Name: Lanalisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Impara a monitorare l'assemblaggio dinamico di complessi proteici con interferometria a strato biologico, microscopia elettronica e spettrometria di massa. Questo metodo consente di studiare le transizioni strutturali indotte dal pH della tossina antrace.

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Questo lavoro è stato supportato dal Madison e Lila Self Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC Biomedical Research Training programma (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU Bridging fondi e la biomolecola interazione Technologies Center (BITC) Grant ( CT e MTF). Gli autori vorrei ringraziare Barbara Fegley a KUMC microscopia elettronica Core per assistenza con acquisizione di immagini di TEM.

1. assemblaggio di complessi macromolecolari definiti su superfici di biosensore interferometria Biolayer (BLI)
<ol><li>
Assemblea della tossina antrace prepore complessa su una superficie di biosensore reattiva per volta PDEA ammina
	<ol>
<li>Idrato di un'ammina reattiva secondo suggerimento di biosensore BLI generazione (AR2G) a 250 µ l di acqua per dieci minuti.</li>
		<li>Programmare tempi di passaggio, elencati nella tabella 1, il software di controllo dell'unità BLI (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Avviare la BLI esegue immergendo la punta di biosensore in 250 µ l acqua per 30 s per misurare una previsione iniziale di biosensore spessore e densità.</li>
		<li>Attivare il biosensore immergendo la punta in 250 µ l 50 NHS (N-Idrossisuccinimide) e 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) per 7 minuti.</li>
		<li>Immergere il biosensore attivato in 50mm PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) disciolto in tampone borato 0.1 M (pH 8.5) per 5 minuti per generare una superficie attivata tiolo-reattive.</li>
		<li>Immergere il biosensore tiolo-reattive attivato in 250 µ l di soluzione contenente 100 nM E126C LFN in 10 mM sodio acetato pH 5.0, NaCl 100 mM, buffer per 5 minuti.</li>
		<li>Immergere la punta di LFN in 50mm L-cisteina, 1 M di NaCl, acetato di sodio 0,1 M, pH 5.0, per 4 minuti, per placare i gruppi tiolo-reattive gratis reattivi rimanenti.</li>
		<li>Immergere la punta di LFN estiguuta in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 2 minuti per stabilire la linea di base di buffer.</li>
		<li>Immergere la punta di LFN estiguuta in prepore di 0,5 µM antigene protettivo (PAprepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 5 minuti per creare il LFN-PAprepore complesso.</li>
		<li>Una volta PAprepore è associato, rimuovere il puntale dalla soluzioneprepore PA e immergere la punta in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 30 secondi per lavare via qualsiasi non specifico associato PAprepore.</li>
		<li>Immergere il LFN-PAprepore complesso in ricevitore CMG2 a 0,5 µM (senza il dominio transmembrana), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, per 5 minuti.</li>
		<li>Immergere il LFN-PAprepore -CMG2 complesso in 50 mM Tris, 50 mM NaCl per 30 secondi per lavare via qualsiasi CMG2 non associato al modulo pre-endosomal complesso.</li>
		<li>Per l'analisi di EM, rilasciare il LFN-PAprepore-CMG2 complesso dalla punta biosensore immergendo la punta in 5 µ l di 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, all'interno di un tubo PCR.</li>
		<li>Per l'analisi di MS tandem dei peptidi dal complesso, rilasciare il LFN-PAprepore-CMG2 complesso dalla punta biosensore immergendo il biosensore in 5 µ l 50 mM DTT, 6m GuHCl (cheratina-free), 25 mM bicarbonato di ammonio a pH 8.0 all'interno di una PCR tubo . Questo viene eseguito su un biosensore diverso rispetto a quello utilizzato per l'analisi di EM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assemblea del poro tossina antrace complessa sulla superficie reattiva biosensore per volta PDEA ammina
	<ol>
<li>Per visualizzare il complesso dopo la transizione di pH, è necessario eseguire passaggi 1.1.1-1.1.12 nella sezione precedente per generare il LFN-PAprepore-CMG2 complesso.</li>
		<li>Immergere la punta del biosensore in un pH di acetato 10 mM 5.0 per 5 minuti per avviare la transizione della PAprepore alla transizionedel poro di PA. Questa transizione è indicata aumentando l'ampiezza (circa 0,2 nm) seguita da un declino di ampiezza più grande che è supposto per essere dissociazione completa o sostanziale del recettore causa di diminuita affinità di legame.</li>
		<li>Immergere la puntadel poro di LFN-PA in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, per 30 secondi lavare via tampone acide.</li>
		<li>Per l'esempio di analisi di EM, immergere la punta del biosensore in una soluzione contenente micelle 1,25 mM (2,5 mM MSP1D1, 25mm Na-colato, 162,5 mM POPC) per 5 minuti per impedire l'aggregazione in soluzione dopo la pubblicazione di bisolfuro.</li>
		<li>Per l'analisi di EM, rilasciare il LFN-PAporo -micella complesso dalla punta biosensore immergendo la punta in 5 µ l di 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl all'interno di un tubo PCR.</li>
		<li>Per analisi MS tandem dei peptidi dal complesso, rilasciare il LFN-PApoore complesse (nessun micella) da biosensore suggerimento immergendo il biosensore in 5 µ l 50 mM DTT, 6 M GuHCl (cheratina-free), 25 mM bicarbonato di ammonio a pH 8.0 all'interno di una PCR tubo. Questo viene eseguito su un biosensore diverso rispetto a quello utilizzato per l'analisi di EM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. visualizzazione e convalida rilasciato macromolecolari assembly da BLI biosensori mediante microscopia elettronica macchia negativa
<ol><li>Bagliore di scarico una griglia di Cu 300 rivestita di carbonio. Bagliore tipico scarico impostazioni sono 0,38 mBar atmosfera stabile pressione, negativo 15 MAMP, 20 secondi, quindi di ventilazione con aria.</li>
	<li>Griglia di sicuro tra un paio di pinzette pulite.</li>
	<li>4 µ l di campione complesso rilasciato in provetta PCR sulla griglia e consentire l'adsorbimento per 60s.</li>
	<li>Stoppino distanza rimanente liquido con un cuneo di carta da filtro.</li>
	<li>Macchia la griglia di pipettaggio 5 µ l di 0,75% 0,02 micron filtrata uranile formiato e wicking via macchia in eccesso dopo 5 secondi. Consentire la griglia ad asciugare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mostra griglie macchiato campione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.</li>
</ol>3. identificazione di completa Pre-endosomal antrace tossina complesse (LFN-Paprepore-CMG2) e spettrometria di massa utilizzando la transizione complessa (LFN-Paporo senza CMG2).
