L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'assemblaggio dinamico di complessi proteici in diversi ambienti di pH utilizzando l'interferometria a biostrato e confermare i componenti utilizzando la microscopia elettronica e la spettrometria di massa. Identificare e comprendere la specificità che governa la formazione e l'assemblaggio dei complessi proteici è di estremo interesse per i ricercatori biochimici. La metodologia di cui parliamo oggi consente ai ricercatori di assemblare, visualizzare e convalidare i complessi macromolecolari previsti.

La natura complessa della superficie del biosensore consente quindi ai ricercatori di rilasciare facilmente i complessi assemblati in piccoli microvolumi per la microscopia elettronica e l'analisi della spettrometria di massa. In questa dimostrazione, abbiamo seguito la cinetica dei riarrangiamenti strutturali indotti dal pH del complesso della tossina dell'antrace e abbiamo verificato questi riarrangiamenti mediante microscopia elettronica e metodi di spettrometria di massa, il tutto evitando l'aggregazione. A dimostrare l'assemblaggio della tossina dell'antrace sulla superficie del biosensore BLI, il rilascio del campione macro e le procedure di colorazione EM-negative saranno Alexandra Machen e Pierce O'Neil, studenti laureati del mio laboratorio.

Il Dr.Antonio Artigues è determinante nell'analisi e nell'identificazione dei microcampioni rilasciati da BLI, utilizzando lo spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos. Per iniziare, idratare una punta del biosensore BLI di seconda generazione reattiva all'ammina immergendola in 250 microlitri di acqua e incubarla per 10 minuti. Nel software Blitz, programma i tempi di passo come elencato in questa tabella.

Iniziare la corsa BLI immergendo la punta del biosensore in 250 microlitri di acqua per 30 secondi per misurare una linea di base iniziale dello spessore e della densità del biosensore. Quindi, attivare il biosensore immergendo la punta in 250 millilitri di NHS da 50 millimolari e 200 millimolari EDC per sette minuti. Quindi, immergere il biosensore attivato in PDEA da 50 millimolari disciolta in tampone borato molare da 0,1, pH 8,5, per cinque minuti per generare una superficie bioreattiva attivata.

A questo punto, immergere il biosensore bioreattivo attivato in 250 microlitri di una soluzione contenente 100 nanomolari di E126C LFn in 10 millimolari di acetato di sodio pH cinque, 100 millimolari di tampone cloruro di sodio per cinque minuti. Immergere la punta LFn in 50 millimolari di L-cisteina, 1 molare di cloruro di sodio, 0,1 molare di acetato di sodio a pH cinque per quattro minuti per estinguere eventuali gruppi tioli-reattivi liberi rimanenti. Dopo aver immerso la punta LFn temprata in 50 millimolare di Tris, 50 millimolare di cloruro di sodio per stabilire la linea di base del tampone, immergere la punta in 0,5 micromolari di prepore protettivo dell'antigene, 50 millimolare di Tris, 50 millimolare di cloruro di sodio per cinque minuti per creare il complesso LFn PA-prepore.

Una volta associato il PA-prepore, rimuovere la punta dalla soluzione di PA-prepore e immergere la punta in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per 30 secondi per lavare via qualsiasi PA-prepore non specificamente legato. Immergere il complesso LFn PA-prepore in 0,5 micromolari di CMG2 in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per cinque minuti. Immergere il complesso LFn PA-prepore CMG2 in 50 millimolari di Tris, 50 millimolari di cloruro di sodio per 30 secondi per lavare via l'eventuale CMG2 non legato per formare un complesso pre-endosomiale.

Per l'analisi EM, rilasciare il complesso LFn PA-prepore CMG2 dalla punta del biosensore immergendo la punta in una provetta PCR contenente cinque microlitri di DTT da 50 millimolari, Tris da 50 millimolari e cloruro di sodio da 50 millimolari. Per l'analisi MS tandem dei peptidi del complesso, rilasciare il complesso LFn PA-prepore CMG2 dalla punta del biosensore immergendo il biosensore in una provetta PCR contenente cinque microlitri di DTT da 50 millimolari, sei molari di guanidina cloridrato priva di cheratina e 25 millimolari di bicarbonato di ammonio, pH otto. Per visualizzare il complesso dopo la transizione del pH, assemblare il complesso CMG2 LFn PA-prepore sul biosensore, come appena dimostrato.

