Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

L'obiettivo generale della seguente procedura è valutare l'abilità invasiva delle cellule tumorali mediante un saggio di invasione tridimensionale. Questo viene ottenuto coltivando innanzitutto le cellule tumorali in una matrice della membrana basale. L'invasione cellulare della matrice viene quindi osservata per cinque o più giorni mediante microscopia ottica.

Nell'ultimo passaggio, le cellule vengono marcate con anticorpi fluorescenti per la localizzazione delle proteine di interesse. In definitiva, la velocità di invasione delle cellule tumorali e i conseguenti cambiamenti nell'espressione proteica possono essere analizzati mediante microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il saggio di invasione con camera Transwell, è che il saggio di invasione in gel tridimensionale riproduce meglio l'ambiente in vivo in cui il tumore cresce.

L'implicazione di questa tecnica riguarda la terapia del cancro, in cui possono essere identificate nuove proteine nello studio, coinvolte nell'invasione e nella metastasi tumorale. Prima di iniziare la procedura di coltura, posizionare la matrice della membrana basale, una pipetta P200 e le punte della pipetta sul ghiaccio durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare la punta della pipetta da 200 microlitri fredda di ghiaccio per distribuire 50 microlitri della matrice in un modello a spirale sul fondo di una piastra per microscopia confocale con fondo in vetro numero uno.

Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 30 minuti mentre la matrice subisce la solidificazione. Aggiungere la tripsina, una piastra di cellule da 100 millimetri con confluenza del 70-80%, una volta che le cellule hanno iniziato a staccarsi. Inattivare la tripsina con 10 millilitri di mezzo, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule per tre minuti a 100 G e 4 gradi Celsius mentre le cellule si sedimentano.

Aliquotare 50 microlitri di matrice in un tubo microcentrifugetto da un millilitro per ogni piastra di matrice della membrana basale, e posizionare i tubi sul ghiaccio quando le cellule hanno terminato la centrifugazione. Aspirare il soprannatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere. Sospendere le cellule in un millilitro di terreno e procedere quindi al loro conteggio.

Trasferire 2,5 volte 10 alla quarta cellule in un nuovo tubo da microcentrifuga, portando a volume finale di 50 microlitri il sospensione cellulare con mezzo. Quindi aggiungere 50 microlitri di matrice della membrana basale ghiacciata alle cellule in rapporto uno a uno, ottenendo un volume finale di 100 microlitri. Piastrare delicatamente la miscela matrice-cellule sulla matrice della membrana basale solidificata e lasciare che le cellule si incorporino nella matrice all'interno dell'incubatore per colture cellulari.

Dopo 30 minuti, coprire la matrice con due millilitri di mezzo e reinserire la piastra nell'incubatore, sostituendo il mezzo ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento. Utilizzare l'obiettivo 10 x di un microscopio ottico una volta al giorno per tutta la durata dell'esperimento per acquisire 20 immagini a contrasto di interferenza differenziale delle colonie sospese nella matrice della membrana basale. Analizzare le immagini in maniera cieca per determinare la formazione stellata delle colonie cellulari.

Una colonia è considerata stellata se si osservano una o più protrusioni rispetto al corpo centrale di cellule. Per esaminare le caratteristiche morfogeniche delle colonie in 3D, rimuovere le cellule dall'incubatore e posizionarle su un vassoio di ghiaccio. Aspirare il mezzo e quindi lavare la colonia tre volte con due millilitri di PBS freddo.

Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule in due millilitri di soluzione al 20% di acetone e 80% di metanolo per 20 minuti a quattro gradi Celsius, quindi riportare le piastre a temperatura ambiente. Una volta che la matrice della membrana basale ha raggiunto la temperatura ambiente, aspirare il fissativo e lavare la piastra tre volte con PBS come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, bloccare qualsiasi legame non specifico sulle cellule con due millilitri di BSA al 3% per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi incubare le cellule con gli anticorpi primari di interesse diluiti in BSA al 3% a temperatura ambiente. Dopo un'ora, rimuovere la soluzione di anticorpo primario lavando via l'anticorpo primario non legato con tre lavaggi in PBS, aggiungere l'anticorpo secondario disciolto in BSA al 3% alla diluizione appropriata e incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo aver rimosso l'anticorpo secondario non legato mediante lavaggi in PBS, colorare i nuclei delle cellule in due millilitri di hext 3,3'-dihexilcarbocianina in PBS per cinque minuti al buio.

Quindi lavare l'hext non legato dalle cellule cinque volte con PBS. Dopo la quinta lavata, aggiungere direttamente il mezzo di montaggio sulla miscela matrice-celle e coprire con attenzione il mezzo di montaggio con un'ampolla di vetro per evitare qualsiasi alterazione dell'integrità della matrice della membrana basale mista alle cellule. Lasciare asciugare la piastra tutta la notte a temperatura ambiente, quindi acquisire le immagini con un microscopio a fluorescenza alle lunghezze d'onda laser appropriate per gli anticorpi utilizzati in queste immagini.

Cellule MDA MB 2 3 1 che invadono una matrice 3D sono illustrate. Le cellule incorporate nella matrice al primo giorno hanno iniziato a formare strutture stellate invasive entro il terzo giorno. Entro il quinto giorno, si poteva osservare un'invasione completa della matrice.

Il numero di colonie stellate formate è stato quindi contato ed espresso come percentuale del numero totale di colonie invasive e non invasive per piastra. Inoltre, poiché le misurazioni sono state effettuate giornalmente per cinque giorni, il tasso di invasione è potuto essere valutato anche su queste immagini di immunofluorescenza. Colonie stellate invasive rappresentative di cellule MDA MB 2 3 1 che mostrano una perdita dell'integrità della membrana e una localizzazione diffusa della proteina della membrana basale laminina cinque sono mostrate in netto contrasto con quanto osservato nelle cellule di carcinoma mammario MDA MB 2 31.

La laminina cinque era localizzata in un livello intatto della membrana basale che racchiudeva l'epitelio delle cellule MCF 10 A non trattate e non maligne. Dopo questa procedura, si può effettuare una coltura congiunta con cellule stromali per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio se le cellule tumorali comunicano con le cellule stromali nel microambiente dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per studiare l'invasione e la migrazione tumorale, entrambe necessarie per la diffusione metastatica delle cellule cancerose.