<ol><li>Diluire i campioni rilasciati a 20 µ l e incubare per 1 ora.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di 55mm iodoacetamide, bicarbonato di ammonio di 25 mM, pH 8.0 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente buio (coperto con carta stagnola).</li>
	<li>Diluire il campione con 100 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM, pH 8.0, per ridurre la concentrazione di cloridrato di guanidina sotto 1 M.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di sequenziamento della tripsina di grado per volta a 20 ng / µ l e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Aggiungere acido acetico glaciale a una concentrazione finale del 5% per ridurre il pH a < 3, allora ridurre il volume a 10 µ l in concentratore a vuoto.</li>
	<li>Trasferire la soluzione del peptide in piatto del campione sull'autocampionatore della nLC 1200 uHPLC.</li>
	<li>Caricare 5 µ l della soluzione di peptide su una colonna a fase inversa uHPLC montata sul palco ionizzazione del MS.</li>
	<li>Lavare la colonna con 15 µ l di acido formico 0.1% a una velocità massima di 5 µL/min e/o pressione massima di 800 psi.</li>
	<li>Eluire peptidi dalla colonna C18 controfase con una portata di 350 nL/min in un periodo di 90 min utilizzando un gradiente lineare del 5% al 40% di solvente B in A + B (acido formico di solvente a: 0,1%; solvente b: 95% acetonitrile con 0,1% di acido formico).</li>
	<li>Analizzare medicati peptidi on line utilizzando tandem MS.<ol>
<li>Impostare la sorgente di ionizzazione a 2500 volt e temperatura di trasferimento di ioni a 250 ° C.</li>
		<li>Lo spettrometro di massa sotto controllo automatico di eseguire continuamente una scansione di MS seguita da altrettanti tandem MSMS possibili in un periodo di 3 s, di operare utilizzando CID e un'energia di collisione normalizzato di 35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare i componenti di peptidi e proteine usando i metodi standard. Per questo lavoro, sono state eseguite due serie di analisi di peptidi e proteine.</li>
</ol>

<ol><li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li>
<li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS%3A+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li>
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<li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+anthrax+toxin+pore%3A+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li>
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<li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li>
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<li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li>
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<li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li>
<li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Tomography%3A+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li>
</ol>

Nessun informazioni integrative in questo momento.

Questa dimostrazione viene illustrato come formazione di complessi macromolecolare possa essere facilmente monitorata utilizzando biolayer interferometria, visualizzato usando EM e verificati con MS, tutte con microvolumi in un breve lasso di tempo. Montaggio strutturale e osservati complessi seguire le previsioni biologicamente rilevanti, ulteriore convalida questa metodologia combinata. Come accennato nella sezione risultati, l'elemento chiave per il successo di assemblaggio richiede mutagenesi di cisteina razionalmente progettati per assicurare che le interfacce di complessi proteina-proteina sono correttamente orientate dalla superficie del biosensore.
Sistemi precedenti hanno utilizzato tecniche di BLI e MS per valutare il legame proteico di sistemi a due e tre componenti nonché l'integrità del grippaggio del ricevitore della proteina espressa, ma, in entrambi i casi, i metodi non sono stati sviluppati per sfruttare il tandem EM/MS 8,9si avvicinano. Il solo altro interferometria sistema che MS analisi consentono di caratterizzare le interazioni combinata era un interferometria a doppia polarizzazione10. Purtroppo, questo sistema non è più disponibile per uso generale. Come accennato nell'introduzione, ci sono stati una serie di studi completato dove campioni erano formati sulle superfici SPR-come biosensore e rimosso da analisi MS. Nessuno di questi esempi è provocato da complessi visualizzati utilizzando EM.
Le limitazioni di questo metodo sequenza possono essere molteplici, ma sono risolvibili. Per l'immobilizzazione iniziale e quindi il passaggio di fondazione dell'Assemblea, una mancanza di conoscenza delle superfici strutturali interazione sarebbe certamente ostacolare il progresso connesso con monitoraggio fasi di montaggio iniziale. La mancanza di informazioni sulla struttura possa essere affrontata con la progettazione di un derivati dal fondamento costruire dove chimiche allegato (ad esempio solfidrilici frazione per legami disolfuro / His-Tag posizionamento) può essere spostato in diverse regioni all'interno del nucleo sistema di assemblaggio. Nel caso la tossina antrace complessa, è stata una fortuna che la struttura di LFN associato a PAprepore è disponibili11. Posizionamento razionale della cisteina ingegnerizzata è stata localizzata alle regioni lontano dal viso di associazioneprepore PA. Con i prodotti chimici per sollevatore di cisteina, è preferibile che nessun altre cisteine reattivi sono presenti sulla superficie della proteina.
