Name: Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri due tecniche ELISA per studiare le interazioni ligando-recettore: determinazione della costante di dissociazione e screening di peptidi bloccanti. Questo metodo accessibile aiuta i ricercatori a comprendere le dinamiche delle interazioni proteiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Prof. J. Stelling (Dipartimento di Scienze e Ingegneria dei Biosistemi, ETH Zurich e Istituto Svizzero di Bioinformatica, Basilea, Svizzera) per la sua revisione critica del manoscritto.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Per preparare un tampone di rivestimento carbonato, sciogliere 0,36 g di Na 2 CO 3 e 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml di acqua distillata; filtro sterile il buffer utilizzando un vuoto spinto 0,22 micron polietersulfone (PES) filtro a membrana e conservare a temperatura ambiente fino a quando l&#39;utilizzo. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio con l&#39;aggiunta di 0,05% v / v Tween 20 in tampone fosfato (PBS). </li><li> Preparare un 5% di sieroalbumina bovina (BSA) (soluzione bloccante) in soluzione PBS sciogliendo 5 g BSA (≥98%) in 100 ml di PBS e conservare a 4 ° C. </li><li> Ricombinante del recettore, leganti e peptidi di blocco <ol><li> Reconstitutethe ricombinante subunità umano recettore dell&#39;interleuchina alfa (IL28RA) e ricombinanti ligandi His-tag di IFN umano (IFNL1-3) secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C. Sintetizzare peptidi blocco e utilizzato come precedentemente descritto 4. Utilizzare PBS per preparare differenti concentrazioni di ligandos e peptidi per l&#39;uso nei saggi. </li></ol></li><li> Per preparare l&#39;anticorpo primario, diluire 6x suo mouse anticorpo monoclonale in PBS con 0,1% BSA a 1: 1000 diluizione. Per preparare l&#39;anticorpo secondario, diluire perossidasi di rafano (HRP) capra coniugato anti-topo IgG (H + L) in PBS con 0,1% BSA a 1: 10.000 diluizione. </li><li> Preparare la soluzione TMB miscelando il reagenti A e B secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare la soluzione di arresto con l&#39;aggiunta di 5 N acido solforico (H 2 SO 4) in acqua distillata e conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 2. immunoenzimatico Assays (ELISA) NOTA: Il diretta interazione ligando-recettore ELISA (Lra diretta, Figura 1) può essere utilizzato per misurare la dissociazione recettore-ligando costante (K D), come misura della affinità di legame del recettore-ligando. L&#39;interazione concorrenza ligando-recettore ELISA (LRA concorrenza, figura 2) tuttoflussi di screening di peptidi (e altri composti di blocco), che agiscono di interferire con l&#39;interazione tra ligando e recettore. Il protocollo di base che è stato precedentemente pubblicato 5 è stata ulteriormente ottimizzata. NOTA: in entrambe ELISA metodi utilizzano pipetta multicanale per l&#39;aggiunta di soluzioni ai pozzetti di 96 pozzetti in ogni passaggio. Nella soluzione decantare o fasi di lavaggio, buttare fuori le soluzioni direttamente nel lavandino. <ol><li> Diretto ligando-recettore-Interaction Assay (LRA continua) NOTA: Per una illustrazione del flusso di lavoro (vedere Figura 1). <ol><li> Piatto del rivestimento con il recettore ricombinante <ol><li> Diluire il recettore ricombinante in tampone carbonato a una concentrazione finale di 100 ng / ml. pozzi mano di 96 pozzetti micropiastra con la concentrazione dei recettori fisso (100 ng / ml) pipettando 100 ul per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Escludere muri esterni della piastra per evitare così artefatto bordo. Coprire la piastra con un coperchio e incubare latarga a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Blocco e aggiunta di leganti <ol><li> Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento inclinando il piatto contro il lavandino e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio (PBS + 0,05% v / v Tween 20). </li><li> Bloccare i siti recettoriali di legame liberi nella piastra rivestita con 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare la soluzione di saturazione (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio. </li><li> Preparare il ricombinante His-tag ligandi a diverse concentrazioni (ad esempio, 8 mg / ml, 4 mg / ml, 2 mg / ml, 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,063 mcg / ml, 0,031 mg / ml, 0,0 mg / ml) in PBS. Aggiungere solo PBS nei pozzetti del bianco. </li><li> Aggiungere 100 ml di ciascuna concentrazione ligando ai pozzetti in duplicato e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente permettendo recettore-ligandointerazione. </li></ol></li><li> L&#39;incubazione con anticorpi <ol><li> Dopo l&#39;incubazione con i ligandi, lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio. </li><li> Dispensare 100 l di suo anti-soluzione principale del mouse anticorpo monoclonale (1: 1.000) in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore; Dopo l&#39;incubazione, scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) e lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio. </li><li> Aggiungere 100 ml di HRP accoppiati capra soluzione di anticorpo secondario anti-topo IgG (1: 10.000) in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scartare la soluzione di anticorpi (vedi punto 2.1.2.1.) E lavare la piastra 3 volte con soluzione di lavaggio. