Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura
18 febbraio 2014
I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare la cinetica delle proteine, le interazioni proteiche e gli effetti allosterici di piccoli ligandi su tali interazioni utilizzando l'interferometria a biostrato, BLI. Ciò si ottiene preparando una delle proteine con biotina specifica e immobilizzandola sulla superficie dello streptococco. Biosensori rivestiti di Aden in parallelo.
Come seconda fase, la proteina legata al sensore viene esposta a un tampone contenente il suo partner di legame e il legame viene misurato in tempo reale dal suo effetto sull'interferenza ottica sulla superficie del sensore. Successivamente, ogni sensore viene trasferito al tampone senza il partner di legame per misurare la dissociazione in tempo reale della proteina. Complessi proteici.
I risultati ottenuti consentono di determinare le costanti di velocità cinetica per il legame e la dissociazione delle proteine interagenti e quindi la loro affinità di legame. Ulteriori risultati mostrano che il BLI è in grado di rilevare gli effetti di piccoli ligandi sul tasso di dissociazione del complesso proteico-proteico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la risonanza al plasma di superficie, è che il BLI non è eccessivamente sensibile alle variazioni dell'indice di rifrazione.
Quindi le fasi di legame e associazione possono includere cambiamenti in piccoli ligandi per testare i loro effetti sulle interazioni proteina-proteina in tempo reale, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla cinetica dell'interazione proteina-proteina. Può anche essere applicato a diverse combinazioni, come il legame delle proteine al DNA o all'RNA immobilizzato o il legame dei liposomi a una proteina immobilizzata. Inizia questo esperimento configurando lo strumento BLI come descritto nel protocollo di testo.
Quindi impostare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare un nuovo esperimento di cinetica nella scheda della procedura guidata dell'esperimento. Questo presenta un menu a schede con tutti i passaggi che devono essere definiti nella prima scheda.
Definire le colonne da utilizzare. Sulla piastra di campionamento a 96 pozzetti. Assegna le colonne per contenere il tampone, la proteina da immobilizzare o il partner di legame.
Per ogni associazione, inserire bene la concentrazione del partner vincolante da utilizzare. Nella seconda scheda, definire tutti i passaggi necessari per il test. Questi includono l'associazione di carico basale e la dissociazione del partner di legame.
Le singole fasi del saggio sono collegate alle colonne dei pozzetti sulla piastra del campione selezionando la fase del saggio e quindi facendo doppio clic sulla rispettiva colonna. Questo programma i sensori in modo che vengano spostati da una colonna di pozzetti all'altra. Durante il saggio, iniziare con una breve fase di base collegata alla prima colonna di pozzetti con tampone di analisi per stabilire i segnali BLI iniziali nella piastra a 96 pozzetti.
Quindi collegare la fase di carico ai pozzetti che conterranno la proteina biotinilata. Utilizzare la funzione di soglia per ottenere un livello di associazione predeterminato. Impostare l'opzione di soglia in modo che tutti i sensori vengano spostati alla colonna di pozzetti successiva.
Quando uno qualsiasi dei sensori raggiunge la soglia, includere un altro passaggio di base nel tampone per lavare via le proteine biotinilate non immobilizzate dai sensori e stabilire nuovi segnali di base stabili per i saggi di base per determinare le costanti del tasso di legame e dissociazione globale. Passaggio successivo, collega l'associazione. Passare alla colonna di pozzetti che contengono concentrazioni variabili del partner di legame.
Regolare il tempo di passaggio in modo che almeno una concentrazione di saturazione del partner di legame raggiunga il segnale di legame di equilibrio. Per la fase di dissociazione, designare i sensori in modo che ritornino alla colonna quattro, gli stessi pozzetti tampone utilizzati per la linea di base aggiuntiva prima dell'associazione. I tempi per le fasi di associazione e dissociazione possono essere regolati durante l'esperimento se i tassi sono più lenti o più veloci del previsto.
Nella linguetta tre, indicare le posizioni nel vassoio del sensore che conterranno i sensori pre-bagnati per il test. La scheda quattro consente la revisione grafica del programma. Nella scheda cinque, inserisci i dettagli necessari, tra cui la posizione dei file di dati e la temperatura desiderata.