Ci sono vari processi chimici di attaccamento che possono essere utilizzati per progettare il sito allegato specifico sulle superfici di una proteina. Uno degli allegati specifici più popolari coinvolge posizionare una molecola di biotina in una posizione specificamente definita sulla superficie della proteina12. Purtroppo, associazione di biotina streptavidina o avidina rivestito superfici è piuttosto stretto. Inversione dell'interazione associazione non è semplice. L'uso di un ingegnerizzati His-tag a N - o C-terminale e la conseguente facilità di allegato alle superfici Ni-NTA è un'applicazione più universale di immobilizzazione di affinità. Naturalmente, uno delle avvertenze per i siti di allegato Assemblea ingegneria con sistemi His-tag è il requisito che la N - e C-termini della proteina core Assemblea rimangono esposti e separati in modo che l'allegato è facile. Come con tutti i processi di assemblaggio, l'interfaccia di interazione della proteina core Assemblea deve rimanere disponibile il progredire di assiemi complessi.
Forse la preoccupazione più comune dell'utilizzo di composizioni chimiche superficiali biosensore è legame non specifico. Consigli di streptavidina sono spesso una fonte di effetti significativi legami aspecifici. Disolfuro collegato biotina può essere utilizzata per rilasciare complessi molto specifici, lasciando dietro di sé il collegamento S-biotina ridotto strettamente legato alla streptavidina immobilizzato biosensori13. Ci sono altre chimiche reversibili diventando disponibili come iminoboronates e a una minore misura ketoamide14. Questo campo è attualmente sottosviluppato, ma c'è grande interesse nell'ulteriore sviluppo di protocolli di covalenti reversibili per evitare effetti di tossicità della droga fuori bersaglio che comunemente accompagnano l'uso dello sviluppo di farmaci mirati covalente.
Una limitazione dell'utilizzo di EM di visualizzare complessi è interpretazione, soprattutto nel caso in cui le strutture dei complessi montati non sono inizialmente noti. La posizione spaziale dei componenti all'interno di un complesso macromolecolare assemblato non definito può essere identificata utilizzando anticorpi monoclonali (mAb) come marcatori specifici di cinetici e strutturali. Ad esempio, dopo aver formato un complesso, gli anticorpi monoclonali possono aggiungersi che si legano a componenti specifici. Questo metodo è spesso utilizzato in EM per identificare specifici componenti all'interno di grandi assiemi15. Un'altra limitazione è correlata alla dimensione del complesso, sebbene ci siano stati istanze dove definito assembly simmetrico piccolo come 70 kDa (GroES heptamer) sono facilmente risolto utilizzando negativo macchia EM. Assemblati complessi che vengono analizzati da EM sono tipicamente nell'intervallo di dimensioni di ~ 100 Å di diametro o superiore. Recentemente tuttavia, proteine piccoli come 20 kDa sono stati risolti e strutture di bassa risoluzione sono stati ottenuti quando si utilizza superior macchiatura metodologie16.
Per l'analisi di MS, la sensibilità aumentata della corrente MS strumentazione fino al livello di femtomolar (attomoles) può, in alcuni casi, aumentare la sensibilità del rilevamento di BLI. È altamente ipotizzabile che segnali di proteina che mostrano un aumento minimo ma ripetibile in ampiezze si tradurrà nell'identificazione della proteina in questione. Inoltre, interazioni proteina-proteina con uno dei partner attaccato il biosensore e l'altro in un ambiente cellulare di sondaggio in vigore si tradurrà in una purificazione e successivamente più facile individuazione del complesso appena formato. Una limitazione che può essere osservata con gli attuali sistemi MS altamente sensibili è che la proteina di interesse potrebbe non essere nel database, ma questa osservazione è rara (ad es., proteomi da specie rare). Se le sequenze delle proteine di interesse sono noti, questo problema è facilmente risolvibile inserendo la sequenza dell'amminoacido di proteine in un database di proteina di sfondo (come descritto in questo lavoro nella sezione protocollo). Un'altra limitazione potenziale della metodologia risultati dalla resistenza di una proteina a trypsinolysis. Digestione della tripsina è in genere il metodo predefinito per bottom-up identificazione della proteina. Tuttavia, le proteine possono essere resistenti a tripsina se mancano residui Arg e Lys o l'accesso a questi residui sono limitato dalla struttura piegata. Queste limitazioni sono stati risolti, rispettivamente, utilizzando alternativa o una combinazione delle proteasi o incluso un dispiegarsi del reagente (urea o guanidina HCl, come indicato in 1.1.14 e 1.2.6) prima digestione enzimatica.
Possibili espansioni di questa metodologia sono permettendo all'utente di seguire e identificare complessi cellulari Assemblea da lisati cellulari grezza. Si scopre test per componenti di assieme in estratti cellulari concentrati è facile da eseguire utilizzando le procedure di interferometria di biolayer. A differenza delle metodologie più comunemente usate microfluidici basato che sono inclini a intasamento e sensibili all'aggregazione, l'approccio BLI può essere utilizzato per immergere direttamente punte del sensore biolayer in estratti grezzi potenzialmente assemblare complessi specifici direttamente da questi campioni concentrati impuri. Una volta assemblato, è tutto fattibile utilizzare sonde di anticorpo specifico come un follow-up del sistema BLI per identificare ulteriormente e anche quantificare componenti sospetti negli estratti cellulari che sono stati identificati usando il metodo di microvolume MS. Ancora una volta, la chiave qui è di utilizzare proteine di nucleo definito, orientato correttamente come sonde specifiche affinità.