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di substrato e lo Sviluppo <ol><li> Portare le soluzioni del substrato TMB a RT e preparare TMB soluzione di substrato A e B in rapporto 1: 1. Aggiungere 100 ml preparati al momento substrato di ogni bene e mantenere la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Dopo col sufficienti<html> o sviluppo aggiungere la soluzione di arresto 50 ml. </li></ol></li><li> Leggere la piastra e analisi dei dati NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo. <ol><li> Leggere l&#39;assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm. </li><li> Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di ligando in scala logaritmica (base 10, log 10). </li><li> Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala 10). </li><li> Per stimare il valore di K D, inserire i dati per il seguente modulo dell&#39;equazione Hill: tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; NOTA: Qui Y indica la frazione dei siti occupati del recettore di legame e Y max il legame massimo; [L] indica la concentrazione di legante libero e il coefficiente di Hill. Se vi è un solo sito di legame per il ligando, il coefficiente di Hill è n = 1. Per sistemi con più di un ligando sito di legame, l&#39;esposizione vincolanti cooperatività positivo se n&gt; 1, cooperatività negativa se n &lt;1 e non cooperatività se n = 1. la costante di dissociazione microscopica è definito e corrisponde alla metà effettiva concentrazione massima EC 50 6. La costante di dissociazione apparente è K d = (K D) n. Nel caso più semplice in cui n = 1, la dissociazione corrisponde costanti a concentrazione ligando in cui la metà del recettore siti di legame sono occupati e K d = K D. Questo modello assume azione di massa vincolante in condizioni di equilibrio, e che soltanto una piccola frazione diil legante aggiunto è legato al recettore, cioè, [L] &gt;&gt; [RL]. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> Figura 1. saggio diretto ligando-recettore interazione (LRA diretta). Step-by-step di protocollo per LRA diretta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="2"><li> Concorso ligando-recettore-Interaction Assay (competizione LRA) NOTA:. Per un&#39;illustrazione del flusso di lavoro vedi Figura 2 La procedura di concorso LRA segue la stessa procedura come il LRA diretta (rivestimento della piastra, l&#39;incubazione anticorpo, sviluppo targa) ad eccezione di importanti cambiamenti nel legante e peptidi passo oltre. Regolari controlli negativi sono essenziali per questo test. In uno studio di screening precedente &lt;sup&gt; 4, il peptide bloccando strapazzate non ha mostrato effetti antagonisti. <ol><li> Blocco - aggiunta di leganti e peptidi di blocco <ol><li> Il giorno seguente, togliere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra (vedi 2.1.2.1). </li><li> Bloccare la piastra rivestita con l&#39;aggiunta di 200 ml di soluzione di BSA 5% in ogni pozzetto ed incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Preparare i ligandi His-tag ricombinanti (IFNL1-3) ad una concentrazione fissa (2x-20 ng / ml) in PBS. </li><li> Preparare il peptide bloccante (vedi tabella 3) con differenti concentrazioni comprese tra 10 nM e 100 pM in PBS per garantire una curva dose-risposta. NOTA: Ciò consente successiva determinazione del valore IC50 per il peptide di blocco. In pozzetti di controllo, aggiungere concentrazione ligando solo fisso senza peptide di ricavare il massimo (100%) vincolante. Nel vuoto, solo aggiungere PBS senza legante o peptide. </li><li> Aggiungere 50 ml di ligandi (IFNL1-3) e 50 ml di ogni peconcentrazione ptide ai pozzetti di duplicati. </li><li> Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Leggere la piastra e analisi dei dati NOTA: Il protocollo descritto si basa sul presupposto che il segnale misurato sale dal legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo di legame aspecifico al segnale ma questo è fuori della portata di questo protocollo. <ol><li> Leggere l&#39;assorbanza (densità ottica, OD) direttamente a 450 nm. </li><li> Sottrarre il segnale di fondo ai valori della DO misurati e li normalizza. Trasformare tutti i valori della concentrazione di peptide in scala logaritmica (base 10, log 10). </li><li> Tracciare la normalizzata e di fondo corretta valori di OD (asse Y, corrisponde alla frazione di siti di legame del recettore occupati) contro il logaritmo della concentrazione di ligando (asse X, log scala 10). </li><li> Per stimare il valore di IC 50, inserire i dati alla seguente equazione: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> NOTA: Qui [P] è la concentrazione del peptide ed il pendio della collina. La pendenza Hill descrive la pendenza della curva dose-risposta. La IC 50 corrisponde alla concentrazione dell&#39;inibitore alla quale si osserva il 50% di inibizione del legame tra il ligando e recettore. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> Figura 2. Concorrenza ligando-recettore interazione saggio (concorrenza LRA). Step-by-step di protocollo per LRA concorrenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).</li>
<li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other%2C+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li>
<li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation%3A+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li>
<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca del programma "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" dell'Università di Basilea, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel e Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. riconosce il sostegno di una borsa di studio iPhD dell'iniziativa SystemsX.ch nel programma di biologia dei sistemi (9a chiamata).

