Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare e tracciare l'inversione del processo di morte cellulare dopo l'attivazione delle caspasi in animali vivi utilizzando Drosophila melanogaster come modello. In risposta allo stimolo di morte, le cellule subiscono una morte cellulare programmata come l'apoptosi, che è stata tradizionalmente considerata come una cascata irreversibile che porta alla morte cellulare. È interessante notare, tuttavia, che dopo la rimozione dello stimolo di morte, alcune cellule morenti possono invertire il processo di morte cellulare anche nella fase avanzata.

Attraverso un fenomeno di recupero cellulare scoperto di recente chiamato anastasi. La microscopia su cellule vive mostra che le cellule morenti apoptotiche mostrano segni morfologici unici, come il blebbing della membrana plasmidica, la condensazione nucleare e il restringimento cellulare. In generale, ci si aspetta che queste cellule muoiano.

Tuttavia, dopo aver lavato e incubato le cellule morenti con terreno fresco, esse subiscono un'anastasi, si riprendono e possono successivamente dividersi. È difficile rilevare e tracciare l'anastasi negli animali vivi perché le cellule recuperate possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane circostanti. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato il sistema di biosensori CaspaseTracker per i mammiferi per identificare e tracciare le cellule che invertono il processo di morte cellulare dopo l'esecuzione o l'attivazione della caspasi, il segno distintivo dell'apoptosi.

Questo sistema di biosensori è costituito da due componenti: il transattivatore attivabile della caspasi, rtTA, e il reporter di attività rtTA basato su Cre LoxP. Nelle cellule sane, senza attività della caspasi, rtTA è legato a un'ancora della membrana plasmatica attraverso il linker DEVD clivabile della caspasi. Poiché l'rtTA collegato non può traslocare dal citosol al nucleo, il reporter rtTA rimane inattivo.

Tuttavia, dopo l'attivazione in risposta all'induzione della morte cellulare, le caspasi scindono il linker DEVD, liberando l'rtTA per traslocare nel nucleo per attivare il reporter rtTA. Una volta nel nucleo, l'rtTA si lega all'elemento di risposta tet, o TRE, e innesca l'espressione transitoria della Cre ricombinasi, portando a un evento di ricombinazione irreversibile che rimuove la cassetta del codone di stop tra il promotore CAG e le sequenze codificanti per la proteina fluorescente rossa DsRed. Ciò si traduce in un'espressione permanente di DsRed, che funge da marcatore fluorescente permanente per le cellule che possono rimanere in vita dopo aver sperimentato l'attività delle caspasi, così come la loro progenie.

La microscopia confocale su cellule vive mostra che dopo l'induzione della morte cellulare transitoria, le cellule biosensore CaspaseTracker esprimono DsRed durante e dopo il loro recupero e, quindi, le distinguono dalle cellule non recuperate, indicate da frecce bianche, così come le cellule biosensore di controllo che non sono state esposte allo stimolo di morte cellulare. La morte cellulare programmata, come l'apoptosi, è generalmente considerata irreversibile perché viene eseguita da una distruzione cellulare dilagante e massiccia. Tuttavia, abbiamo scoperto che quella cellula morente può effettivamente riprendersi anche nella fase avanzata che è stata considerata come il punto di non ritorno, come dopo il rilascio di citocromo c, l'attivazione della caspasi-3, il danno al DNA, il blebbing della membrana plasmatica, il restringimento cellulare e la formazione di corpi apoptotici.

Abbiamo chiamato queste inversioni del processo di morte cellulare anastasis, che significa risorgere alla vita in greco. Utilizzando la microscopia su cellule vive, possiamo osservare l'anastasi nelle cellule in coltura. Tuttavia, è tecnicamente difficile osservare l'anastasi negli animali vivi perché la cellula morta recuperata può sembrare una normale cellula sana che non ha tentato affatto la morte cellulare.

Pertanto, abbiamo sviluppato un sistema di biosensori CaspaseTracker per rilevare e tracciare l'anastasi negli animali vivi. La versione Drosophila del sistema CaspaseTracker è un doppio biosensore costituito da due componenti: il fattore di trascrizione dell'uso attivabile dalla caspasi, GAL4, e il reporter di attività GAL4, noto come G-TRACE. Nelle cellule senza attività della caspasi, il fattore di trascrizione del lievito, GAL4, è legato a un dominio di ancoraggio della membrana plasmatica attraverso un linker DQVD clivabile dalla caspasi.