La possibilità di visualizzare il prepore per poro processo di transizione cineticamente con BLI sarà estremamente utile per identificare potenziali "anti-tossina" piccole molecole inibitrici di transizioni di proteine in particolare funzionano sotto tardi endosomal, basso pH (5.0) condizioni. Questo prepore pH indotta a poro di transizione è inibita in presenza di pieghevole stabilizzatore (osmoliti) come glicerolo o saccarosio e così presta forte sostegno per lo sviluppo di specifici mirati stabilizzatori pieghevoli che impediscono PA formazionedei pori . Questo approccio specifico evita e sostituisce greggi saggi basati su aggregazione dove il pH scende portano alla precipitazione della proteina. Quest'ultimo metodo, anche se buono per metodi primari di preselezione, spesso porta a risultati falsi positivi dove specifici composti inibiscono l'aggregazione piuttosto che le transizioni molecolari effettive.
Le osservazioni a valle della struttura e l'identificazione dei singoli componenti assemblati all'interno di microvolume piccoli campioni può essere anche utile nella convalida potenziali composti di piombo. Questo può essere applicato in casi dove la stabilizzazione dell'assembly specifico o destabilizzazione è il risultato di destinazione. Questo approccio parallelo cinetica/struttura/identificazione è utile per la conferma direttamente la validità di piombo sospetta composto effettori dell'Assemblea e serve come un passo ragionevole selezione secondaria o approccio medie velocità effettiva.
Cryo-EM è una tecnica utile per studiare i dettagli atomici dei complessi della macromolecola in vari Stati dell'Assemblea. Prima di preparare campioni di cryo-EM, è importante verificare innanzitutto che una preparazione contiene complessi ragionevolmente puri omogenei con macchia negativa EM. Il lavoro presentato qui dimostra assemblaggio dei complessi della proteina sulle superfici di biosensore BLI, rilascio di questi complessi per la visualizzazione di EM e l'identificazione di questi componenti utilizzando MS. Questa particolare metodologia di assemblaggio controllato e rilascio può essere utile per generare protocolli molto specifici che migliorano la preparazione dei campioni sequenziali omogeneo per macchia negativa EM, un passo necessario che deve essere dimostrato prima di passare alla Cryo-EM. Per ottenere la struttura 3D di bassa risoluzione, solo il 30-50 particelle del complesso sarebbero necessario eseguire una serie di inclinazione conico (70 visualizzazioni di diverse immagini 2D per particella) in dotazione c'è diversità di orientamento (più diversi punti di vista).
Per quanto riguarda migliorare metodi MS, progressi nella sensibilità e riduzione del volume del campione continuano a migliorare. Flussi di nano e la cromatografia liquida ultra-alta pressione insieme allo sviluppo di spettrometri di massa con un dazio veloce ciclo, maggiore sensibilità e potere risolutivo. Recente introduzione dello spettrometro orbitrap, in particolare l'ultima versione (orbitrap Fusion Lumos ed il relativo successore previsto il Orbitrap Fusion Lumos 1m) così come gli algoritmi di ricerca notevolmente facilitano questo processo.
La metodologia attuale monitora la cinetica montaggio e smontaggio di componenti di tossina antrace utilizzando metodologie BLI privo di etichetta e valuta la struttura e l'identità di questi componenti utilizzando EM e MS, rispettivamente. L'uso di un semplice singolo canale sistema BLI accoppiato con analisi EM la macchiatura negativa di routine e tecniche elementari di MS sono più che sufficienti per caratterizzare un processo di assemblaggio.

Identificare e comprendere la specificità che disciplinano assiemi complessi della proteina in vivo è di estremo interesse per i ricercatori biochimici. Grande proteina eterogenea assembly sono la norma piuttosto che l'eccezione. Questa nozione è sostenuta tramite monitoraggio spettroscopico di in vivo assieme, isolando complessi utilizzando tecniche di rottura cellulare più delicati, valutazione dei prodotti da metodi di purificazione basato su affinità e visualizzazione di loro utilizzando ad alta risoluzione microscopia elettronica criogenica (cryo-EM). Per comprendere il controllo della specificità di montaggio all'interno della cellula, i ricercatori devono ordinariamente isolare, identificare e caratterizzare, in definitiva, queste strutture dinamiche di montaggio/smontaggio. Lo strumento maggiormente utilizzato molecolare per identificare i componenti di queste assemblee frequentemente richiede immunoprecipitazione anticorpo-basato, che si basa sul mantenimento della stabilità dei complessi durante la distruzione cellulare. Varie tecniche analitiche accoppiati sono stati recentemente sviluppati per catturare complessi da campioni di cellule utilizzando approcci di microfluidica basato, come risonanza plasmonica di superficie (SPR). A seguito di rimozione dalle superfici di SPR, questi campioni sono stati analizzati da tempo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice di volo (MALDI-TOF)1,2. Avanzando questa metodologia utilizzando protocolli più facile permetterà ai ricercatori di visualizzare e convalidare il predetti complessi che si verificano nell'ambiente cellulare. Poiché SPR è un sistema basato su microfluidica, problemi derivano spesso dalla formazione di aggregati. Eludere questo problema richiede diluizione del campione, che a sua volta, può fare diminuire l'integrità dei complessi biologici responsabili di concentrazione.