ELISA è uno standard e il metodo consolidato per molti laboratori. Abbiamo ulteriormente modificato e migliorato un metodo 5,7 precedentemente pubblicato. Il protocollo passo-passo dimostrato mostra come può essere utilizzato in modo semplice per determinare i valori K D di interazioni ligando-recettore. Inoltre, la IC50 di un peptide bloccante che interferisce con l&#39;interazione ligando-recettore può essere determinato. I principali vantaggi sono la rapida messa a p...

Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata circa l&#39;interazione ligando-recettore. La maggior parte dei metodi per valutare l&#39;interazione di un particolare ligando con il recettore specifico sono costosi, in termini di tempo, manodopera e richiedono attrezzature e competenze specifiche 1. Questo articolo descrive due protocolli veloce e affidabile punto per punto per studiare l&#39;interazione ligando-recettore sulla base di un enzima collegato immunosorbent assay (ELISA): il saggio di interazione ligando-recettore diretta (LRA) e l&#39;LRA concorrenza. ELISA è una tecnica molto sensibile, specifico e facilmente disponibile, solitamente usata in quasi ogni laboratorio. ELISA può essere eseguito e adattato in varie mode. I protocolli presentati sono ottimizzati per la ricerca delle interazioni tra i diversi interferoni lambda (INFLs) e la loro recettore. L&#39;LRA diretta consente una quantificatisu ligando-recettore vincolante rispetto alla concentrazione del ligando e produce pertanto una curva vincolante. Usando un modello appropriato per l&#39;interazione ligando-recettore, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la costante di dissociazione (K D). Nel protocollo presentato, l&#39;equazione Hill comunemente usato è applicata per modellare il legame ligando-recettore. Sebbene altri metodi come la superficie plasmon risonanza a 2,3 consentono la determinazione delle affinità di legame tra due proteine, questa tecnologia è spesso laborioso, costoso e richiede attrezzature speciali di laboratorio. L&#39;LRA concorrenza consente la proiezione di peptidi inibitori: il legame ligando-recettore viene quantificata rispetto alla concentrazione di peptide. Questo produce una curva dose-risposta che descrive l&#39;effetto inibitorio del peptide. I dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare la metà massima concentrazione inibitoria (IC 50 </sub&gt;) del peptide bloccante. Entrambi protocolli ELISA sono facili da usare e possono essere adattati ad una vasta gamma di domande di ricerca. proteine ​​ricombinanti di qualsiasi tipo possono essere utilizzati per determinare in modo affidabile e veloce le parti di interazione. Inoltre, l&#39;Lra concorrenza può essere utilizzato per determinare siti di interazione critici di ligandi e recettori utilizzando peptidi di blocco, che sono progettati per imitare sia il ligando o il recettore. Se il peptide bloccante mostra l&#39;inibizione efficace e specifico, il peptide occupa un sito critico interazione del ligando (se imita peptidici del recettore) o del ligando (se imita peptide ligando). Il primo protocollo descrive la determinazione K D valore delle diverse INFLs e la subunità alfa del loro recettore, cioè il recettore dell&#39;interleuchina-28 (IL28RA) usando l&#39;LRA diretta. Successivamente, il secondo protocollo mostra come determinare la capacità di un lungo peptide di 20 aminoacidi diinibire le interazioni INFL-IL28RA. Il peptide è stato progettato per competere con IFNLs al loro recettore sito di legame e consente così una comprensione molecolare dell&#39;interazione. Inoltre, questo peptide può essere utilizzato per bloccare IL28RA in esperimenti in vitro per determinare l&#39;impatto sugli effetti di segnalazione a valle 4.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>Piastra ELISA</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>Per buffer di rivestimento della piastra ELISA</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>Per buffer di rivestimento della piastra ELISA</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>5% BSA in PBS per il bloccaggio</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Recombinative interleuchina umana-28 Ricevitore alfa</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Recombinative interleuchina umana-29/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Recombinative interleuchina umana-28A/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Recombinative interleuchina umana-28B/Senza vettore/Tag 6-His in coda terminale</td></tr><tr><td>6x His Monoclonal antibody (Mouse)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Anticorpo primario per catturare i ligandi con tag His</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>Anticorpo secondario coniugato con Perossidasi di rafano</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reagent set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>Soluzione di substrato TMB per ELISA</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>H2SO4 5 N (Soluzione per arrestare la reazione enzimatica)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Microplate reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>Lettore di piastre ELISA</td></tr></tbody></table>

