Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la cinetica delle proteine, delle interazioni proteiche e gli effetti allosterici di piccoli ligandi su tali interazioni utilizzando la interferometria a strato biologico, BLI. Questo viene ottenuto preparando una delle proteine con biotina specifica e immobilizzandola sulla superficie di biosensori rivestiti con streptavidina in parallelo.

Come secondo passaggio, alla proteina legata al sensore viene esposto un buffer contenente il suo partner di legame, e il legame viene misurato in tempo reale attraverso il suo effetto sull'interferenza ottica alla superficie del sensore. Successivamente, ciascun sensore viene trasferito in un buffer privo del partner di legame al fine di misurare in tempo reale la dissociazione della proteina. Complessi proteici.

I risultati ottenuti permettono la determinazione delle costanti cinetiche di legame e dissociazione delle proteine interagenti e quindi la loro affinità di legame. Ulteriori risultati mostrano che la BLI può rilevare gli effetti di piccoli ligandi sulla velocità di dissociazione del complesso proteina-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la risonanza plasmonica di superficie, è che la BLI non è eccessivamente sensibile ai cambiamenti dell'indice di rifrazione.

Pertanto, i passaggi di legame e associazione possono includere variazioni di piccole molecole leganti per testarne gli effetti sulle interazioni proteina-proteina in tempo reale. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla cinetica delle interazioni proteina-proteina. Può essere applicato anche a diverse combinazioni, come il legame di una proteina al DNA o all'RNA immobilizzati, oppure il legame di un liposoma a una proteina immobilizzata. Iniziare questo esperimento configurando lo strumento BLI come descritto nel protocollo testuale.

Quindi configurare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare un nuovo esperimento di cinetica nella scheda della procedura guidata sperimentale. Verrà visualizzato un menu a schede con tutti i passaggi che devono essere definiti nella prima scheda.

Definire le colonne da utilizzare sulla piastra campioni a 96 pozzetti. Assegnare le colonne per contenere il tampone, la proteina da immobilizzare o il partner di legame.

Per ogni associazione, inseriremo la concentrazione del partner di legame da utilizzare. Nella seconda scheda, definire tutti i passaggi necessari per il saggio. Questi includono il caricamento della linea di base, l'associazione e la dissociazione del partner di legame.

I singoli passaggi del saggio sono collegati alle colonne di pozzetti sulla piastra del campione selezionando il passaggio del saggio e quindi facendo doppio clic sulla colonna corrispondente. Questo programma i sensori per essere spostati da una colonna di pozzetti alla successiva. Durante il saggio, iniziare con un breve passaggio di linea di base collegato alla prima colonna di pozzetti con tampone per saggio, al fine di stabilire i segnali BLI iniziali nella piastra a 96 pozzetti.

Quindi collegare il passaggio di caricamento ai pozzetti che conterranno la proteina biotinilata. Utilizzare la funzione di soglia per raggiungere un livello predeterminato di legame. Impostare l'opzione di soglia in modo che tutti i sensori vengano spostati nella colonna successiva di pozzetti.

Quando uno qualsiasi dei sensori raggiunge la soglia, includere un ulteriore passaggio di linea di base nel buffer per rimuovere le proteine biotinilate non immobilizzate dai sensori e stabilire nuovi segnali di linea di base stabili. Per saggi di base volti a determinare le costanti cinetiche globali di legame e dissociazione, includere un passaggio aggiuntivo di linea di base con i sensori in una nuova colonna di pozzetti contenenti buffer prima della fase di associazione. Successivamente, passare alla fase di associazione, spostando i sensori nella colonna di pozzetti che contiene concentrazioni variabili del partner di legame.

Regolare il tempo del passaggio in modo che almeno una concentrazione satura del partner di legame raggiunga il segnale di equilibrio di legame. Per il passaggio di dissociazione, impostare i sensori affinché tornino alla colonna quattro, alle stesse pozzette di tampone utilizzate per la linea di base aggiuntiva prima dell'associazione. I tempi dei passaggi di associazione e dissociazione possono essere modificati durante l'esperimento se le velocità risultano più lente o più rapide del previsto.

Nella scheda tre, indicare le posizioni nel vassoio del sensore che conterranno i sensori pre-umidificati per il saggio. La scheda quattro consente una revisione grafica del programma. Nella scheda cinque, inserire i dettagli necessari, inclusa la posizione dei file di dati e la temperatura desiderata.

Per l'esperimento. Inumidire preventivamente i sensori rivestiti con streptavidina per almeno 10 minuti. Per rimuovere il rivestimento protettivo di saccarosio, rimuovere il supporto contenente i sensori dal vassoio dei sensori e inserire una piastra a 96 pozzetti nella parte inferiore del vassoio, facendo scivolare un angolo della piastra nella tacca di orientamento presente sul vassoio.

Per la colonna di sensori da utilizzare, aggiungere 200 microlitri di tampone per il saggio per ogni pozzetto. In quella colonna della piastra a 96 pozzetti, reinserire il supporto dei sensori nel vassoio nell'orientamento corretto assegnato durante la programmazione; nel frattempo, riempire i pozzetti della piastra campione con il tampone per il saggio o con le opportune diluizioni della proteina. Evitare di introdurre bolle d'aria poiché possono generare rumore nel segnale ottico.