Un relativamente recente progresso nelle tecnologie privo di etichetta è lo sviluppo del biolayer interferometria (BLI) system3. Questi particolare riflettanza basati sulla luce, sistemi di replica, o meglio emulano, associazione SPR e cinetiche risultati ad una frazione del costo3,4 specialmente se vengono utilizzate le unità a singolo canale. BLI misura i cambiamenti nei modelli di interferenza della luce riflessa tra un livello di riferimento (controllo) e la superficie di biolayer (sperimentale). Della variazione di fase è misurata in tempo reale una lettura quantitativa e cinetica5. La superficie di biosensore, contenente composizioni chimiche specifiche immobilizzazione, è fisicamente trasferita tra soluzioni, in contrasto con le modifiche di buffer di microfluidica approcci in SPR, per la misurazione tramite deviazioni di fase di lunghezza d'onda. Effetti del trasferimento di massa sono impediti agitando la soluzione. A differenza di SPR, questi sistemi sono molto utili nella valutazione dei complessi da campioni biologici grezzi. Il parametro fisico misurato durante gli esperimenti BLI principalmente dipende da un cambiamento in massa o spessore sulla superficie di biosensore che deriva dalla proteina complessa montaggio o smontaggio.
Questi biosensori ottici della fibra sono relativamente poco costoso e facile da usare. Uno degli aspetti emergenti utili di BLI è la facile rimozione dei complessi della proteina appena assemblato dalla superficie. Una recente applicazione di questo metodo ha permesso il nostro laboratorio per osservare la cinetica di tempo reale di pH su larga scala ha indotto la riorganizzazione struttura proteica del componente antigene protettivo (PA) tossina antrace come prepore (PAprepore) la transizione al suo forma di poro (PAporo). Questa transizione sulla punta biosensore è stata verificata mediante microscopia elettronica (EM)6. Rimozione dei complessi da superfici di biosensore evita effetti di diluizione volume più grandi incontrati frequentemente rilasciando complessi da superfici di chip quando si utilizzano sistemi microfluidici.
Nel lavoro attuale, complessi di tossina antrace sono montati e smontati sulla superficie del biosensore e quindi rilasciate microliter volumi. I componenti complessi risultanti vengono convalidati utilizzando ortogonalmente EM e spettrometria di massa (MS).

<table><tbody><tr><td>(1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide)) (EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-piridinilditio)etanamina) (PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL microprovette nere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Acclamazione PepMap 50 &mu; m x 150 mm, C18, 2 & mu; m, 100 & Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Punte reattive all'ammina di 2a generazione (AR2G)</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Anotop 10 filtro per siringa, 0,02 um</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Morphogenic Gene-2</td><td></td><td></td><td>Proteina prodotta e purificata internamente</td></tr><tr><td>Griglia Cu 300 rivestita di carbonio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>Acidi formici</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di guanidina (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide</td><td>MP-BioMedicals,LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-cistiene cloridrato idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fattore letale Dominio</td><td></td><td></td> N-terminale <td>Proteina prodotta e purificata in-house</td></tr><tr><td>MS software versione 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher</td> Provette per PCR ThermoFisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easiGlow glow discharge cleaning system</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Proteina protettiva prepore</td><td></td><td></td><td>Proteina prodotta e purificata internamente</td></tr><tr><td>Cerchi di carta da filtro qualitativa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado di sequenziamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT motore di ricerca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Colato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Formiato di uranile (UF)</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table>

l'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Proteine in vivo sono spesso parte di grandi complessi macromolecolari dove specificità di legame e dinamiche in definitiva dettare uscite funzionale. In questo lavoro, la tossina antrace pre-endosomal è assemblata e transizione nel complesso endosomal. In primo luogo, il dominio N-terminale di un fattore letale mutante di cisteina (LFN) è collegato a un biosensore di interferometria (BLI) biolayer attraverso il bisolfuro di accoppiamento in un orientamento Ottimo, permettendo prepore antigene protettivo (PA) associare (Kd 1 nM). Il LFN-PA orientati in maniera ottimaleprepore complesso associa quindi a capillare morfogenetico gene-2 (CMG2) delle cellule superficiale recettore solubile (Kd 170 pM), risultante in un complesso di pre-endosomal rappresentante antrace, stabile a pH 7.5. Questo complesso assemblato viene sottoposta a rappresentante di acidificazione (pH 5.0) dell'ambiente endosoma tardivo per la PAprepore di transizione allo stato dei pori della membrana inserita. Questo stato diporo di PA si traduce in un'associazione indebolita tra il recettore CMG2 e il LFN-PA delporo e una sostanza dissociazione di CMG2 dal poro di transizione. Il thio-pignoramento di LFN alla superficie del biosensore è facilmente invertito da ditiotreitolo. Riduzione sulla superficie del biosensore BLI rilascia il LFN-PAprepore-complesso ternario CMG2 o l'acido transizione complessiporo LFN-PA in microlitro volumi. Rilasciato complessi sono poi visualizzati e identificati usando la microscopia elettronica e spettrometria di massa. Questi esperimenti dimostrano come il montaggio/smontaggio cinetico di complessi proteici specifici utilizzando metodologie BLI privo di etichetta di monitorare e valutare la struttura e l'identità di questi BLI assemblati complessi da microscopia elettronica e massa spettrometria di, rispettivamente, utilizzando procedure sequenziale di facile--replicare.

La capacità di monitorare e convalidare l'Assemblea dei grandi complessi macromolecolari è un passo cruciale per comprendere la specificità e la funzionalità degli assembly grande biomolecolari. I risultati dei metodi presentati qui dimostrano la facilità con cui complessi proteici grande (&gt; 150 kDa massa) può essere assemblato usando biolayer interferometria, tutto mentre monitoraggio la cinetica e l'ampiezza dell'Assemblea. La natura unica e compatta della superficie del biosensore consente l'analisi di montaggio sia esteso da rilasciando complessi montati in microvolumi piccolo. Questi microvolumi possono essere utilizzati per visualizzare la struttura fisica iniziale dei complessi utilizzando EM e per verificare l'identità dei componenti complessi utilizzando MS. Una descrizione schematica di questo intero processo è illustrata nella Figura 1.
