Name: Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Impara a quantificare l'invasività delle cellule di cancro al seno utilizzando un modello tridimensionale con matrice di membrana basale. Questo metodo consente di analizzare l'invasione cellulare e le variazioni dell'espressione proteica.

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Questo lavoro è stato condotto con fondi a M.B. dalla sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) MOP 107972. M.B. ha ricevuto un premio CIHR New Investigator Salary Award. D.C. ha ricevuto borse di studio dall'Unità di Ricerca Traslazionale sul Cancro al Seno e dal Programma di Formazione Strategica CIHR in Ricerca sul Cancro e Trasferimento Tecnologico, London Regional Cancer Program. C.G. ha ricevuto borse di studio dall'Unità di Ricerca Traslazionale sul Cancro al Seno, London Regional Cancer Program e dal CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. Sgd.

1. Cultura tridimensionale delle cellule del cancro al seno in membrana basale Matrix (La Tecnica Embedment) <ol><li> Manipolazione Matrigel matrice della membrana basale: Scongelare su ghiaccio notte a 4 ° C. Matrice membrana basale è liquido a bassa temperatura ma solidifica a temperatura ambiente. Mantenere matrice membrana basale su ghiaccio (Figure 1A-B). </li><li> Coprire il piatto confocale No.1 fondo di vetro con 50 ml di matrice membrana basale mediante diffusione della matrice usando la punta di un Pipetman P-200 in un modello a spirale (Figura 1C). Prestare attenzione quando la diffusione della matrice membrana basale per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Allo stesso modo, evitare di diffondere la matrice di chiudere i confini del piatto fondo di vetro per evitare la formazione di menisco. Se matrice membrana movimentazione inesperto scantinato, poi preraffreddato il piatto, P-200 Pipetman e pipette può essere di ghiaccio (in alternativa lasciato una notte in frigorifero a 4 ° C). Questo passo offertetempo supplementare per diffondere la matrice membrana basale prima della solidificazione. Porre la capsula (es) in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) per almeno 30 minuti per consentire la matrice membrana basale a solidificare (Figura 1D). </li><li> Mentre la matrice è in fase di solidificazione, trypsinize un confluente 100 mm piastra 70-80% delle cellule. Una volta che le cellule hanno iniziato sollevamento fuori della piastra, risospendere in 10 ml di terreno RPMI 1640 contenente il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), per inattivare la tripsina (Figura 1E). Poi il trasferimento delle cellule risospese in un tubo da 15 ml (Figura 1F). </li><li> Spin le cellule (presenti nel tubo conico) a 100 xg per 3 minuti in una coltura cellulare centrifuga dedicato (Figure 1G-H). </li><li> Mentre le cellule vengono centrifugati, un&#39;aliquota di 50 ml di matrice in una provetta 1 ml (nota: ogni piatto fondo di vetro viene allocata una provetta, di conseguenza, sel&#39;esperimento richiede 3 piatti, ne consegue che 3 provette da microcentrifuga sono necessari pure), e quindi la provetta in ghiaccio (Figura 1B). </li><li> Aspirare il mezzo dal tubo conico dal punto 1.4, pur lasciando il pellet indisturbato (Figura 1I). Risospendere le cellule (che sono stati filati in giù) in 1 ml di FBS-integrato RPMI (Figura 1J). </li><li> Una volta che le cellule sono contate con un emocitometro (Figura 1K), o un contatore di un&#39;aliquota particella cella 2,5 x 10 4 cellule in provetta e ciliegina sulla torta con opportuno supporto in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri (Figura 1L). </li><li> Mescolare le cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 microlitri (Figura 1M). </li><li> Piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 1.8 sulla sPiatto olidified membrana basale matrice rivestita dal punto 1.2 (Figura 1N). Questo permette alle cellule di essere incorporati in matrice membrana