Includere uno o più pozzetti di riferimento che omettono la proteina biotinilata o il partner di legame. Aprire la porta dello strumento e osservare l'emissione luminosa dal braccio del sensore. Inserire il vassoio del sensore sulla piattaforma, inserendo le linguette del vassoio nelle fessure della piattaforma.

Inserire la piastra del campione nel supporto per piastre. Assicurarsi che la piastra sia posizionata correttamente e nel giusto orientamento, come indicato sul supporto. Chiudere lo sportello e avviare il saggio dal programma di acquisizione dati.

Se i sensori richiedono ancora un preriscaldamento, selezionare l'opzione per ritardare l'avvio dell'esperimento. Infine, una volta completata la preparazione di tutti i campioni e caricati sia la piastra dei campioni che il vassoio dei sensori nello strumento, fare clic sul pulsante vai per eseguire il saggio. Dopo l'esecuzione del saggio, aprire il software di analisi dati e caricare la cartella contenente i dati.

Fare clic sulla scheda di elaborazione per visualizzare un menu di elaborazione passo dopo passo e i dati cinetici grezzi, con ciascun sensore assegnato a un colore diverso nella selezione dei dati. Fare clic sul pulsante di selezione del sensore nella mappa della piastra del campione. Designare le pozzette per uno o due sensori di controllo come pozzette di riferimento nel menu di elaborazione.

Selezionare la casella di sottrazione e scegliere le pozzette di riferimento per sottrarre il segnale di riferimento da quello di tutti gli altri sensori. Allineare tutti i tracciati a Y uguale a zero utilizzando il passaggio di allineamento dell'asse Y. Quindi selezionare la linea di base come passaggio di allineamento per l'intervallo di tempo.

Inserire gli ultimi 10 secondi di quel valore iniziale. Facendo clic all'interno di questo passaggio del valore iniziale verrà mostrato l'allineamento. Successivamente, selezionare la casella di correzione tra i passaggi per minimizzare gli spostamenti del segnale tra i passaggi di associazione e dissociazione.

Selezionare una curva per il basale o la dissociazione. Nella maggior parte dei casi, selezionare la funzione di filtraggio KY gole e fare clic su "processa dati" per procedere; quindi ispezionare visivamente i dati finali nel pannello in basso a destra. Per analizzare i dati, fare clic sulla scheda analisi nell'analisi dati per il passaggio da analizzare, scegliendo associazione e dissociazione.

Per il modello, selezionare uno a uno per l'adattamento. Scegliere globale. Per il raggruppamento, selezionare il colore e r max non collegato al sensore per consentire un adattamento indipendente della risposta massima del segnale in seguito al legame saturo del partner alla proteina immobilizzata. Infine, fare clic su adatta curve per avviare l'analisi di regressione non lineare.

Esaminare i risultati dell'analisi, che includono il sovrapposizione delle curve di regressione ai tracciati dei dati del sensore, i grafici dei residui dell'analisi e una tabella con i valori dei parametri determinati e le statistiche. Qui vengono mostrate le cinetiche BLI in tempo reale di legame e dissociazione. Questo esperimento è stato avviato con un passaggio di linea di base della durata di 10 minuti poiché i sensori erano stati prerisciacquati brevemente; successivamente è stato caricato sui sensori l'epsilon biotinilato.

Nessuna dissociazione rilevabile di epsilon si è verificata durante tutti i passaggi rimanenti, come evidenziato dalla curva di riferimento, alla quale non era stato aggiunto alcun partner di legame. Un secondo sensore di riferimento era privo di proteina mobilizzata e mostrava un basso legame non specifico del partner di legame. Diverse concentrazioni di F1 meno epsilon sono state utilizzate nel passaggio di associazione per i sensori da A a F al fine di adattare i risultati globalmente e ottenere i migliori valori per la costante di velocità di associazione e la costante di dissociazione all'equilibrio KD; i risultati sono stati elaborati, producendo le tracce di dati in blu.

In questo caso, la traccia del sensore di riferimento è stata sottratta dalle tracce del campione per correggere il legame non specifico del partner di legame e la deriva del segnale del sistema. Nella fase di analisi dei dati, tutte le curve sono state adattate globalmente con un modello uno a uno. L'adattamento globale presuppone la completa dissociazione del partner di legame.

Viene mostrato qui un esperimento diverso in cui l'enzima era legato all'epsilon immobilizzato sul sensore in presenza di un millimolare, A-T-P-A-D-T-A. Questo condizione predispone la maggior parte dei complessi F1-epsilon ad assumere la conformazione non inibitoria, che si dissocia facilmente. I sensori sono stati quindi spostati in pozzetti di dissociazione contenenti tampone per saggio con diversi ligandi. Questo dimostra gli effetti di diversi ligandi sulla conformazione dell'epsilon.

Ad esempio, l'esposizione a magnesio A GP e fosfato ha notevolmente rallentato la dissociazione netta, indicando che epsilon ha spostato la conformazione verso lo stato inibitorio fortemente legato. Quando si impostano per la prima volta saggi BLI, è importante includere controlli per verificare il legame non specifico della proteina ai sensori e se tale legame non specifico varia significativamente con le concentrazioni proteiche da utilizzare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare, programmare e analizzare saggi BLI per misurare la cinetica delle interazioni proteina-proteina e apprezzare questo aspetto.

La BLI consente un test diretto degli effetti di piccoli ligandi sulle interazioni proteina-proteina.