Un elemento chiave per il corretto montaggio e la verifica del complesso macromolecolare sulla superficie del biosensore coinvolge il corretto orientamento della proteina seme iniziale. Questo assicura che i siti di interazione proteina-proteina sono accessibili, non stericamente bloccato e ottimamente posizionato lontano dalla superficie del biosensore. Come illustrato nella Figura 2, l'orientamento corretto della tossina antrace complessa è realizzato usando un frammento N-terminale specificamente progettato del fattore letale (LFN) così il sito di legame delprepore LFN-PA è sempre posizionato opposto del biosensore covalente sito6,7. L'accumulazione successiva del complesso con l'associazione di PA per il biosensore LFN BLI seguito da solubile CMG2 associazione alla PA crea in definitiva una tossina antrace competente di traslocazione complesse.
La traccia di sensogram BLI è una lettura in tempo reale fuori i cambiamenti di ampiezza a causa dell'aggiunta specifico dei componenti di tossina antrace come vengono aggiunti sul biosensore. Figura 3 Mostra una traccia rappresentanza accoppiata con un modello del complesso preveduto per forma a quella fase del processo. Il primo aumento è LFN carico sulla punta. Dopo tempra e della linea di base, PAprepore associa quindi a LFN seguita dall'aggiunta del recettore solubile CMG2 risultanti nel complesso assemblato pre-endosomal di LFN-PAprepore-CMG2. Per progredire verso l'ambiente endosoma tardivo, l'intero complesso è sottoposto ad un impulso di basso pH (pH 5.0) che indebolisce il recettore vincolante, permettendo la prepore alla transizione alla sua conformazione del poro della membrana estesa inserita. 6 Sensogram tracce del passaggio dell'acidificazione sono mostrate in Figura 4. Il poro estensione6 che devono verificarsi prima del grippaggio del ricevitore di CMG2 la diminuzione è probabilmente l'aumento iniziale o un 'spike' in ampiezza. Il più grande calo di ampiezza è più probabile dissociazione completa o sostanziale del ricevitore a causa della diminuita affinità. Il lavoro precedente in questo laboratorio indicato CMG2 vincolante per la PA completamente estesadel poro è trascurabile rispetto al CMG2-PAprepore interazione6. Inoltre, l'analisi cinetica di sensogram, osservata in tutte le sensograms di LFN-PAprepore-CMG2 transizioni a LFN-PAdei pori con una goccia di pH, è riproducibile su esecuzioni multiple.
Prima e dopo l'acidificazione, i complessi di biosensore attaccato facilmente vengono rilasciati per la visualizzazione di macchia negativa EM e identificazione di MS (Figura 5). Rappresentativi complessi dai risultati EM sono illustrati nella Figura 6. Griglie di campione pre-endosomal, mostrano densità coerente con complessi ternari intatti costituito da LFN-PAprepore-CMG2. Visualizza le reti complesse post-acidificazione, PA la transizione per poro e solubilizzato dall'inclusione di micella con nessuna densità CMG2 ovvia.
L'identità di pre- e post-acidificazione complessi sono stati verificati da MS. Un database dove le sequenze di PA, P13423; LFN, P15917; e CMG2, P58335 sono stati inclusi in uno sfondo di un database di proteine di topo derivato dal repository NCBInr. Solo le proteine di interesse sono state ottenute da questa prima ricerca nel database, con la seguente copertura dell'amminoacido per i complessi binari e ternari: 54% e 22% per PA, 36% e 6% per LF e 43% per CMG2, rispettivamente (CMG2 non è stata rilevata sul complesso binario). Al fine di massimizzare la copertura dell'amminoacido della proteina, una seconda identificazione di peptidi/proteine è stata realizzata utilizzando un database di proteine contenenti solo le tre proteine di interesse. Pre-endosomal MS campioni contenevano peptidi da tutti i componenti di tre tossina con 60,46%, 67,97% e copertura 54.15% per LFN, PA e CMG2, rispettivamente (Figura 7). Risultati post-endosomal, illustrati nella Figura 8, conteneva solo peptidi da LFN e PA (copertura 57,41% e 67,79%, rispettivamente). La mancanza di CMG2 nei campioni post-endosomal sono coerenti con la diminuzione di nm BLI osservata durante la formazione del poro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> Figura 1. Schema generale per l'analisi dei complessi della proteina assemblati su e isolato da biosensore BLI utilizzando EM e MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> Figura 2. Attivazione di biosensore: primo passo in assembly specifico orientamento su biosensore BLI. Il dominio N-terminale del fattore letale E126C, (LFN) è collegato tramite un thio-sollevatore creazione dell'interfaccia di associazioneprepore PA correttamente orientata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> Figura 3. Monitoraggio dell'antrace tossina montaggio e smontaggio con BLI: il sensogram Mostra cambiamenti di ampiezza in funzione del tempo a causa di specifica aggiunta dell'antrace tossina componenti che vengono aggiunti sul biosensore a partire con il caricamento di LFN (passaggio 4 in Tabella 1). PAprepore viene quindi caricato sulla superficie seguita dall'aggiunta del recettore solubile CMG2. Il complesso di pre-endosomal assemblato è costituito da un LF-PAprepore- CMG2. Per progredire verso l'ambiente endosoma tardivo, l'intero assemblaggio funzionale antrace tossina viene sottoposto ad un impulso di basso pH (pH 5.0) che indebolisce il recettore vincolante, permettendo la prepore alla transizione alla sua conformazione del poro della membrana estesa inserita. L'esposizione della membrana che attraversa il poro è confermata e solubilizzato con aggiunta di micelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> Figura 4. BLI sensogram della CMG2 release: le tracce del passaggio dell'acidificazione mostrano un aumento iniziale o 'spike' in ampiezza seguita da un declino di ampiezza più grande