavato la camera con 0,5 mL PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) per 3 volte. Nota: Fissazione prolungata potrebbe ridurre i segnali RFP e GFP.</li>
	<li>Incubare le camere di uovo con PBST per 1 o 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C con delicata rotazione per permeabilize gli alloggiamenti di uovo. Nota: PBST può anche evitare uovo alloggiamenti per attaccare la superficie di plastica rivestita di non-BSA.</li>
	<li>Rimuovere il PBST pipettando e quindi applicare 0,5 mL di 10 μg/mL di colorante Hoechst nucleare in PBST agli alloggiamenti di uovo per 1 o 2 h a temperatura ambiente a macchiare per nucleo. Nota 1: Evitare l'incubazione prolungata con colorante nucleare come questo aumenterà il segnale aspecifico. Nota2: Approccio alternativo a macchiare il nucleo senza Hoechst consiste nell'aggiungere 200 agente di montaggio anti-candeggio μL con DAPI (Vedi materiali) ed incubare overnight63, prima di montare i tessuti il coprioggetto di vetro come descritto al protocollo 3.8. Nota3: eseguire la colorazione e le procedure seguenti nel buio per evitare photobleaching.</li>
	<li>Rimuovere il colorante nucleare pipettando e quindi applicare 0,5 mL PBST per lavare gli alloggiamenti di uovo nelle provette da centrifuga 1 mL per 3 volte, con incubazione di 10-20 min con delicata rotazione tra ogni fase di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere tutti i PBST con pipetta bene e quindi applicare 200 agente di montaggio anti-candeggio μL (Vedi materiali) per Incubare gli alloggiamenti di uovo a temperatura ambiente per 3 ore o una notte a 4 ° C fino a quando gli alloggiamenti di uovo affondano sul fondo del tubo. Nota: i tessuti che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio affondano sul fondo del tubo.</li>
	<li>Montare gli alloggiamenti di uovo tinto trasferendoli con 200 μL anti-sbianca fissaggio agente su una lastra di vetro pre-pulito per l'imaging di pipettaggio, coprire gli alloggiamenti di uovo con un vetrino coprioggetto 20x20 mm vetro pre-pulito e sigillare il coprioggetto sul vetrino mettendo smalto al bordo del vetrino coprioggetti. Nota 1: Pre-pulire il vetrino e il coprioggetto con acqua o 70% di etanolo. Nota2: Applicare vaselina tra il vetrino e il coprioggetto per evitare di distruggere gli alloggiamenti di uovo di compressione.</li>
	<li>Gli alloggiamenti di uovo usando la fluorescenza o microscopio confocale, utilizzando un 20x, NA 0,8 di immagine obiettivo piano-apocromatico, con eccitazione luce lunghezza d'onda 405 nm per la macchiatura nucleare (rilevare emissioni ~ 461 nm), 561 nm per RFP (attività di caspase in corso o recente) segnale ( rilevare l'emissione ~ 590 nm) e 488 nm per segnale di GFP (passato l'attività della caspasi) (rilevare emissioni ~ 518nm). Nota: Vedi i nostri protocolli pubblicati per microscopia20,64.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il sistema di biosensore dual CaspaseTracker è un romanzo e l'unico strumento che permette la rilevazione di recente o attività di caspase in corso, rilevamento delle cellule che hanno invertito la morte delle cellule e di sopravvivere dopo aver sperimentato caspase attività in vivo. Mentre l'attività della caspasi è stato tradizionalmente assunto come un segno distintivo dell'apoptosi, crescente gli studi rivelano che non apoptotiche caspase attività svolge ruoli potenziali nell...