basale. </li><li> Trasferire il piatto (es) nell&#39;incubatore coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) e lasciare la matrice: miscela di cellule solidificare per almeno 30 min. </li><li> Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di media RPMI FBS-integrate per il piatto (Figura 1O) e prendere il piatto indietro l&#39;incubatrice dove verrà conservato per il resto dell&#39;esperimento (Figura 1P). </li><li> Cambiare media ogni giorno per un periodo di 5 giorni (o secondo la richiesta per un saggio, la durata del saggio per MDA-MB-231 cellule è di 5 giorni di lunghezza). </li><li> Utilizzando un microscopio ottico, prendere contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini delle MDA-MB-231 colonie sospese in matrice membrana basale (Figura 3A). Immagine 20 aree rappresentative a 10 volte più fine, una volta al giornoper cinque giorni per determinare colonia morfogenesi (Figura 3C). </li><li> Analizzare le immagini ciecamente per determinare colonia di cellule stellate formazione (Figura 3B). Una colonia è considerata stellate se una o più sporgenze dal sferoide di cellule sono percepiti. Per determinare la percentuale di colonie stellate invasive, dividere il numero di colonie stellate per il numero totale di colonie di cellule per immagine acquisita, e poi la media delle colonie stellate percentuali delle 20 immagini per ogni giorno. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Cultura tridimensionale di MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in matrice membrana basale (la tecnica incastro). AB) Uno schema del setup sperimentale (eseguita nella cappa). C) Il pozzo del piatto fondo di vetro rivestitocon 50 ml di matrice membrana basale. D) Lavastoviglie (es) posto in un incubatore di coltura cellulare (a 37 ° C con 5% CO 2) per consentire la matrice a solidificare per almeno 30 min. state tripsinizzate E) Cellule. F ) Le cellule sono state risospese in una provetta conica da 15 ml. GH) Cells (presenti nel tubo conico) sono stati centrifugati a 100 xg per 3 minuti in un tessuto cultura centrifuga. I) pellet. J) Cells (che sono stati centrifugati) sono stati risospesi in 1 ml di FBS-integrata mezzo RPMI. K) Le cellule sono state contate con un emocitometro. L) 2,5 x 10 4 cellule aliquotati in provetta e condito con appropriati mezzi di comunicazione in modo da ottenere il volume totale di 50 microlitri. M ) Mescolare cellule dal punto 1.7 (25.000 cellule in 50 microlitri) con il tubo per microcentrifuga matrice contenente da passo 1,5 in rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 μ., L N) piastra delicatamente 100 ml di matrice: miscela di cellule dal punto 8 sul piatto matrice rivestite solidificato dal punto 1.2 O) Una volta che la matrice: miscela di cellule è solidificato, aggiungere 2 ml di mezzi di RPMI FBS-integrati a. il piatto. P) porre il recipiente in incubatrice dove sarà memorizzato per il resto dell&#39;esperimento. 2. Esame delle caratteristiche morfogenetiche delle Culture 3D con immunofluorescenza <ol><li> Impostare un vassoio di ghiaccio, fosfato freddo soluzione tamponata (PBS), 20% di acetone: 80% di metanolo (soluzione fissativo), e il 3% albumina sierica bovina (BSA, soluzione bloccante) (Figura 2A) prima di prendere il piatto (es) dall&#39;incubatore. </li><li> Porre la capsula (es) sul vassoio ghiaccio e aspirare media, poi lavare 3x con 2 ml di PBS freddo (Figura 2B). </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 20% acetone: soluzione di metanolo 80% nel piatto (es) (Figura 2C </strong&gt;) per fissare le cellule per 20 min a 4 ° C (sul ghiaccio, o in frigorifero) (Figura 2D). </li><li> Dopo il 20 min di fissazione è terminata, portare i piatti indietro a temperatura ambiente, aspirare il fissativo, e successivamente lavare 3x con PBS. Dopo l&#39;ultimo lavaggio PBS viene aspirato, aggiungere 2 ml di 3% BSA al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2E). </li><li> Durante il periodo di blocco preparare