Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

L'obiettivo generale della seguente procedura è valutare la capacità invasiva delle cellule tumorali utilizzando un test di invasione tridimensionale. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule tumorali in una matrice di membrana basale. L'invasione cellulare della matrice viene quindi osservata per cinque o più giorni tramite microscopia ottica.

Nella fase finale, le cellule vengono marcate con anticorpi fluorescenti per la localizzazione delle proteine di interesse. In definitiva, il tasso di invasione delle cellule tumorali e i conseguenti cambiamenti nell'espressione proteica possono essere analizzati mediante microscopia immunofluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il test di invasione della camera Transwell, è che il test 3D di invasione di gel maggiore imita meglio l'ambiente in vivo che il cancro risolve in crescita.

L'implicazione di questa tecnica è verso la terapia del cancro, dove possono essere identificate nuove proteine nello studio, che sono coinvolte nell'invasione e nelle metastasi del cancro. Prima di iniziare la procedura di coltura, posizionare la matrice della membrana basale una pipetta P 200 e i puntali delle pipette sul ghiaccio per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare la punta della pipetta ghiacciata da 200 microlitri per distribuire 50 microlitri di matrice a spirale sul fondo di un piatto confocale con fondo in vetro numero uno.

Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 30 minuti mentre la matrice è in fase di solidificazione degli occhi di tripsina, una piastra di cellule confluente dal 70 all'80% di 100 millimetri una volta che le cellule hanno iniziato a staccarsi. Inattivare la tripsina con 10 millilitri di terreno, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le celle per tre minuti a 100 Gs e quattro gradi Celsius mentre le celle girano verso il basso.

Aliquotare 50 microlitri di matrice in una provetta da microcentrifuga da un millilitro per piatto di matrice a membrana basale e posizionare le provette sul ghiaccio quando le cellule hanno finito di girare. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet, quindi risussare. Sospendi le cellule in un millilitro di terreno e contale successivamente.

Trasferire 2,5 volte 10 nelle quarte celle in una nuova provetta per microcentrifuga, completando la sospensione cellulare con il terreno fino a un volume finale di 50 microlitri. Quindi aggiungere i 50 microlitri di matrice di membrana basale ghiacciata alle cellule in un rapporto uno a uno per un volume finale di 100 microlitri. Placcare delicatamente la miscela matrice-cellula sulla matrice solidificata della membrana basale e lasciare che le cellule vengano incorporate nella matrice nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo 30 minuti, coprire la matrice con due millilitri di terreno e riposizionare il piatto nell'incubatrice, cambiando il terreno ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento, utilizzare l'obiettivo 10 x di un microscopio ottico una volta al giorno per tutta la durata dell'esperimento per prendere 20 interferenze differenziali. Immagini di contrasto delle colonie sospese nella matrice della membrana basale. Analizza le immagini alla cieca per determinare la formazione di stellati di colonie cellulari.

Una colonia è considerata stellata se si osservano una o più proiezioni dello steroide delle cellule. Per esaminare le caratteristiche morfogenetiche delle colonie 3D, rimuovere le cellule dall'incubatrice e posizionarle su una vaschetta di ghiaccio. Aspirare il terreno e poi lavare la colonia tre volte con due millilitri di PBS freddo.

Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule in due millilitri di soluzione di acetone al 20% e metanolo all'80% per 20 minuti a quattro gradi Celsius, quindi riportare le stoviglie a temperatura ambiente. Una volta che la matrice della membrana basale è a temperatura ambiente, aspirare il fissativo e lavare la piastra tre volte con PBS come appena dimostrato. Dopo il lavaggio finale, bloccare qualsiasi legame aspecifico sulle cellule con due millilitri di BSA al 3% per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi incubare le cellule negli anticorpi primari di interesse diluiti in BSA al 3% a temperatura ambiente. Dopo un'ora, rimuovere la soluzione dell'anticorpo primario dopo aver lavato via l'anticorpo primario non legato tre volte con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario disciolto in BSA al 3% alla diluizione appropriata e incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo aver lavato via l'anticorpo secondario non legato con PBS, colorare i nuclei delle cellule in due millilitri di ests 3, 3, 2, 5 8 in PBS per cinque minuti al buio.

Quindi lavare l'esto non legato dalle celle cinque volte con PBS. Dopo il quinto lavaggio, aggiungere il mezzo di montaggio direttamente sulla matrice alla miscela di celle e coprire accuratamente il mezzo di montaggio con un vetrino coprinte per evitare interruzioni dell'integrità della matrice della membrana basale con la miscela di cellule. Asciugare il piatto per una notte a temperatura ambiente, quindi acquisire le immagini con un microscopio fluorescente alle lunghezze d'onda laser appropriate per gli anticorpi utilizzati in queste immagini.

Vengono illustrate le celle MDA MB 2 3 1 che invadono una matrice 3D. Le cellule si sono incorporate nella matrice il primo giorno e hanno iniziato a formare strutture stellate invasive entro il terzo giorno. Entro il quinto giorno, si poteva osservare una completa invasione della matrice.

Il numero di colonie stellate formate è stato quindi contato ed espresso come percentuale del numero totale di colonie invasive e non invasive per piatto. Inoltre, poiché le misurazioni sono state completate giornalmente per cinque giorni, il tasso di invasione potrebbe essere valutato anche in queste immagini immunofluorescenti. Colonie stellate invasive rappresentative di cellule MDA MB 2 3 1 che mostrano una perdita di integrità della membrana e una localizzazione diffusa della proteina di membrana basale laminina cinque sono mostrate in netto contrasto con ciò che si osserva nelle cellule di carcinoma mammario MDA MB 2 31.

La laminina cinque è stata localizzata in uno strato di membrana basale intatto che racchiude l'asinina di memoria delle cellule MCF 10 A non maligne non trattate. Seguendo questa procedura, la co-coltura con le cellule stromali può essere eseguita per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se le cellule tumorali dialogano con le cellule stromali nel microambiente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'invasione e la migrazione del cancro, entrambe necessarie per la diffusione metastatica delle cellule tumorali.