Morte programmata delle cellule, come apoptosi, svolge un ruolo essenziale nello sviluppo embrionale e normale omeostasi eliminando le cellule indesiderate, ferite o pericolose in organismi multicellulari1,2,3. La perdita di equilibrio tra sopravvivenza e morte cellulare può portare a conseguenze fatali come cancro, insufficienza cardiaca, dell'autoimmunità e degenerazione4,5,6,7,8. Attivazione del boia caspases tradizionalmente è stato considerato come il "punto di non ritorno" in apoptosi9,10,11, come si innesca rapida e massiccia demolizione cellulare12, 13,14,15,16. Impegnativo questo dogma generale, abbiamo dimostrato che cellule primarie morente coltivate e le cellule tumorali possono recuperare non solo dopo l'attivazione delle caspasi, ma anche seguente cellula importante tra cui membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, tratti distintivi di morte frammentazione mitocondriale, rilascio di mitocondriale del citocromo c nel cytosol, nucleare e condensazione della cromatina, danno del DNA, frammentazione nucleare, l'esposizione di superficie delle cellule della fosfatidilserina (PS) e la formazione di corpi apoptotici 17 , 18 , 19 , 20 , 21. vi proponiamo quella anastasis è un fenomeno di recupero intrinseco delle cellule, come le cellule morte possono recuperare dopo la rimozione delle cellule morte stimoli17,18,19,20, 21. abbiamo coniato il termine "Anastasis" (Αναστάσης)18, che significa "rising alla vita" in greco, a descrivere questo fenomeno di recupero cellulare inaspettato. La nostra osservazione di anastasis è ulteriormente supportata da recenti studi indipendenti che rivelano anche il recupero delle cellule dopo la fosfatidilserina esternalizzazione22,23,24, limitata mitocondriale esterna di permeabilizzazione della membrana25, attivazione di stirpe misto chinasi-come (MLKL) e cella restringimento26.
Caratterizzare i meccanismi che regolano l'anastasis avrà implicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche lo spostamento di paradigma. Anastasis potrebbe rappresentare un meccanismo di cytoprotective precedentemente sconosciuti per salvare o preservare importanti cellule postmitotic e tessuti che sono difficili da sostituire e possibilmente conto per l'inversione di insufficienza cardiaca ventricolare scaricando con ventricolare di sinistra assistere dispositivi (LVADs)27,28, recupero di cellule fotorecettrici dopo esposizione transitoria di luce eccessiva29,30,31, o la riparazione dei neuroni dopo la ferita di cervello32. Se è così promuovere anastasis potrebbe migliorare il recupero di cellule e tessuti. Al contrario, anastasis potrebbe essere una tattica di fuga inaspettata usata dalle cellule tumorali per sopravvivere terapia d'induzione di morte delle cellule, causando cancro ricorrenza17,18. Di conseguenza, sopprimendo anastasis morendo, le cellule tumorali durante e dopo il trattamento del cancro potrebbe essere una strategia terapeutica novella per curare tumori impedendo loro ricaduta.
Durante il processo di anastasis, abbiamo trovato che alcune cellule recuperate acquisito alterazioni genetiche permanente e ha subito la trasformazione oncogena, probabilmente a causa di danni al DNA sostenute durante l'apoptosi18,20,21 . Invertire il processo di morte delle cellule con DNA danneggiato potrebbe essere un meccanismo della tumorigenesi, potenzialmente sottostante l'osservazione che ripete la lesione del tessuto aumenta il rischio di cancro in una varietà di tessuti, come lesione cronica termica nell'esofago indotto tramite il consumo di bevande molto calde33,34,35, danni al fegato a causa di alcolismo36,37, evoluzione del tumore dopo genotossici cancro terapia38, 39,40e lo sviluppo di nuovi cancri dai tessuti normali che si verificano durante gli intervalli tra i cicli di terapia anti-cancro41,42,43,44 . Se true, targeting anastasis potrebbe prevenire o arrestare e progressione del tumore. Abbiamo trovato che indotta da inedia morente le cellule di germe subiscono anastasis in ri-nutriti Drosophila19.  In caso di anastasis in cellule di germe con danno del DNA, potrebbe essere conto per l'osservazione che il prolungato stress ambientale promuove lo sviluppo di malattie genetiche. Ad esempio, carestie e contribuire allo sviluppo di transgenerazionale ereditabili malattie come il diabete e malattie cardiache coronariche45. Di conseguenza, anastasis comprensione potrebbe portare a strategie per la prevenzione di malattie ereditarie causate da questo meccanismo potenziale di sviluppo.
Per sfruttare la scoperta dell'anastasis e dirigerla per sviluppare terapie innovative, è essenziale per studiare la causa e conseguenza di anastasis in animali vivi. Tuttavia, è tecnicamente difficile da identificare e tracciare anastatica cellule in vivo, perché le cellule che ha recuperato dal processo di morte cellulare appaiono morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali, e non c'è nessun biomarcatore dell'anastasis identificato ancora17,18,21. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un nuova in vivo caspase biosensore indicato "CaspaseTracker"19, per identificare e tenere traccia di cellule che sopravvivono apoptosi dopo19,l'attivazione di caspase46, il segno distintivo di apoptosi10,14. Distinguendola dai biosensori di caspasi "tempo reale" come SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 che rileva l'attività della caspasi in corso, il biosensore CaspaseTracker inoltre offre la possibilità per marcare permanentemente le cellule che attività di caspase espressa anche transitoriamente. Pertanto, il biosensore CaspaseTracker consente la registrazione a lungo termine dell'anastasis dopo inversione di caspase-mediata delle cellule morte processo in vivo.