Dopo l'attivazione della caspasi, le caspasi attivate scindono il linker DQVD per rilasciare GAL4, che poi trasloca nel nucleo per attivare il reporter G-TRACE. Il GAL4 nucleare si lega alle specifiche sequenze di attivazione a monte, abbreviate UAS, per innescare l'espressione transitoria di RFP, che funge da reporter dell'attività della caspasi recente o attuale fino a quando la caspasi e l'attività di GAL4 non si fermano e la proteina RFP viene degradata. GAL4 innesca anche l'espressione della FLP ricombinasi, che porta a un evento di ricombinazione che rimuove la cassetta di arresto tra l'ubiquitina, abbreviato Ubi, promotore e le sequenze di rivestimento per la GFP a bersaglio nucleare.

Ciò si traduce in un'espressione permanente della GFP nucleare, che funge da marcatore permanente per le cellule che hanno sperimentato l'attività delle caspasi ma rimangono in vita così come la loro progenie. Pertanto, questo sistema è in grado di identificare le cellule con attività caspasica in corso o recente tramite il segnale RFP transitorio e l'attività caspasi passata con il segnale GFP permanente. Un biosensore di controllo ha la mutazione DQVA nel sito di scissione della caspasi, che è insensibile all'attività della caspasi.

Le mosche femmine vergini GAL4 sensibili alla caspasi sono state incrociate con giovani mosche maschi G-TRACE, o viceversa, per generare le mosche CaspaseTracker. Per testare la reversibilità del processo di morte cellulare dopo l'attivazione della caspasi, i moscerini vengono prima esposti a stress ambientali transitori che inducono la morte cellulare, come lo shock da freddo o la carenza di proteine. Quindi le mosche stressate vengono trasferite di nuovo alle normali condizioni di coltura per il recupero.

I tessuti sono stati ottenuti dalle camere delle uova nelle ovaie delle mosche di controllo, stressate o recuperate. I campioni sono stati sottoposti a microscopia confocale per rilevare i segnali fluorescenti del biosensore CaspaseTracker. Per iniziare, DQVD GAL4 anestetizzato e recentemente chiuso alla caspasi vola usando anidride carbonica e, con un pennello, trasferisce da 7 a 10 femmine vergini in una fiala di cibo fresco con una piccola cucchiaiata di pasta di lievito.

Accoppia le femmine con 7-10 giovani maschi reporter G-TRACE GAL4. Le mosche vergini appena chiuse mostrano il meconio verde scuro, indicato da frecce, che sono i resti del cibo larvale. Le mosche appena chiuse tendono ad essere più grandi delle mosche mature.

I maschi hanno un addome più scuro, indicato da cerchi, e tendono ad essere più piccoli delle femmine. Impostare la croce a 18 gradi Celsius per ridurre i segnali non specifici provenienti dal biosensore CaspaseTracker nella progenie, poiché l'attività di GAL4 aumenta con la temperatura. Ogni tre-sette giorni, sposta gli adulti in una nuova fiala con pasta di lievito fino a quando la loro produttività non diminuisce.

Quando la progenie è chiusa, collegare i moscerini con entrambi i transgeni di GAL4 sensibile alla caspasi e G-TRACE, che funzioneranno come i moscerini della progenie CaspaseTracker. Entrambe le inserzioni sono bilanciate da Curly-O. Quindi le mosche alate non ricci avranno entrambi i transgeni.

Per un controllo negativo, raccogliere la progenie del doppio transgene da un incrocio tra femmine DQVA GAL4 insensibili alla caspasi e maschi reporter G-TRACE GAL4 o viceversa. Dalle croci sperimentali, trasferire coorti di 10-20 mosche femmine appena chiuse in nuove fiale con pasta di lievito. L'aggiunta di alcuni maschi aiuterà le femmine per la produzione di uova.

