Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

I protocolli presentati descrivono due tecniche basate su test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per l'indagine rapida delle interazioni ligando-recettore: Il primo test consente la determinazione della costante di dissociazione tra ligando e recettore. Il secondo test consente uno screening rapido dei peptidi bloccanti per le interazioni ligando-recettore.

Gli obiettivi di questo metodo basato su ELISA sono in primo luogo determinare l'affinità di legame di una citochina al suo recettore e, in secondo luogo, misurare gli effetti di blocco dei peptidi inibitori dell'interazione ligando-recettore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni proteina-proteina, come il legame citochine-recettore. Le affinità di legame e il blocco di queste possono aumentare la comprensione generale delle dinamiche di interazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire, genera recettori di marcatura ed è relativamente economica, grazie al facile accesso di lettori ELISA prontamente disponibili. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione del recettore delle citochine, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le interazioni generali proteina-proteina e la progettazione di composti bloccanti per inibire le interazioni specifiche. Preparare le soluzioni come descritto nel protocollo di testo.

Assicurati di filtrare il tampone di rivestimento in carbonato con una membrana PES da 0,22 micron. Usa un aspirapolvere. Inoltre, crea 10 diverse concentrazioni di ciascun ligando o peptide.

Ci sono due saggi descritti in questo video, il primo è l'interazione diretta del recettore del ligando, ELISA. Può essere utilizzato per misurare la costante di dissociazione recettore-ligando, che rappresenta l'affinità di legame recettore-ligando. Il secondo test è un ELISA di interazione ligando-recettore di competizione recentemente ottimizzato.

Ciò consente lo screening di peptidi e altri composti bloccanti, che agiscono interferendo con l'interazione recettore-ligando. Per motivi di efficienza, è necessario utilizzare pipette multicanale per piastre a 96 pozzetti e, durante la decantazione, è sufficiente scaricare il contenuto. Iniziare questa procedura rivestendo la piastra con un recettore ricombinante.

Innanzitutto, diluire il recettore in tampone carbonato a 100 nanogrammi per microlitro. Quindi, caricare i pozzetti della piastra con 100 microlitri di soluzione recettoriale. Escludere le pareti esterne per evitare di avere a che fare con l'artefatto del bordo della piastra.

Coprire la piastra e incubarla a 4 gradi Celsius per una notte. Eseguire tutte le incubazioni su piastra con un leggero vortice. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare la lastra tre volte con la soluzione di lavaggio, PBS con un tocco di Tween 20.

Successivamente, bloccare i siti di legame del recettore libero aggiungendo 200 microlitri di PSA al 5%. Lasciare incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente per completare il blocco. Successivamente, svuotare i pozzetti e lavare la piastra come prima.

Ora, caricare i pozzetti con 100 microlitri delle varie diluizioni del ligando his-tag ricombinante. Caricare ogni concentrazione in duplicato. Caricare i pozzetti vuoti con il solo PBS.

Quindi, incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con i leganti, lavare la piastra tre volte con soluzione di lavaggio. Quindi, pipettare 100 microlitri di aliquote di anticorpo monoclonale primario anti-HIS di topo in ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore.

Dopo aver lavato via l'anticorpo, aggiungere a ciascun pozzetto 100 microlitri di soluzione di anticorpi secondari IGG di capra accoppiata a HRP. Avvolgere il piatto con un foglio di alluminio per evitare la luce. Quindi, incubare la piastra per 45 minuti a temperatura ambiente.

Utilizzare la tecnica di lavaggio standard per rimuovere l'anticorpo secondario. Ora, a ciascun pozzetto, aggiungere 100 microlitri di TMB appena preparato composto da quantità uguali di soluzioni di substrato madre A e B.Quindi, mantenere la piastra a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Quindi, dopo un sufficiente sviluppo del colore, aggiungere 50 microlitri di soluzione madre a ciascun pozzetto.

Il protocollo si basa sul presupposto che il segnale inviato dal messaggio derivi da un binding specifico. Potrebbe essere necessario stimare il contributo del legame non specifico al segnale. Quindi, leggere i valori di assorbanza della piastra a 450 nanometri e procedere con il calcolo del valore KD.

La procedura di aggiudicazione degli enti locali di gara segue le stesse fasi della procedura di aggiudicazione diretta degli enti pubblici, ad eccezione di alcune importanti modifiche. Dopo aver lavato via i leganti di rivestimento in eccesso dalla piastra, ostruire i pozzetti della piastra. Aggiungere 200 microlitri di soluzione al 5% di BSA in ogni pozzetto e incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente.

Durante l'incubazione, preparare i ligandi his-tag ricombinanti a una concentrazione fissa di 10 nanogrammi per millilitro in PBS. Quindi, preparare il peptide bloccante a diverse concentrazioni in PBS, che vanno da 10 nanomolari a 100 micromolari per garantire una curva dose-risposta. Pertanto, è possibile trovare il valore IC50 per il peptide bloccante.

Nei pozzetti di controllo, caricare la concentrazione fissa del ligando senza peptide per derivare il massimo legame. Nei pozzetti vuoti, aggiungere solo PBS senza ligando o peptide. Negli altri pozzetti, aggiungere 50 microlitri di ligandi e 50 microlitri di ogni concentrazione di peptidi.

Quindi, incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente e procedere come al solito. Le costanti di dissociazione tra tre diversi peptidi ligando dell'interferone e la subunità alfa del recettore IL28R-a sono state determinate utilizzando l'LRA diretto, la frazione dei siti di legame occupati è tracciata rispetto al logaritmo della rispettiva concentrazione di interferone. Questi risultati illustrano una curva di legame che può essere analizzata per stimare il valore KD adattando i dati all'equazione di Hill.

Un diagramma di Scatchard illustra la cooperatività nel legame del ligando, in definitiva il ligando dell'interferone 1 ha la più alta affinità di legame, seguito dal ligando dell'interferone 2 e dal ligando dell'interferone 3. Il valore del coefficiente di Hill superiore a 1 suggerisce una maggiore affinità per ligandi aggiuntivi dopo l'interazione iniziale del recettore del ligando. Successivamente, l'LRA competitivo è stato utilizzato per quantificare l'impatto di un peptide bloccante sull'interazione tra i peptidi ligando dell'interferone e la subunità recettoriale.

La frazione dei siti di legame occupati per un peptide ligando dell'interferone a 10 nanogrammi per millilitro è tracciata rispetto al log della concentrazione del peptide dell'interferone. Da questi dati sono stati stimati i valori IC50. Secondo i valori calcolati, il peptide bloccante ha inibito al massimo l'interazione tra il ligando 3 dell'interferone e IL28R-a.

Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in otto ore. Se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni concentrazione di saturazione del legame del recettore del ligando, seguendo questa procedura, gli altri metodi possono essere eseguiti per ottenere valori di KD più dettagliati.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni ligando-recettore per esplorare sostanze inibitorie per bloccare queste interazioni.