diluizioni di primaria (laminina V 1:100) e anticorpi secondari (ad una diluizione appropriata) disciolti in 3% di siero albumina bovina (BSA) tampone di bloccaggio. Si prega di notare che 400-500 microlitri della soluzione &#39;BSA anticorpo primario +&#39; deve essere aggiunto direttamente sulla matrice: miscela di cellule. </li><li> Una volta che il blocco di 30 min scaduta, aggiungere l&#39;anticorpo primario e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2F). Si prega di notare che non lavaggi PBS devono essere eseguiti seguendo la 30 min blockinperiodo di g. </li><li> Al termine della fase 2.6, rimuovere la soluzione &#39;BSA + primario di anticorpi&#39;, e lavare 3x con PBS. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo secondario disciolto in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) direttamente sulla matrice: miscela di cellule, coprire i piatti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (figura 2G). </li><li> Rimuovere la soluzione &#39;BSA + anticorpo secondario&#39;, e lavare 3x con PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di Hoechst 33258 (1:10.000) disciolti in PBS per nuclei colorazione, e incubare per 5 min sotto un foglio di alluminio (o coprire con un contenitore opaco per limitare fotoscolorimento) (Figura 2H). </li><li> Una volta che la 5 min di incubazione con Hoechst 33258t sono scaduti, lavare il piatto (es) 5x con PBS. </li><li> Aggiungere mezzo di montaggio direttamente sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e coprire con coprioggetto vetro con cautela per evitare indurre eventuali interruzioni per l&#39;integrità delle colonie nel matri membrana basalex: miscela di cellule (Figura 2I). </li><li> Lasciare il piatto (es) per asciugare tutta la notte (o 24 ore) a temperatura ambiente (Figura 2I). Una volta asciutto, il piatto (es) può essere conservato a -20 ° C, ma si raccomanda che essi dovrebbero essere ripreso al più presto. </li><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza con opportune lunghezze d&#39;onda laser di anticorpi utilizzati (Figure 3D-E). </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Esame delle culture 3D mediante immunofluorescenza. . A) Uno schema del setup sperimentale B) Dish (es) posto sulla vaschetta del ghiaccio e dei media aspirato; Successivamente le cellule sono state lavate tre volte con 2 ml di PBS freddo C) 2 ml di 20% acetone:. soluzione di metanolo 80% aggiunto nel piatto (es) D) Fissare le cellule per.20 min a 4 ° C (sul ghiaccio, o in frigorifero). E) 2 ml di 3% BSA aggiunto al piatto (es) per bloccare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. F) Una volta che il 30 min di blocco sono scaduti, aggiungere gli anticorpi primari e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente G) anticorpi secondari disciolti in 3% BSA (ad una diluizione appropriata) sono stati aggiunti direttamente sulla matrice membrana basale:. miscela di cellule; . successivamente piatti coperti e incubate per 1 ora a temperatura ambiente H) 2 ml di Hoechst (1:10.000; disciolto in PBS) aggiunto alla dishe (i) e le cellule incubate per 5 minuti sotto un foglio di alluminio I) Soluzione di montaggio aggiunto direttamente. sulla matrice: miscela di cellule nel piatto confocale e il piatto è coperto con vetrino coprioggetti. Lavastoviglie (es) essicca per una notte (o 24 ore) a temperatura ambiente.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Lo sviluppo delle tecniche di coltura cellulare 3D ha permesso ai ricercatori di studiare la trasformazione di cellule epiteliali mammarie, che ci permette di visualizzare i drammatici cambiamenti morfologici. Oltre ad analizzare invasione cellulare, sferoidi epiteliali mammarie singole o multicellulari possono essere usate per valutare i cambiamenti nella adesione cellulare, la proliferazione, la dimensione e basale-apicale polarità. In contrasto con metodologie precedentemente riportati in cui le cellule vengono sovra...