Trasferisci le mosche ben nutrite a 18 gradi Celsius per un giorno in modo che le loro ovaie producano camere di uova attraverso l'OO-genesi. Quindi, per indurre le loro camere uovo a subire l'apoptosi, utilizzare uno shock freddo. Trasferisci le mosche in una nuova fiala senza cibo e congelale a 7 gradi Celsius per un'ora.

Un metodo alternativo per indurre l'apoptosi della camera delle uova consiste nell'utilizzare la carenza di proteine alloggiando le mosche su cibo con l'8% di saccarosio e l'1% di agar a 18 gradi Celsius per tre giorni. Cambia le fiale di cibo senza proteine ogni giorno quando usi questo metodo. Dopo aver stressato le mosche con entrambi i metodi, riportarle alla normale condizione di stabulazione e nutrirle con pasta di lievito per tre giorni per consentire loro di riprendersi.

Successivamente seziona queste mosche per isolare le loro camere delle uova e le ovaie. Dopo averli anestetizzati, usa due paia di pinze per rimuovere le loro teste. Quindi tirare le mosche alla base dell'addome per rimuovere le ovaie.

Preparati a raccogliere le ovaie rivestendo i puntali delle pipette di plastica con l'1% di BSA sciolto in acqua o PBS in modo che le camere delle uova non si attacchino ai puntali delle pipette. Dopo aver sezionato le camere delle uova, raccoglierle in punte preparate con circa mezzo millilitro di PBS. Quindi trasferiscili in una provetta da centrifuga da un millilitro e lascia che le uova si depositino.

Continuare la procedura in condizioni di scarsa illuminazione o completamente buio per evitare lo sbiancamento fotografico dei tag fluorescenti. Aspirare il PBS e caricare 500 microlitri di paraformaldeide al quattro percento nel PBS nella provetta da centrifuga. Lasciate riposare le uova per 20-30 minuti a temperatura ambiente con una leggera rotazione.

Evitare la fissazione prolungata, poiché esaurirà il segnale delle proteine fluorescenti nelle camere delle uova. Una volta fissato, rimuovere il PFA e lavare le camere delle uova con 500 microlitri di PBS-T per tre volte. Quindi incubare le camere delle uova con PBS-T durante la notte a 4 gradi Celsius con una rotazione delicata per permeabilizzare le camere delle uova.

La mattina dopo, aggiungere 500 microlitri di PBS-T con 5 microgrammi di colorante nucleare blu, come Hoechst, alle camere delle uova. Lasciali incubare con una leggera rotazione a temperatura ambiente per una o due ore, ma non di più, altrimenti i segnali diventeranno aspecifici. Quindi, lavare la camera delle uova con PBS-T tre volte per 10 minuti per lavaggio.

Quindi, utilizzando una pipetta fine, aspirare tutto il PBS-T e applicare 200 microlitri di agente di montaggio anti-sbiancante. I tessuti galleggiano sulla parte superiore prima di aver assorbito completamente l'agente di montaggio. Incubare la camera delle uova nell'agente a 4 gradi Celsius per tre ore o durante la notte.

Dopo aver assorbito completamente l'agente di montaggio, i tessuti affondano sul fondo dei tubi e sono pronti per essere montati. Per iniziare, applicare la vaselina sul vetrino o sul vetrino coprioggetti per evitare di distruggere le camere delle uova a causa di una compressione eccessiva. Per montare le camere delle uova colorate, trasferirle con 200 microlitri di agente di montaggio su un vetrino e coprirle con un vetrino di vetro da 20 millimetri quadrati.

Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto e procedere con la microscopia confocale. Nelle camere delle uova dell'ovaio nei moscerini sani CaspaseTracker non c'era attività del biosensore CaspaseTracker, indicata da una mancanza di fluorescenza verde e rossa. Tuttavia, dopo aver sottoposto i moscerini a stress ambientali che inducono la morte cellulare per tre giorni, come la carenza di proteine, le camere delle uova sono state sottoposte al processo di morte cellulare con attivazione della caspasi, che ha indotto i segnali dei biosensori RFP e GFP.

Al contrario, la mutazione del sito di scissione della caspasi nei moscerini DQVA insensibili alla caspasi di controllo ha abolito la sensibilità del biosensore, indicando che i segnali del biosensore dipendono dall'attività della caspasi. Poi ai moscerini biosensori affamati e sensibili alle caspasi è stato somministrato cibo proteico per tre giorni. Le camere delle uova delle mosche recuperate non esprimevano il reporter di caspasi transitorio RFP, indicando l'assenza di attività caspasica recente o in corso.