che sono probabili poro formazione e dissociazione del ricevitore, rispettivamente. Linee verticali rosse punteggiate indicano inizio di un nuovo passo. Sensograms sono allineati alla grassetto rosso linea punteggiata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> Figura 5. Analisi dei complessi della proteina assemblati su e isolato da biosensore BLI utilizzando EM e MS: Biosensor allegate complessi sono facilmente rilasciate da 5 µ l di tampone contenente DTT per visualizzazione di macchia negativa EM e identificazione di MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per Mostra una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> Nella figura 6. Visualizzazione dei complessi della proteina con EM: griglie di campione Pre-endosomal, mostrano densità coerente con complessi ternari intatti costituito da LFN-PAprepore-CMG2. Visualizza post-endosomal complesse griglie, PA la transizione per poro e solubilizzato di micella con nessuna densità CMG2 ovvia. Modelli di complessi predetti (lato sinistro) sono alla stessa scala come singole particelle mostrato. Particelle di colorized con proteina preveduta (basata su dimensione di densità EM) sono indicate sotto ogni particella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> Figura 7. Verifica dei complessi della proteina con MS: Pre-endosomal MS campioni contenevano peptidi da tutti i componenti di tre tossina con 60,46%, 67,97% e copertura 54.15% per LFN, PA e CMG2, rispettivamente. Peptidi rilevati ad un tasso di falsi scoperta (FDR) uguale o supera al 5% in giallo, FDR pari o superiori a 1% in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> Figura 8. Verifica dei complessi della proteina con MS: peptidi campioni contenuti Post-endosomal da LFN e PA (copertura 57,41% e 67,79%, rispettivamente), ma non CMG2. FDR uguale o superiore al 5% in giallo, FDR pari o superiori a 1% in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Tempo (s)</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>Previsione iniziale</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>Attivazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>Attivazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>CaricoN LF</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>Cisteina quench</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>Linea di base</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>Associazioneprepore PA</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>Linea di base</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 associazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>Linea di base</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>Acido transizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>Linea di base</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Associazione di micella</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Tempi di passaggio per singolo BLI eseguire di tossina antrace di assemblaggio complessa. Si noti che le linee di base vengono utilizzati per lavare via proteina non associata dal passaggio precedente e/o stabilire una nuova base di buffer.

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'assemblaggio dinamico di complessi proteici in diversi ambienti di pH utilizzando l'interferometria a biostrato e confermare i componenti utilizzando la microscopia elettronica e la spettrometria di massa. Identificare e comprendere la specificità che governa la formazione e l'assemblaggio dei complessi proteici è di estremo interesse per i ricercatori biochimici. La metodologia di cui parliamo oggi consente ai ricercatori di assemblare, visualizzare e convalidare i complessi macromolecolari previsti.La natura complessa della superficie del biosensore consente quindi ai ricercatori di rilasciare facilmente i complessi assemblati in piccoli microvolumi per la microscopia elettronica e l'analisi della spettrometria di massa. In questa dimostrazione, abbiamo seguito la cinetica dei riarrangiamenti strutturali indotti dal pH del complesso della tossina dell'antrace e abbiamo verificato questi riarrangiamenti mediante microscopia elettronica e metodi di spettrometria di massa, il tutto evitando l'aggregazione. A dimostrare l'assemblaggio della tossina dell'antrace sulla superficie del biosensore BLI, il rilascio del campione macro e le procedure di colorazione EM-negative saranno Alexandra Machen e Pierce O'Neil, studenti laureati del mio laboratorio.Il Dr.Antonio Artigues è determinante nell'analisi e nell'identificazione dei microcampioni rilasciati da BLI, utilizzando lo spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos. Per iniziare, idratare una punta del biosensore BLI di seconda generazione reattiva all'ammina immergendola in 250 microlitri di acqua e incubarla per 10 minuti. Nel software Blitz, programma i tempi di passo come elencato in questa tabella.Iniziare la corsa BLI immergendo la punta del biosensore in 250 microlitri di acqua per 30 secondi per misurare una linea di base iniziale dello spessore e della densità del biosensore. Quindi, attivare il biosensore immergendo la punta in 250 millilitri di NHS da 50 millimolari e 200 millimolari EDC per sette minuti. Quindi, immergere il biosensore attivato in PDEA da 50 millimolari disciolta in tampone borato molare da 0,1, pH 8,5, per cinque minuti per generare una superficie bioreattiva attivata.A questo punto, immergere il biosensore bioreattivo attivato in 250 microlitri di una soluzione contenente 100 nanomolari di E126C LFn in 10 millimolari di acetato di sodio pH cinque, 100 millimolari di tampone cloruro di sodio per cinque minuti. Immergere la punta LFn in 50 millimolari di L-cisteina, 1 molare di cloruro di sodio, 0,1 molare di acetato di sodio a pH cinque per quattro minuti per estinguere eventuali gruppi