Immergere la punta del biosensore in 10 millimolari di acetato a pH cinque per cinque minuti per avviare la transizione del poro PA a PA. Questa transizione è indicata da un aumento dell'ampiezza, seguito da un calo di ampiezza più ampio che si ipotizza sia sostanziale per la completa dissociazione del recettore a causa della diminuzione dell'affinità di legame. Per l'analisi EM, immergere la punta del biosensore in una soluzione contenente micelle da 1,25 millimolari per cinque minuti, per evitare l'aggregazione in soluzione dopo il rilascio di disolfuro.

Per eseguire la microscopia elettronica a colorazione negativa, iniziare scaricando una griglia di rame 300 rivestita di carbonio a una pressione atmosferica stabile di 0,38 millibar e meno 15 milliampere per 20 secondi, quindi sfiatare il dispositivo con aria. Fissa la griglia tra un paio di pinzette pulite. Quindi pipettare quattro microlitri di campione complesso rilasciato sulla griglia e lasciare l'adsorbimento per 60 secondi.

Con un cuneo di carta da filtro, rimuovere il liquido rimanente. Quindi colorare la griglia pipettando su di essa cinque microlitri di formiato di uranile filtrato allo 0,75% punto zero da due micron e, dopo cinque secondi, rimuovere la macchia in eccesso. Lasciare asciugare la griglia a temperatura ambiente mentre è coperta.

Quindi utilizzare il microscopio elettronico a trasmissione per visualizzare il campione. Infine, dopo aver preparato i campioni per la spettrometria di massa secondo il protocollo di testo, azionare lo spettrometro di massa utilizzando CID e un'energia di collisione normalizzata di 35 sotto controllo automatico per eseguire continuamente una scansione MS, seguita dal maggior numero possibile di scansioni MS-MS tandem in un periodo di tre secondi. La traccia del sensogramma BLI è una lettura in tempo reale delle variazioni di ampiezza dovute all'aggiunta specifica dei componenti della tossina dell'antrace.

La prima lievitazione è LFn che si carica sulla punta. Dopo il quenching e la linea di base, il PA-prepore si lega a LFn, seguito dall'aggiunta di CMG2 solubile, ottenendo il complesso pre-endosomiale assemblato. Il complesso viene quindi sottoposto a un basso pH che indebolisce il legame con il recettore e provoca la transizione del prepore alla sua conferma estesa dei pori che è confermata dall'aggiunta di micelle.

Qui sono mostrate le immagini EM con colorazione negativa dei complessi al momento del rilascio dal biosensore. Le griglie di campionamento pre-endosomiali hanno mostrato densità coerenti con complessi ternari intatti costituiti da LFn PA-prepore CMG2. Le griglie del complesso post-acidificazione mostrano che PA è passato al poro e solubilizzato per inclusione micellare senza un'evidente densità di CMG2.

Come visto dalla MS, che ha confermato i complessi proteici, i campioni di MS pre-endosomici contenevano peptidi di tutti e tre i componenti della tossina con una copertura del 60,46, 67,97 e 54,15% rispettivamente per LFn, PA e CMG2. I campioni post-endosomiali contenevano solo peptidi da LFn e PA. La mancanza di CMG2 è coerente con la diminuzione del nanometro BLI osservata durante la formazione dei pori. La capacità di monitorare e convalidare l'assemblaggio di grandi complessi di macromolecole è un passo cruciale verso la comprensione della specificità e della funzionalità di grandi assemblaggi biomolecolari.

La nostra capacità di rilasciare complessi macromolecolari preassemblati da biosensori in microvolumi per la visualizzazione al microscopio elettronico sarà estremamente utile per l'analisi della struttura. La nostra analisi della composizione dei complessi di assemblaggio del biosensore ha utilizzato solo 0,04 femtomoli del complesso di rilascio per identificare i suoi componenti prima e dopo l'acidificazione endosomiale assimilata. Il protocollo di rilascio dell'assemblaggio del biosensore può essere adattato per seguire le transizioni endosomiali naturali ma sfuggenti indotte dal pH di altre tossine batteriche nelle strutture proteiche virali, con l'ulteriore vantaggio di evitare l'aggregazione proteica.