Migrazione e l&#39;invasione delle cellule individuali o collettivi sono due caratteristiche di cancro, e necessari per la diffusione metastatica delle cellule tumorali 1-4. La capacità delle cellule di cancro di avviare metastasi dipende dalla loro capacità di migrare e invadere nel tessuto limitrofo utilizzando invadopodia a degradare la membrana basale delle cellule. Invadopodia sono sporgenze degradazione matrice ricca di actina dinamiche che consentono la degradazione della matrice extracellulare attraverso il rilascio di proteasi matrice degradazione 5. Invasione cellula tumorale attraverso la degradazione della matrice e la migrazione delle cellule tumorali e questo è accompagnato da una riorganizzazione dell&#39;ambiente matrice tridimensionale (3D) 2. Così, per penetrare attraverso la matrice, una cella deve trasformare la sua forma e interagire con la matrice extracellulare (ECM) 2. Il mantenimento dell&#39;integrità del tessuto mammario dipende strettamente controlled architettura tissutale da giunzioni cellula-ECM e cellula-cellula adesione influenzano l&#39;espressione genica e la rottura della polarità epiteliale può provocare l&#39;insorgenza del cancro 6-10. Tuttavia, la maggior vitro migrazione e l&#39;invasione test in quali transwell saggi camera o saggi ferita-graffio sono bidimensionali (2D) e quindi queste trascurano le interazioni complesse tra le cellule e il loro ambiente adiacente 3,6,8,11-14. Diversità morfologiche e funzionali significativi, in particolare le variazioni di morfologia cellulare, differenziazione cellulare, adesioni cellula-matrice e modelli di espressione genica sono stati rilevati da coltura di cellule in colture 3D che sono comunemente carenti in 2D saggi 2,6,8,11. Così, utilizza delle analisi 3D sono significativamente utile ricapitolare in un più fisiologico in condizioni vivo, portando ad una migliore definizione di risultati innovativi nella ricerca di base alla clinica 6-10. Tuttavia, va notato, Nonostante i numerosi vantaggi ottenuti con l&#39;uso di colture 3D, questo modello non può catturare tutte le complessità del microambiente tumorale in vivo che comprende vari tipi di cellule. Tuttavia, è possibile incorporare cellule stromali nei modelli 3D (ad esempio, fibroblasti, leucociti e macrofagi) studiare l&#39;effetto delle interazioni tumore stromale sull&#39;adesione cellula tumorale e invasione 15-17. Cellule epiteliali mammarie in coltura crescono in modo più efficace quando le proteine ​​ECM come laminina e collagene sono presenti. Con questa nota, una miscela di matrice disponibile in commercio è stata derivata da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumore murino ed è noto come matrice della membrana Matrigel seminterrato 2,8. Un certo numero di tecniche sono state stabilite a crescere cellule epiteliali come colonie 3D a matrice membrana basale 2,8. Il piano seminterrato modello a matrice membrana 3D è efficace per stabilire delle cellule del seno sia maligno e non malignocrescita, simile a quello che sta succedendo nell&#39;ambiente in vivo 18,19. Cellule MCF10A sono cellule epiteliali mammarie non maligne. Quando coltivate in matrice membrana basale, queste cellule mostra a tratti vivo delle cellule normali del seno e sottoporsi controllata la proliferazione cellulare, la polarizzazione delle cellule, apoptosi e per stabilire lo spazio lume 8,12,20. Inoltre, la comparsa di nuclei di cellule di MCF10A formano acini in culture 3D avvicinano maggiormente a quelle delle cellule epiteliali mammarie in tessuto da quelle coltivate in monostrato 21. Gli studi di Bissell e colleghi sono stati i primi a rivelare che le cellule mammarie maligne possono essere differenziate da cellule della mammella non-maligne quando coltivate in un ambiente ricco di laminina, poiché le cellule maligne mostrano un fenotipo altamente disorganizzata, un aumento della proliferazione, diminuzione cellula- adesione cellulare, aumento dell&#39;espressione di marcatori mesenchimali e un aumento del numero di struttura invasiva formano 3,6,22. Anomalie del l&#39;ambiente cellulare possono influenzare la formazione del tumore 20. Il metodo di coltura 3D può essere usato per studiare efficacemente la comunicazione che avviene tra le cellule tumorali e l&#39;ambiente circostante e determinare come influenze espressione proteica tale 14,20,21,23 comunicazione. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per crescere MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in culture 3D per analizzare invasività, e per studiare la perdita di morfologia epiteliale utilizzando un marcatore epiteliale laminina, un componente della membrana basale cellulare 18,19,24, 25. Le procedure dettagliate consentono di quantificare con precisione e riproducibile stellato (invasive) formazione della struttura da qualsiasi cellula di cancro invasivo e non è limitante per le linee cellulari del cancro al seno comuni (come MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Pertanto, questo test può servire come piattaforma per valutare come espressione della proteina in cellule o trattamento con pro o anti-composti invasive regolano la degradazione della matrice extracellulare, da cellule singole o multiple.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>CA10011-700</td><td>Sterile,</td></tr><tr><td>monouso Piastra di coltura da 100 mm BD353003</td><td>VWR</td><td>CABD353003</td><td>Sterile, monouso</td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 15 ml</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>Sterile, monouso</td></tr><tr><td>1 ml Puntali filtrati</td><td>VWR</td><td>10011-350</td><td>Sterile, monouso</td></tr><tr><td>200 &#956; l puntali filtrati</td><td>VWR</td><td>22234-016</td><td>Sterili, monouso</td></tr><tr><td>20 &#956; l puntali filtrati</td><td>VWR</td><td>22234-008</td><td>Piastre di</td></tr><tr><td>coltura confocali n. 1 sterili monouso da 35 mm con fondo di vetro&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Preraffreddato prima dell'uso</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB003.100</td><td>Utilizzato al 3% per IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, altamente adsorbito</td><td>in modo incrociato Life Technologies</td><td>&nbsp; A11029</td><td>1:250 per IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 capra anti-coniglio IgG (H + L) anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A11011</td><td>1:1.200 per IF</td></tr><tr><td>Anti-Beta-catenina&nbsp;</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610153</td><td>monoclonale di topo; Utilizzato a 1:100 per IF</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>Utilizzato al 10% (v/v)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33258, pentaidrato (bis-benzimide) - 10 mg&frasl; ml di soluzione in Water</td><td>Life Technologies</td><td>H3569</td><td>utilizzato allo 0,1% (diluizione 1:10.000)</td></tr><tr><td>InVivo Analyzer Suite&nbsp;</td><td>Cibernetica</td><td></td> dei media <td>utilizzata per l'imaging di colture 3D (immagini DIC a 10X e 40X)</td></tr><tr><td>Kisspeptina-10 (KP-10)</td><td>EZ Biolabs</td><td>PT0512100601</td><td>utilizzata a 100 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-laminina&nbsp;</td><td>Cedarlane</td><td>AB19012(CH)</td><td>Coniglio-policlonale a figura intera umano; Utilizzato in scala 1:100 per</td></tr><tr><td>il microscopio a scansione laser IF LSM-510 META&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Utilizzato con obiettivo 63X; lente ad immersione in olio</td></tr><tr><td>Matrigel senza rosso fenolo (BD356237)</td><td>VWR</td><td>CACB356237</td><td>&nbsp; Lotto n.2180819; </td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX-81</td> da 10,4 mg/ml&nbsp;<td>Olympus</td><td></td><td>Utilizzato per l'imaging di colture 3D (immagini DIC a 10X e 40X)</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Antibiotico (aggiunto al terreno; utilizzato allo 0,01%)</td></tr><tr><td>Pipetta da 10 ml</td><td>VWR</td><td>CA53300-523</td> Terreno RPMI 1640 <td>sterile e monouso</td></tr><tr><td>con Glutammine</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule</td></tr> <tr><td>MDA-MB-2310,25% Tripsina-EDTA (1x), Rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td>Utilizzato per tripsinizzare le cellule MDA-MB-231</td></tr><tr><td>MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Quotazioni singole (CC4136)</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>Utilizzato per la coltura di cellule MCF10A</td></tr></tbody></table>