Per l'esperimento. Pre-bagnare i sensori rivestiti di streptavidina per almeno 10 minuti. Per rimuovere il rivestimento protettivo in saccarosio, rimuovere il rack contenente il sensore dal vassoio del sensore e inserire una piastra a 96 pozzetti nella parte inferiore del vassoio, facendo scorrere un angolo della piastra nella tacca di orientamento sul vassoio.
Per la colonna di sensori da utilizzare, aggiungere 200 microlitri di tampone per pozzetto. In quella colonna della piastra a 96 pozzetti, riportare il rack di sensori nel vassoio con l'orientamento corretto assegnato Durante la programmazione, riempire i pozzetti della piastra del campione con il tampone di saggio o le diluizioni proteiche appropriate. Evitare di introdurre bolle in quanto possono causare rumore nel segnale ottico.
Includere uno o più pozzetti di riferimento che omettono la proteina biotinilata o il partner di legame. Aprire lo sportello dello strumento e annotare l'emissione luminosa dal braccio del sensore. Inserire il vassoio del sensore sul tavolino con le linguette dei vassoi inserite nelle fessure del tavolino.
Inserire la piastra del campione nel supporto della piastra. Assicurarsi che la piastra sia posizionata in piano e con l'orientamento corretto come indicato sul portatarga. Chiudere lo sportello e avviare il test dal programma di acquisizione dati.
Se i sensori richiedono ancora la pre-bagnatura, selezionare l'opzione per ritardare l'avvio dell'esperimento. Infine, una volta completata la preparazione del campione e caricati sia la piastra del campione che il vassoio del sensore nello strumento, fare clic sul pulsante Vai per eseguire il saggio. Dopo l'esecuzione del test, aprire il software di analisi dei dati e caricare la cartella contenente i dati.
Fare clic sulla scheda di elaborazione per visualizzare un menu di elaborazione graduale e i dati cinetici grezzi con ciascun sensore assegnato a un colore diverso nella selezione dei dati. Fare clic sul pulsante di selezione del sensore sulla mappa della piastra campione. Designare i pozzetti per uno o due sensori di controllo come pozzetti di riferimento nel menu di elaborazione.
Selezionare la casella di sottrazione e selezionare i pozzetti di riferimento per sottrarre il segnale di riferimento da ogni altro segnale del sensore. Allinea tutte le tracce a Y uguale a zero utilizzando il passaggio di allineamento dell'asse y. Quindi selezionare la linea di base come passaggio di allineamento per l'intervallo di tempo.
Immettere gli ultimi 10 secondi della linea di base. Facendo clic all'interno di quel passaggio della linea di base verrà visualizzato l'allineamento. Quindi, selezionare la casella di correzione tra le fasi per ridurre al minimo gli spostamenti del segnale tra le fasi di associazione e dissociazione.
Selezionare una linea per la linea di base o la dissociazione. Selezionare la funzione di filtraggio KY gole nella maggior parte dei casi e fare clic su Dati processo per procedere con l'ispezione visiva dei dati di processo finali nel pannello in basso a destra. Per analizzare i dati, fare clic sulla scheda di analisi nell'analisi dei dati per il passaggio da analizzare, scegliere l'associazione e la dissociazione.
Per il modello, selezionare uno a uno per il montaggio Scegli globale. Per il gruppo in base al colore selezionato, selezionare r max scollegato dal sensore per consentire l'adattamento indipendente della risposta massima del segnale dopo la saturazione del legame del partner alla proteina immobilizzata. Infine, fare clic su Adatta curve per avviare l'analisi di regressione non lineare.
Esaminare i risultati dell'adattamento, che includono la sovrapposizione di curve di regressione con tracce di dati del sensore, grafici dei residui di adattamento e una tabella con valori di parametri e statistiche determinati. Qui viene mostrata la cinetica BLI di legame e dissociazione in tempo reale. Questo esperimento è stato avviato con una linea di base di 10 minuti poiché i sensori erano stati pre-bagnati, solo brevemente, l'epsilon biotinilato è stato poi caricato sui sensori.