un elisa based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Una comprensione completa delle vie di segnalazione richiede una conoscenza dettagliata dell'interazione ligando-recettore. Questo articolo descrive due protocolli rapidi e affidabili punto per punto di enzimoimmunoassay (ELISA) per l'indagine delle interazioni ligando-recettore: il saggio diretto di interazione ligando-recettore (LRA) e il LRA di competizione. Come caso di studio, viene presentata l'analisi basata su ELISA dell'interazione tra diversi interferoni lambda (IFNL) e la subunità alfa del loro recettore (IL28RA): il LRA diretto viene utilizzato per la determinazione delle costanti di dissociation (valori KD) tra il recettore e i ligandi IFN, e il LRA di competizione per la determinazione della capacità inibitoria di un oligopeptide, progettato per competere con gli IFNL sul loro sito di legame recettore. Vengono descritte le fasi analitiche per stimare i valori KD e la concentrazione inibitoria mediana (IC50). Infine, la discussione evidenzia i vantaggi e gli svantaggi del metodo presentato e come i risultati permettano una migliore comprensione molecolare delle interazioni ligando-recettore.

Le costanti di dissociazione tra INFL1-3 e loro recettore subunità alfa IL28RA sono stati determinati utilizzando il LRA diretta. I risultati sono mostrati in Figura 3: La frazione dei siti di legame occupati è tracciata contro il logaritmo della rispettiva concentrazione di IFN. La trama Scatchard dei dati è mostrata nell&#39;angolo in basso a destra. I risultati illustrano che l&#39;Lra diretta produce una curva di legame, che può essere ulteriormente analizzati per st...

I protocolli presentati descrivono due tecniche basate su enzimoimmunosaggio (ELISA) per l'indagine rapida delle interazioni ligando-recettore: Il primo dosaggio permette la determinazione della costante di dissociazione tra ligando e recettore. Il secondo dosaggio consente una rapida analisi di screening dei peptidi di bloccaggio per le interazioni ligando-recettore.

Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Gli obiettivi di questo metodo basato sull'ELISA sono in primo luogo determinare l'affinità di legame di una citochina al suo recettore e in secondo luogo, misurare gli effetti di blocco dei peptidi inibitori dell'interazione ligando-recettore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni proteina-proteina, come il legame citochina-recettore. Le affinità di legame e il blocco di queste possono aumentare la comprensione generale della dinamica delle interazioni.Il principale vantaggio di questa tecnica è che è facile da eseguire, genera recettori etichettati ed è relativamente economica, grazie alla facile accessibilità di strumenti come il lettore ELISA. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione citochina-recettore, può anche essere applicato ad altri sistemi come le interazioni generali proteina-proteina e la progettazione di composti di blocco per inibire le interazioni specifiche. Preparare le soluzioni come descritto nel protocollo di testo.Assicurati di filtrare il tampone di rivestimento al carbonato con una membrana PES da 0,22 micron. Usa un vuoto. Inoltre, prepara 10 diverse concentrazioni di ciascun ligando o peptide.Ci sono due saggi descritti in questo video, il primo è l'interazione diretta ligando-recettore, ELISA. Può essere utilizzato per misurare la costante di disassociazione ligando-recettore, che rappresenta l'affinità di legame ligando-recettore. Il secondo saggio è un ELISA recentemente ottimizzato per l'interazione competizione ligando-recettore.Questo permette lo screening di peptidi e altri composti di blocco, che agiscono per interferire con l'interazione ligando-recettore. Per l'efficienza, preparati a utilizzare pipette multicanale per piastre a 96 pozzetti e, quando decanti, scarica semplicemente il loro contenuto. Inizia questa procedura rivestendo la piastra con un recettore ricombinante.Per prima cosa, diluisci il recettore nel tampone al carbonato a 100 nanogrammi per microlitro. Quindi, carica i pozzetti della piastra con 100 microlitri di soluzione del recettore. Escludi le pareti esterne per evitare di dover affrontare l'artefatto del bordo della piastra.Copri la piastra e incubala a 4 gradi Celsius durante la notte. Esegui tutte le incubazioni della piastra con un delicato scuotimento. Il giorno successivo, rimuovi la soluzione di rivestimento e lava la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio, PBS con un tocco di Tween 20.Successivamente, blocca i siti di legame recettoriale liberi aggiungendo 200 microlitri di 5%PSA. Lascia incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente per completare il blocco. Successivamente, svuota i pozzetti e lava la piastra come prima.Ora, carica i pozzetti con 100 microlitri delle varie diluizioni del ligando ricombinante con tag-his. Carica ogni concentrazione in duplicato. Carica i pozzetti vuoti con PBS da solo.Quindi, incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con i ligandi, lava la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio. Quindi, pipetta 100 microlitri di aliquote di anticorpo monoclonale murino anti-his primario in ogni pozzetto e incuba la piastra a temperatura ambiente per due ore.Dopo aver lavato l'anticorpo, aggiungi a ciascun pozzetto 100 microlitri di soluzione di anticorpo secondario HRP-accoppiato anti-IGG di capra. Avvolgi la piastra con un foglio di alluminio per evitare la luce. Quindi, incuba la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.Usa la tecnica di lavaggio standard per rimuovere l'anticorpo secondario. Ora, aggiungi a ciascun pozzetto 100 microlitri di TMB fresco preparato da quantità uguali di soluzioni di substrato stock A e B. Quindi, mantieni la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Quindi, dopo un sufficiente sviluppo del colore, aggiungi 50 microlitri di soluzione stock a ciascun pozzetto.Il protocollo si basa sull'ipotesi che il segnale misurato derivi da un legame specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo del legame non specifico al segnale. Quindi, leggi i valori di assorbanza della piastra a 450 nanometri e procedi con il calcolo del valore KD.La procedura LRA di competizione segue gli stessi passaggi della procedura LRA diretta, tranne per alcune importanti modifiche. Dopo aver lavato i ligandi di rivestimento in eccesso dalla piastra, blocca i pozzetti della piastra. Aggiungi 200 microlitri di soluzione di BSA al 5% a ciascun pozzetto e incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente.Durante l'incubazione, prepara i ligandi ricombinanti con tag-his a una concentrazione fissa di 10 nanogrammi per millilitro in PBS. Quindi, prepara il peptide di blocco a diverse concentrazioni in PBS, che vanno da 10 nanomolari a 100 micromolari per garantire una curva dose-risposta. Pertanto, può essere trovato il valore IC50 per il peptide di blocco.Nei pozzetti di controllo, carica la concentrazione fissa di ligando senza peptide per ottenere il legame massimo. Nei pozzetti vuoti, aggiungi solo PBS senza ligando o peptide. Negli altri pozzetti, aggiungi 50 microlitri dei ligandi e 50 microlitri di ciascuna concentrazione di peptide.Quindi, incuba la piastra per due ore a temperatura ambiente e procedi come al solito. Le costanti di dissociazione tra tre diversi peptidi ligando interferone e il subunità recettoriale IL28R-α sono state determinate utilizzando il LRA diretto, la frazione di siti di legame occupati è rappresentata graficamente rispetto al logaritmo della rispettiva concentrazione di interferone. Questi risultati illustrano una curva di legame che può essere analizzata per stimare il valore KD adattando i dati all'equazione di Hill.Un grafico di Scatchard illustra la cooperatività nel legame del ligando, alla fine il ligando interferone 1 ha la più alta affinità di legame, seguito dal ligando interferone 2 e dal ligando interferone 3. Il valore del coefficiente di Hill superiore a 1 suggerisce un'affinità aumentata per ligandi aggiuntivi dopo l'interazione iniziale ligando-recettore. Successivamente, l'LRA competitivo è stato utilizzato per quantificare l'impatto di un peptide di blocco sull'interazione tra i peptidi ligando interferone e la subunità recettoriale.La frazione di siti di legame occupati per un peptide ligando interferone a 10 nanogrammi per millilitro è rappresentata graficamente rispetto al log della concentrazione del peptide interferone. Da questi dati, sono stati stimati i valori IC50. Secondo i valori calcolati, il peptide di blocco ha inibito l'interazione tra il ligando interferone 3 e IL28R-α nella massima misura.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore. Se eseguita correttamente. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che ogni concentrazione di saturazione del legame ligando-recettore, seguendo questa procedura, altri metodi possono essere eseguiti per ottenere valori KD più dettagliati.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni ligando-recettore per esplorare sostanze inibitorie per bloccare queste interazioni.