quantificazione del cancro al seno cellula invasività utilizzando una tridimensionale (3d) modello

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

È ormai noto che il microambiente cellulare e tissutale sono regolatori critici che influenzano iniziazione e la progressione tumorale. Inoltre, la matrice extracellulare (ECM) è stato dimostrato per essere un regolatore critico del comportamento delle cellule in coltura e omeostasi in vivo. L&#39;attuale approccio di coltura di cellule in bidimensionale (2D), superfici plastiche risultati del disturbo e perdita di complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente. Attraverso l&#39;uso di tridimensionale (3D) saggi di coltura, sono stabilite le condizioni per l&#39;interazione cellula-microambiente simile microambiente in vivo. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per far crescere le cellule del cancro al seno in una matrice 3D di proteine ​​della membrana basale, esemplificando il potenziale della cultura 3D nella valutazione di invasione delle cellule nell&#39;ambiente circostante. Inoltre, si discuterà di come questi test 3D hanno il potenziale per esaminare la perdita di segnalare molecduli che regolano la morfologia epiteliale da immunoistochimica procedure. Questi studi aiutano a identificare importanti dettagli meccanicistici nei processi che regolano l&#39;invasione, necessarie per la diffusione del cancro al seno.

Un esempio dei MDA-MB-231 cellule invasione nel matrice 3D è illustrato in Figura 3C. Le celle sono incorporate in una matrice (giorno 1), e cominciano a formare invasive (stellate) strutture dal giorno 3, e completamente invadono nella matrice da 5 ° giorno (Figura 3C). Il numero di colonie formate stellate sono contati, ed espresso come percentuale del numero totale di colonie per piastra (invasive e non invasive). Inoltre, poiché le misurazioni vengono effettuate giornalmente per cin...

Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l&#39;utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l&#39;invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell&#39;integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è valutare l'abilità invasiva delle cellule tumorali mediante un saggio di invasione tridimensionale. Questo viene ottenuto coltivando innanzitutto le cellule tumorali in una matrice della membrana basale. L'invasione cellulare della matrice viene quindi osservata per cinque o più giorni mediante microscopia ottica.Nell'ultimo passaggio, le cellule vengono marcate con anticorpi fluorescenti per la localizzazione delle proteine di interesse. In definitiva, la velocità di invasione delle cellule tumorali e i conseguenti cambiamenti nell'espressione proteica possono essere analizzati mediante microscopia a immunofluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il saggio di invasione con camera Transwell, è che il saggio di invasione in gel tridimensionale riproduce meglio l'ambiente in vivo in cui il tumore cresce.L'implicazione di questa tecnica riguarda la terapia del cancro, in cui possono essere identificate nuove proteine nello studio, coinvolte nell'invasione e nella metastasi tumorale. Prima di iniziare la procedura di coltura, posizionare la matrice della membrana basale, una pipetta P2

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Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Modelli di invasione delle cellule tumorali in tre dimensioni della matrice extracellulare meglio riflettere...

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

Questo video fornisce una metodologia dettagliata per far crescere cellule di cancro al seno in una matrice proteica di membrana basale 3D, esemplificando il potenziale della coltura 3D nella valutazione dell'invasione cellulare nell'ambiente circostante.

Saggio della membrana basale di coltura 3D: coltura di cellule tumorali su matrice proteica della membrana basale 3D per studiare l'invasione cellulare

Fonte: Guyon, J., et al. Un modello sferoidale 3D per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)Il video dimostra la generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali. Gli sferoidi sono formati da cellule tumorali cerebrali umane e incorporati in una matrice di collagene. Le cellule tumorali alla periferia sferoidale adottano un fenotipo invasivo, secernendo proteasi per degradare il collagene e avanzando per invadere la matrice circostante.

Generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Dimostriamo un metodo per generare surrogati 3D del cancro al seno, che possono essere coltivati utilizzando un sistema di bioreattori di perfusione per fornire ossigeno e sostanze nutritive. Dopo la crescita, i surrogati vengono fissati e trasformati in paraffina per la valutazione dei parametri di interesse. Viene spiegata la valutazione di uno di questi parametri, la densità cellulare.

Preparazione e analisi di<em&gt; In Vitro</em&gt; Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

Impara a quantificare l'invasività delle cellule di cancro al seno utilizzando un modello tridimensionale con matrice di membrana basale. Questo metodo consente di analizzare l'invasione cellulare e le variazioni dell'espressione proteica.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

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