tioli-reattivi liberi rimanenti. Dopo aver immerso la punta LFn temprata in 50 millimolare di Tris, 50 millimolare di cloruro di sodio per stabilire la linea di base del tampone, immergere la punta in 0,5 micromolari di prepore protettivo dell'antigene, 50 millimolare di Tris, 50 millimolare di cloruro di sodio per cinque minuti per creare il complesso LFn PA-prepore.Una volta associato il PA-prepore, rimuovere la punta dalla soluzione di PA-prepore e immergere la punta in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per 30 secondi per lavare via qualsiasi PA-prepore non specificamente legato. Immergere il complesso LFn PA-prepore in 0,5 micromolari di CMG2 in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per cinque minuti. Immergere il complesso LFn PA-prepore CMG2 in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per 30 secondi per lavare via l'eventuale CMG2 non legato per formare un complesso pre-endosomiale.Per l'analisi EM, rilasciare il complesso LFn PA-prepore CMG2 dalla punta del biosensore immergendo la punta in una provetta PCR contenente cinque microlitri di DTT da 50 millimolari, Tris da 50 millimolari e cloruro di sodio da 50 millimolari. Per l'analisi MS tandem dei peptidi del complesso, rilasciare il complesso LFn PA-prepore CMG2 dalla punta del biosensore immergendo il biosensore in una provetta PCR contenente cinque microlitri di DTT da 50 millimolari, sei molari di guanidina cloridrato priva di cheratina e 25 millimolari di bicarbonato di ammonio, pH otto. Per visualizzare il complesso dopo la transizione del pH, assemblare il complesso CMG2 LFn PA-prepore sul biosensore, come appena dimostrato.Immergere la punta del biosensore in 10 millimolari di acetato a pH cinque per cinque minuti per avviare la transizione del poro PA a PA. Questa transizione è indicata da un aumento dell'ampiezza, seguito da un calo di ampiezza più ampio che si ipotizza sia sostanziale per la completa dissociazione del recettore a causa della diminuzione dell'affinità di legame. Per l'analisi EM, immergere la punta del biosensore in una soluzione contenente micelle da 1,25 millimolari per cinque minuti, per evitare l'aggregazione in soluzione dopo il rilascio di disolfuro.Per eseguire la microscopia elettronica a colorazione negativa, iniziare scaricando una griglia di rame 300 rivestita di carbonio a una pressione atmosferica stabile di 0,38 millibar e meno 15 milliampere per 20 secondi, quindi sfiatare il dispositivo con aria. Fissa la griglia tra un paio di pinzette pulite. Quindi pipettare quattro microlitri di campione complesso rilasciato sulla griglia e lasciare l'adsorbimento per 60 secondi.Con un cuneo di carta da filtro, rimuovere il liquido rimanente. Quindi colorare la griglia pipettando su di essa cinque microlitri di formiato di uranile filtrato allo 0,75% punto zero da due micron e, dopo cinque secondi, rimuovere la macchia in eccesso. Lasciare asciugare la griglia a temperatura ambiente mentre è coperta.Quindi utilizzare il microscopio elettronico a trasmissione per visualizzare il campione. Infine, dopo aver preparato i campioni per la spettrometria di massa secondo il protocollo di testo, azionare lo spettrometro di massa utilizzando CID e un'energia di collisione normalizzata di 35 sotto controllo automatico per eseguire continuamente una scansione MS, seguita dal maggior numero possibile di scansioni MS-MS tandem in un periodo di tre secondi. La traccia del sensogramma BLI è una lettura in tempo reale delle variazioni di ampiezza dovute all'aggiunta specifica dei componenti della tossina dell'antrace.La prima lievitazione è LFn che si carica sulla punta. Dopo il quenching e la linea di base, il PA-prepore si lega a LFn, seguito dall'aggiunta di CMG2 solubile, ottenendo il complesso pre-endosomiale assemblato. Il complesso viene quindi sottoposto a un basso pH che indebolisce il legame con il recettore e provoca la transizione del prepore alla sua conferma estesa dei pori che è confermata dall'aggiunta di micelle.Qui sono mostrate le immagini EM con colorazione negativa dei complessi al momento del rilascio dal biosensore. Le griglie di campionamento pre-endosomiali hanno mostrato densità coerenti con complessi ternari intatti costituiti da LFn PA-prepore CMG2. Le griglie del complesso post-acidificazione mostrano che PA è passato al poro e solubilizzato per inclusione micellare senza un'evidente densità di CMG2.Come visto dalla MS, che ha confermato i complessi proteici, i campioni di MS pre-endosomici contenevano peptidi di tutti e tre i componenti della tossina con una copertura del 60,46, 67,97 e 54,15% rispettivamente per LFn, PA e CMG2. I campioni post-endosomiali contenevano solo peptidi da LFn e PA. La mancanza di CMG2 è coerente con la diminuzione del nanometro BLI osservata durante la formazione dei pori. La capacità di monitorare e convalidare l'assemblaggio di grandi complessi di macromolecole è un passo cruciale verso la comprensione della specificità e della funzionalità di grandi assemblaggi biomolecolari.La nostra capacità di rilasciare complessi macromolecolari preassemblati da biosensori in microvolumi per la visualizzazione al microscopio elettronico sarà estremamente utile per l'analisi della struttura. La nostra analisi della composizione dei complessi di assemblaggio del biosensore ha utilizzato solo 0,04 femtomoli del complesso di rilascio per identificare i suoi componenti prima e dopo l'acidificazione endosomiale assimilata. Il protocollo di rilascio dell'assemblaggio del biosensore può essere adattato per seguire le transizioni endosomiali naturali ma sfuggenti indotte dal pH di altre tossine batteriche nelle strutture proteiche virali, con l'ulteriore vantaggio di evitare l'aggregazione proteica.

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