È importante sottolineare che le camere dell'uovo recuperate esprimevano solo GFP, indicando che avevano invertito il processo di morte cellulare dopo l'attivazione della caspasi. L'anastasi si osserva anche in vivo dopo stress termico transitorio che induce la morte cellulare. In risposta allo shock freddo, le camere dell'uovo morente esprimono i marcatori del biosensore RFP e GFP, che indicano l'attività delle caspasi recente o in corso, rappresentata dal segnale RFP, e l'attività passata delle caspasi, rappresentata dal segnale GFP.

Tuttavia, dopo aver alleviato lo stress tornando alle normali condizioni di coltura per tre giorni, le camere delle uova nei moscerini recuperati mostravano solo il reporter della caspasi GFP, indicando che le cellule in queste camere delle uova erano state sottoposte ad anastasi in un punto successivo all'attivazione della caspasi. In particolare, il segnale GFP CaspaseTracker rivela che diversi tipi di cellule all'interno delle camere delle uova sono in grado di invertire il processo di morte cellulare e riparare i danni causati dalle caspasi, comprese le cellule della linea germinale, come gli ovociti e le cellule nutrici, e le cellule follicolari somatiche. È interessante notare che la GFP ha anche marcato le cellule del germario, che contengono cellule staminali, insieme alle camere uovo associate nella stessa catena ovarica.

Pertanto, queste camere uovo GFP-positive potrebbero essere state derivate da cellule staminali sottoposte ad anastasi. Ecco le immagini che mostrano i tessuti che mostrano l'attività del biosensore CaspaseTracker senza esposizione a stress ambientale. Si tratta dell'apparato boccale, dell'intestino anteriore, del raccolto, dell'intestino medio, dell'intestino posteriore, dei tubuli malpighiani, dell'ano, dell'ovidotto e delle ovaie di una mosca femmina sezionata di recente e appena chiusa.

La microscopia confocale rivela l'attività recente delle caspasi, come indicato dalla RFP, e l'attività della caspasi passata, indicata dalla GFP. Le immagini ingrandite mostrano l'attività caspasica recente o in corso e passata nel lobo ottico, nel cardias, nei tubuli malpighiani, nell'intestino posteriore e nelle pareti muscolari delle camere delle uova che si sono co-localizzate con la colorazione con F-actina. Alcuni tessuti, come l'ovidotto, mostrano solo un'attività caspatica passata.

Queste attività dei biosensori suggeriscono una potenziale attività anestetica durante lo sviluppo embrionale o la normale omeostasi. Potrebbe anche indicare un'attività caspatica non apoptotica attuale o passata. Si prega di consultare il manoscritto per maggiori dettagli.

Il biosensore CaspaseTracker in vivo segnala specificamente l'attività delle caspasi poiché il CaspaseTracker insensibile con la sequenza DQVA non scissibile della caspasi non ha attività del biosensore. L'unico segnale qui è il segnale non specifico dell'autofluorescenza dai pigmenti, dalla cuticola e dai corpi adiposi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione generale di come possiamo utilizzare il sistema di biosensori CaspaseTracker per rilevare e tracciare l'anastasi negli animali vivi.

Questi biosensori possono facilitare lo studio della valuta e della funzione nota dell'anastasi. La loro identificazione della portata ha una vasta gamma di applicazioni fisiologiche, patologiche e terapeutiche. Mentre questi biosensori possono rilevare l'inversione dell'apoptosi dopo l'attivazione della caspasi, possono anche rilevare il recupero delle cellule dopo che tentano altre forme di morte cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente le attività della caspasi.

Quando si progetta un esperimento, è molto importante includere controlli reciproci per distinguere il segnale del biosensore fluorescente che traccia le cellule anestetiche dalle cellule morenti con attività caspasiche in corso. Le cellule sane con l'attuale o passata attività della caspasi apoptotica nota e il segnale di autofluorescenza non specifico dal pigmento, grasso e critico. La discussione dettagliata è disponibile nella versione PDF di questo manoscritto.