an-elisa-based-binding-competition-method-to-rapidly-determine-ligand

Research

Ricerca

JoVE Journal

Chemistry

Chimica

In questo video, dimostriamo la tecnologia dell'interferometria a biostrato (BLI) per rilevare le interazioni intermolecolari tra ligandi e analiti bersaglio in tempo reale. Il BLI misura i cambiamenti nel modello di interferenza della luce bianca riflessa da uno strato di ligandi immobilizzati sulla superficie di un biosensore mentre interagiscono con gli analiti in soluzione.

Tecnologia di interferometria a biostrati per rilevare le interazioni tra ligando e analita

In questo video, descriviamo un saggio di legame competitivo basato sulla citometria a flusso per rilevare le interazioni tra il recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) e il suo ligando naturale marcato in fluorescenza CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in presenza di una piccola molecola mirata a CXCR4. L'incubazione di cellule che esprimono CXCR4 con concentrazioni più basse di piccole molecole consente in una certa misura il legame CXCR4-CXCL12, che diminuisce progressivamente con un aumento...

Saggio di legame competitivo per identificare i composti che interrompono le interazioni recettore-ligando

Questo video dimostra il rilevamento basato sul test reporter dell'interazione recettore-ligando. L'interazione recettore-ligando attiva la via di segnalazione a valle, causando la generazione e il rilascio di citochine come molecole reporter secretorie nella soluzione, che viene confermata mediante ELISA.

Saggio reporter basato su ELISA per studiare l'interazione recettore-ligando nelle cellule BW

In questo video, le sonde di forza a biomembrana (BFP) vengono utilizzate per misurare le forze tra recettori e ligandi. Questa tecnica è in grado di rilevare le interazioni monitorando la pressione necessaria per rompere i legami tra il pMHC coniugato sulle perle della sonda e i TCR sulle cellule bersaglio.

Sonda di forza biomembrana per quantificare le interazioni recettore-ligando

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Viene presentato un protocollo per lo screening di piccoli farmaci molecolari basato sulla sintesi in situ di nanocluster d'oro fluorescenti ultrapiccoli (Au NCs) utilizzando proteine caricate con farmaci come modello. Questo metodo è semplice per determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio mediante un segnale fluorescente visibile emesso dalle NC Au modellate con proteina.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

Un protocollo dettagliato per eseguire una titolazione ELISA è descritto. Inoltre, un algoritmo di romanzo è presentato per valutare titolazione ELISAs e ottenere una costante di dissociazione di legame di un ligando solubile ad un recettore di immobilizzato piastra di microtitolo.

Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore

Proteine ​​leganti ghiaccio (IBPs), noto anche come proteine ​​antigelo, inibiscono la crescita di ghiaccio e sono un additivo promettente per l'uso nella crioconservazione dei tessuti. Lo strumento principale utilizzato per indagare IBPs è il osmometro nanolitri. Abbiamo sviluppato una casa progettata fase di raffreddamento montato su un microscopio ottico e controllato utilizzando un custom-built routine di LabVIEW. Il osmometro nanolitri qui descritto manipolato la temperatura del campione...

LabVIEW a comando nanolitri osmometro Novel per le indagini Protein Ice rilegatura

Le proteine antigelo (AFP) si legano a specifici piani di ghiaccio per prevenire o rallentare la crescita del ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una modifica del metodo originale di incisione del ghiaccio per la determinazione dei piani di ghiaccio legati all'AFP. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente, incorporati in cristalli di ghiaccio singoli macroscopici e visualizzati sotto la luce UV.

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Scopri due tecniche ELISA per studiare le interazioni ligando-recettore: determinazione della costante di dissociazione e screening di peptidi bloccanti. Questo metodo accessibile aiuta i ricercatori a comprendere le dinamiche delle interazioni proteiche.

Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

Esplora altri video