Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

Gli obiettivi di questo metodo basato sull'ELISA sono in primo luogo determinare l'affinità di legame di una citochina al suo recettore e in secondo luogo, misurare gli effetti di blocco dei peptidi inibitori dell'interazione ligando-recettore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni proteina-proteina, come il legame citochina-recettore. Le affinità di legame e il blocco di queste possono aumentare la comprensione generale della dinamica delle interazioni.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che è facile da eseguire, genera recettori etichettati ed è relativamente economica, grazie alla facile accessibilità di strumenti come il lettore ELISA. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione citochina-recettore, può anche essere applicato ad altri sistemi come le interazioni generali proteina-proteina e la progettazione di composti di blocco per inibire le interazioni specifiche. Preparare le soluzioni come descritto nel protocollo di testo.

Assicurati di filtrare il tampone di rivestimento al carbonato con una membrana PES da 0,22 micron. Usa un vuoto. Inoltre, prepara 10 diverse concentrazioni di ciascun ligando o peptide.

Ci sono due saggi descritti in questo video, il primo è l'interazione diretta ligando-recettore, ELISA. Può essere utilizzato per misurare la costante di disassociazione ligando-recettore, che rappresenta l'affinità di legame ligando-recettore. Il secondo saggio è un ELISA recentemente ottimizzato per l'interazione competizione ligando-recettore.

Questo permette lo screening di peptidi e altri composti di blocco, che agiscono per interferire con l'interazione ligando-recettore. Per l'efficienza, preparati a utilizzare pipette multicanale per piastre a 96 pozzetti e, quando decanti, scarica semplicemente il loro contenuto. Inizia questa procedura rivestendo la piastra con un recettore ricombinante.

Per prima cosa, diluisci il recettore nel tampone al carbonato a 100 nanogrammi per microlitro. Quindi, carica i pozzetti della piastra con 100 microlitri di soluzione del recettore. Escludi le pareti esterne per evitare di dover affrontare l'artefatto del bordo della piastra.

Copri la piastra e incubala a 4 gradi Celsius durante la notte. Esegui tutte le incubazioni della piastra con un delicato scuotimento. Il giorno successivo, rimuovi la soluzione di rivestimento e lava la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio, PBS con un tocco di Tween 20.

Successivamente, blocca i siti di legame recettoriale liberi aggiungendo 200 microlitri di 5%PSA. Lascia incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente per completare il blocco. Successivamente, svuota i pozzetti e lava la piastra come prima.

Ora, carica i pozzetti con 100 microlitri delle varie diluizioni del ligando ricombinante con tag-his. Carica ogni concentrazione in duplicato. Carica i pozzetti vuoti con PBS da solo.

Quindi, incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con i ligandi, lava la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio. Quindi, pipetta 100 microlitri di aliquote di anticorpo monoclonale murino anti-his primario in ogni pozzetto e incuba la piastra a temperatura ambiente per due ore.

Dopo aver lavato l'anticorpo, aggiungi a ciascun pozzetto 100 microlitri di soluzione di anticorpo secondario HRP-accoppiato anti-IGG di capra. Avvolgi la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce. Quindi, incuba la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.

Usa la tecnica di lavaggio standard per rimuovere l'anticorpo secondario. Ora, aggiungi a ciascun pozzetto 100 microlitri di TMB fresco preparato da quantità uguali di soluzioni di substrato stock A e B. Quindi, mantieni la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Quindi, dopo un sufficiente sviluppo del colore, aggiungi 50 microlitri di soluzione stock a ciascun pozzetto.

Il protocollo si basa sull'ipotesi che il segnale misurato derivi da un legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo del legame non specifico al segnale. Quindi, leggi i valori di assorbanza della piastra a 450 nanometri e procedi con il calcolo del valore KD.

La procedura LRA di competizione segue gli stessi passaggi della procedura LRA diretta, tranne per alcune importanti modifiche. Dopo aver lavato i ligandi di rivestimento in eccesso dalla piastra, blocca i pozzetti della piastra. Aggiungi 200 microlitri di soluzione di BSA al 5% a ciascun pozzetto e incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente.

Durante l'incubazione, prepara i ligandi ricombinanti con tag-his a una concentrazione fissa di 10 nanogrammi per millilitro in PBS. Quindi, prepara il peptide di blocco a diverse concentrazioni in PBS, che vanno da 10 nanomolari a 100 micromolari per garantire una curva dose-risposta. Pertanto, può essere trovato il valore IC50 per il peptide di blocco.

Nei pozzetti di controllo, carica la concentrazione fissa di ligando senza peptide per ottenere il legame massimo. Nei pozzetti vuoti, aggiungi solo PBS senza ligando o peptide. Negli altri pozzetti, aggiungi 50 microlitri dei ligandi e 50 microlitri di ciascuna concentrazione di peptide.

Quindi, incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente e procedi come al solito. Le costanti di dissociazione tra tre diversi peptidi ligando interferone e il subunità recettoriale IL28R-α sono state determinate utilizzando il LRA diretto, la frazione di siti di legame occupati è rappresentata graficamente rispetto al logaritmo della rispettiva concentrazione di interferone. Questi risultati illustrano una curva di legame che può essere analizzata per stimare il valore KD adattando i dati all'equazione di Hill.

Un grafico di Scatchard illustra la cooperatività nel legame del ligando, alla fine il ligando interferone 1 ha la più alta affinità di legame, seguito dal ligando interferone 2 e dal ligando interferone 3. Il valore del coefficiente di Hill superiore a 1 suggerisce un'affinità aumentata per ligandi aggiuntivi dopo l'interazione iniziale ligando-recettore. Successivamente, l'LRA competitivo è stato utilizzato per quantificare l'impatto di un peptide di blocco sull'interazione tra i peptidi ligando interferone e la subunità recettoriale.

La frazione di siti di legame occupati per un peptide ligando interferone a 10 nanogrammi per millilitro è rappresentata graficamente rispetto al log della concentrazione del peptide interferone. Da questi dati, sono stati stimati i valori IC50. Secondo i valori calcolati, il peptide di blocco ha inibito l'interazione tra il ligando interferone 3 e IL28R-α nella massima misura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore. Se eseguita correttamente. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che ogni concentrazione di saturazione del legame ligando-recettore, seguendo questa procedura, altri metodi possono essere eseguiti per ottenere valori KD più dettagliati.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni ligando-recettore per esplorare sostanze inibitorie per bloccare queste interazioni.