<table><tbody><tr><td>MATERIALI DI CONSUMO E REAGENTI</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Prodotti vettoriali</td><td>H-1000</td><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento</td></tr><tr><td>Vectashield (con DAPI)</td><td>Prodotti vettoriali</td><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>H-1200</td> con pinza DAPI</tr><tr><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td></td><td>Dumont pinzetta grado biologico, in acciaio inox</td></tr><tr><td>Slitte a goccia sospese Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-565B</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sonde molecolari</td><td>H1399</td><td>Colorazione del DNA</td></tr><tr><td>Mitotracker Rosso CMXRos&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>M-7512</td><td>Colorazione dei mitocondri</td></tr><tr><td>Caspasi scissa-3 (Asp175) anticorpo</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#9661</td><td>Colorazione per frammento attivo di caspasi-3</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Agente bloccante per immunocolorazione</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Terreno per lavaggio e immunocolorazione</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergente per permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Carl Zeiss Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Dissezione Drosophila</td></tr><tr><td>AmScope Illuminatore per microscopio a doppio collo d'oca in fibra ottica, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>sorgente luminosa</td></tr></tbody></table>

rilevazione di anastasis in vivo di biosensore caspasetracker

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (dal greco "risurrezione alla vita") è un fenomeno di recupero cellulare recentemente scoperto per cui morire cellule può invertire i processi di morte delle cellule della fase tardiva che sono presupposti generalmente per essere intrinsecamente irreversibili. Promozione anastasis potrebbe in principio salvataggio o preservare ferito le cellule che sono difficili da sostituire come cardiomiociti o neuroni, facilitando così il recupero dei tessuti. Al contrario, sopprimendo anastasis in cellule tumorali, che subiscono gli apoptosi dopo terapie anti-cancro, può garantire la morte della cellula tumorale e ridurre le probabilità di recidiva. Tuttavia, questi studi sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti per il monitoraggio il destino delle cellule che subiscono anastasis in animali vivi. La sfida consiste nell'identificare le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare nonostante il loro aspetto morfologicamente normale dopo il recupero. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato in Drosophila e sistemi di biosensore CaspaseTracker mammiferi che possono identificare e tracciare definitivamente anastatica cellule in vitro o in vivo. Qui, presentiamo in vivo protocolli per la generazione e l'utilizzo del sistema dual biosensore CaspaseTracker per rilevare e tenere traccia di anastasis in Drosophila melanogaster dopo esposizione transitoria agli stimoli di morte delle cellule. Mentre convenzionale biosensori e protocolli possono marcare le cellule attivamente che subisce la morte apoptotica delle cellule, il biosensore CaspaseTracker permanentemente può marcare le cellule che hanno recuperato dopo l'attivazione di caspase - un marchio di garanzia dell'apoptosi in fase avanzata, e contemporaneamente identificare processi apoptotici attivo. Questo biosensore può anche monitorare il recupero delle cellule che hanno tentato di altre forme di morte delle cellule che direttamente o indirettamente interessate attività di caspase. Di conseguenza, questo protocollo permette di monitorare continuamente il destino di queste cellule e la loro progenie, facilitando gli studi futuri delle funzioni biologiche, meccanismi molecolari, le conseguenze fisiologiche e patologiche e implicazioni terapeutiche di Anastasis. Inoltre discutiamo i controlli appropriati per distinguere le cellule che subiscono anastasis da quelle che visualizzano non apoptotiche caspase attività in vivo.

Mentre la microscopia time-lapse cellula viva è un metodo affidabile per tratto anastasis in cellule coltivate20, è difficile da identificare le celle che sono stati sottoposti a anastasis in animali, perché le cellule recuperate appaiono morfologicamente indistinguibili da cellule sane normali che non hanno tentato la morte delle cellule. Ad esempio, le cellule umane del cancro cervicale HeLa visualizzare caratteristiche morfologiche di apoptosi1,<sup class="xre...

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare e tracciare l'inversione del processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi in animali vivi utilizzando Drosophila melanogaster come modello. In risposta allo stimolo di morte, le cellule subiscono una morte cellulare programmata come l'apoptosi, che è stata tradizionalmente considerata come una cascata irreversibile che porta alla morte cellulare. È interessante notare, tuttavia, che dopo la rimozione dello stimolo di morte, alcune cellule morenti possono invertire il processo di morte cellulare anche nella fase avanzata.Attraverso un fenomeno di recupero cellulare scoperto di recente chiamato anastasi. La microscopia su cellule vive mostra che le cellule morenti apoptotiche mostrano segni morfologici unici, come il blebbing della membrana plasmidica, la condensazione nucleare e il restringimento cellulare. In generale, ci si aspetta che queste cellule muoiano.Tuttavia, dopo aver lavato e incubato le cellule morenti con terreno fresco, esse subiscono un'anastasi, si riprendono e possono successivamente dividersi. È difficile rilevare e tracciare l'anastasi negli animali vivi perché le cellule recuperate po

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È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

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Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

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Scopri come rilevare l'anastasis in vivo con il biosensore CaspaseTracker utilizzando Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di tracciare il recupero cellulare dopo l'attivazione delle caspasi.

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

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