Tecnologia di interferometria a biostrati per rilevare le interazioni tra ligando e analita

Per rilevare le interazioni ligando-analita utilizzando l'interferometria a biostrato, BLI, iniziare con un biosensore a fibre ottiche idratate fissato su un supporto per strumento BLI, impostato sul programma desiderato.

La punta del biosensore è rivestita con uno strato biocompatibile immobilizzato con gruppi di acido nichel-nitrilotriacetico, Ni-NTA. Immergere la punta del biosensore nel tampone.

Lo strumento emette luce bianca verso il biosensore, che viene riflessa da due interfacce: lo strato di riferimento interno o ottico e lo strato biocompatibile. I raggi riflessi interferiscono in modo costruttivo o distruttivo a diverse lunghezze d'onda della luce. Un fotorilevatore rileva il modello di interferenza risultante.

Dopo la misurazione della risposta interferometrica al basale, aggiungere una soluzione di ligando marcata con istidina. I tag di istidina si legano ai cationi di nichel sul biosensore, immobilizzando i ligandi sulla punta.

Dopo l'associazione, la luce bianca emessa viene riflessa dallo strato ottico e lo strato biocompatibile immobilizzato con ligandi con spessore ottico maggiore sulla punta. Ciò aumenta la distanza tra gli strati riflettenti, causando uno spostamento del modello di interferenza e uno spostamento della lunghezza d'onda.

Lavare la punta, rimuovendo i leganti non legati. Incubare con la soluzione di analita target. L'analita si lega al ligando, aumentando ulteriormente lo spessore ottico sulla punta, causando un aumento dello spostamento della lunghezza d'onda.

Posizionare la punta del biosensore nel tampone. Registrare lo spostamento della lunghezza d'onda durante la dissociazione dell'analita dal ligando immobilizzato sulla punta.

Il monitoraggio della variazione dello spostamento della lunghezza d'onda nel tempo facilita lo studio delle interazioni molecolari tra ligandi e analiti.

Accendi la macchina BLItz. Assicurarsi che la macchina sia collegata al computer tramite una porta di uscita dati USB sul retro della macchina.

Sul computer, apri il software associato e fai clic su "Cinetica avanzata" sul lato sinistro dello schermo. Nel software, digitare tutte le informazioni appropriate sull'esperimento sotto ogni rispettiva intestazione. Fare clic su "Tipo di biosensore" e scegliere "Ni-NTA" dal menu a discesa. La durata di ogni passaggio può essere modificata da Predefinita in base alle esigenze. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare un minimo di 30 secondi per il basale iniziale e il basale e 120 secondi per l'associazione e la dissociazione.

Rimuovere il biosensore di nichel-NTA idrato dalla provetta per PCR e fissarlo al supporto del biosensore sulla macchina, facendo scorrere l'ampia parte del biosensore sul supporto.

Inserire una provetta per microcentrifuga nera da 0,5 millilitri nel portaprovette della macchina e pipettare 400 microlitri di tampone BLI. Chiudere il coperchio della macchina in modo che la punta del biosensore venga immersa nel tampone della provetta della microcentrifuga. Fare clic su "Avanti" sul software per iniziare a registrare la linea di base iniziale.

Al termine della registrazione del passaggio di base iniziale, aprire il coperchio della macchina. Sposta il cursore verso destra. Pipettare 4 microlitri di un ligando dializzato con tag His-tagging sul portagocce e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di caricamento.

Al termine della registrazione della fase di caricamento, aprire il coperchio della macchina. Spostare il cursore verso sinistra, in modo che il supporto del tubo si trovi nuovamente davanti alla freccia nera. Chiudere il coperchio della macchina e assicurarsi che la punta del biosensore sia immersa nel tampone BLI della provetta nel supporto della provetta. La macchina e il software inizieranno automaticamente a registrare il passaggio di base.

Al termine della registrazione del passaggio di base, aprire il coperchio della macchina. Rimuovere il portagocce e pulirlo pipettando le proteine e risciacquandolo con acqua a doppia deionizzazione per un totale di cinque volte. Utilizzare una salvietta per fazzoletti per pulire la superficie del portagocce dopo l'ultimo lavaggio. Riposizionare il supporto di caduta sulla macchina. Spostare il cursore sulla macchina verso destra in modo che il supporto della caduta si trovi nuovamente davanti alla freccia nera.

Pipettare 4 microlitri di analita dializzato sul portagocce e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di associazione. Al termine della registrazione del passaggio di associazione, aprire il coperchio della macchina. Spostare il cursore sulla macchina verso destra in modo che il supporto del tubo sia nuovamente posizionato davanti alla freccia nera e chiudere il coperchio della macchina, che inizierà automaticamente a registrare la fase di dissociazione.