Non si è verificata alcuna dissociazione rilevabile di epsilon durante tutti i passaggi rimanenti, come si vede dalla curva di riferimento, che non aveva alcun partner di legame aggiunto. Un secondo sensore di riferimento era privo di una proteina mobilizzata e mostrava un basso legame non specifico del partner di legame. Varie concentrazioni di F1 meno epsilon sono state utilizzate nella fase di associazione per i sensori da A a F al fine di adattare i risultati a livello globale e ottenere i migliori valori per la costante di tasso di associazione alla costante di tasso di associazione e la costante di dissociazione di equilibrio I risultati KD sono stati elaborati, producendo le tracce di dati blu.
In questo caso, la traccia del sensore di riferimento è stata sottratta dalle tracce del campione per correggere il legame non specifico del partner di legame e la deriva del segnale del sistema. Nella fase di analisi dei dati, tutte le curve sono state globalmente adattate con un modello uno a uno, uno a uno. L'adattamento globale presuppone la completa dissociazione del partner di legame.
Qui viene mostrato un esperimento diverso in cui l'enzima è stato legato a un epsilon immobilizzato con sensore in presenza di un millimolare, A-T-P-A-D-T-A. Ciò predispone la maggior parte dei complessi epsilon F1 ad assumere la conferma non inibitoria, che dissocia prontamente i sensori sono stati quindi spostati in pozzetti di dissociazione contenenti tampone di saggio con diversi ligandi. Ciò dimostra gli effetti di diversi ligandi sulla conferma di epsilon.
Ad esempio, l'esposizione al magnesio A GP e al fosfato ha rallentato drasticamente la dissociazione netta, indicando che l'epsilon ha spostato la conferma allo stato inibitorio strettamente legato. Quando si impostano per la prima volta i saggi BLI, è importante includere controlli per verificare il legame non specifico della proteina ai sensori e se il legame non specifico varia in modo significativo con le concentrazioni proteiche da utilizzare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare, programmare e analizzare i saggi BLI per misurare la cinetica delle interazioni proteina-proteina e apprezzarlo.
Il BLI consente un test diretto per gli effetti di piccoli ligandi sulle interazioni proteina-proteina.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per misurare le interazioni proteina-proteina utilizzando la spettroscopia di interferenza a strato sottile (BLI). L'attenzione è focalizzata sull'interazione tra l'ATP sintasi di tipo F e la sua subunità ε, che svolge un ruolo nel metabolismo energetico nei batteri.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Interazioni proteiche
Contesto
- L'ATP sintasi di tipo F è cruciale per la produzione di energia cellulare.
- La subunità ε può inibire l'attività dell'ATP sintasi.
- Comprendere queste interazioni è importante per avere informazioni sulla regolazione metabolica.
- La spettroscopia di interferenza a strato sottile permette la misurazione in tempo reale di queste interazioni.
Obiettivo dello studio
- Misurare la cinetica delle interazioni proteina-proteina.
- Indagare gli effetti allosterici di piccoli ligandi su queste interazioni.
- Adattare BLI per studiare il complesso catalitico dell'ATP sintasi.
Metodi utilizzati
- Preparazione di proteine con biotina per l'immobilizzazione.
- Utilizzo di biosensori rivestiti di streptavidina per gli assay di legame.
- Misura in tempo reale del legame e della dissociazione utilizzando l'interferenza ottica.
- Analisi dei complessi proteici formati durante l'interazione.
Principali risultati
- Misurazione di successo della cinetica di legame tra ATP sintasi e la sua subunità ε.
- Dati in tempo reale sulla dissociazione dei complessi proteici.
- Informazioni sulla regolazione allosterica dell'attività dell'ATP sintasi.
- Dimostrazione di BLI come strumento prezioso per studiare le interazioni proteiche.
Conclusioni
- BLI è efficace per studiare le interazioni proteina-proteina.
- L'interazione tra ATP sintasi e la sua subunità ε è critica per comprendere il controllo metabolico.
- Studi futuri possono basarsi su questi metodi per esplorare altre interazioni proteiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
