Name: Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Scopri l'imaging super-risoluzione dell'anello Z citocinetico in batteri vivi usando la microscopia f3D-SIM. Questo metodo rivela la dinamica della proteina FtsZ durante la divisione cellulare batterica.

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Gli autori ringraziano P. Levin, S. Moriya, S. Foster e M. Pinho per il dono di ceppi e anticorpi. Ringraziano anche L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper e B. Dougherty per l'assistenza tecnica esperta. CBW è supportata da una borsa di studio (571905 dell'Australian National Health and Medical Research Council). LT è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato UTS Chancellors. MPS e ATFL sono stati supportati dagli Australian Postgraduate Awards. Questo lavoro è stato sostenuto da un Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) a EJH.

Preparazione del campione 1 <ol><li> Preparazione di B. Le cellule subtilis for Imaging <ol><li> Inoculare 10 ml di Penassay Broth (PAB, noto anche come antibiotico Medio 3) con una singola colonia di B. subtilis ceppo SU570 (168 TRPC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crescere durante la notte in una bassa velocità (100 rpm) agitatore a 30 ° C. </li><li> Diluire la cultura durante la notte di 0,05 A 600 (assorbanza misurata a 600 nm) in PAB fresco a 30 ° C con l&#39;alta velocità (215 rpm) agitando e crescere fino alla fase di mid-esponenziale (A 600 ~ 0,4). </li><li> Aggiungere 2 g di agarosio elettroforesi-grade in 100 ml 1x terreno di crescita (PAB) in una bottiglia di vetro con tappo a vite. Sciogliere l&#39;agarosio in autoclave. Questo può essere conservato a 4 ° C per un paio di mesi, e cotto al microonde per sciogliere l&#39;agarosio quando richiesto. Lasciare impostare a temperatura ambiente. </li><li> Applicare una cornice adesiva (65 microlitri, vedi Tabella dei Materiali) su una GLA di seriess vetrino da microscopio. A tale scopo, rimuovere il foglio di poliestere sottile (ogni frame adesivo è disposto tra due fogli di poliestere, uno sottile e uno spessore, e ha il centro quadrato rimosso) e applicare la superficie adesiva esposta del telaio alla superficie del vetrino del microscopio. Questo crea effettivamente un pozzo quadrato sulla parte superiore della diapositiva. Lasciare il foglio di poliestere di spessore fissato al telaio in modo da evitare il coprioggetto attenersi ad esso nei passaggi successivi. </li><li> Sciogliere la soluzione di agarosio in un forno a microonde fino ad ebollizione e pipetta 67 microlitri nel telaio adesivo. Posizionare immediatamente un coprioggetto sulla parte superiore per creare una superficie piana e lasciare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Rimuovere il vetrino per 1-2 minuti mentre il campione è raccolto. </li><li> Raccolto un&#39;aliquota 1 ml del campione e centrifugare a 5.900 xg per 30 sec. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml fresco PAB. </li><li> Prendete 2,5 ml di campione concentrato e pipetta su un pre-preparosso pad agarosio. Stendere il campione uniformemente lungo la superficie piana del pad agarosio. Rimuovere il telaio adesivo dal vetrino da microscopio con una pinzetta, pur non toccando il pad agarosio. </li><li> Trasferire il pad agarosio dal vetrino da microscopio di un piatto Petri diametro 35 mm, con fondo di vetro coprioggetto. Invertire il pad agarosio in modo che la sospensione cellulare e coprioggetto della piastra Petri sono in contatto diretto con l&#39;altro. Il fondo della capsula Petri ha un indice di rifrazione di 1,525 per immagini ad alta risoluzione. </li></ol></li><li> Preparazione del live S. Celle aureus for Imaging <ol><li> Seminare 10 ml di L-brodo con una singola colonia di S. aureus ceppo SA94 (SH1000 contenente aratro-FtsZ-GFP e pGL485; Erm r, Cm r) 25. Crescere durante la notte in una bassa velocità (100 rpm) agitatore rotante a 37 ° C. </li><li> Diluire la cultura durante la notte di 0,05 A 600 (assorbanza misurata a 600 nm) in fresco L-brodo con 0,05 mM IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) per indurre la produzione della proteina di fusione. </li><li> Incubare a 37 ° C ad alta velocità (215 rpm) agitando e crescere fino alla fase di mid-esponenziale (A 600 ~ 0,4). </li><li> Seguire i punti 1.1.3 - 1.1.8 come descritto per B. subtilis preparazione live-cella. Nota: Aggiungere la concentrazione appropriata induttore alla soluzione di agarosio al punto 1.1.3 per i ceppi che esprimono una proteina di fusione fluorescente sotto controllo inducibile. </li></ol></li></ol> 2 Preparazione del microscopio Questo metodo utilizza un sistema di imaging DeltaVision OMX (microscopio ottico, sperimentale) 3D-SIM dotato di un modulo di Blaze. Per gli esperimenti descritti, si utilizzano solo una laser e una telecamera. L&#39;illuminazione e il percorso della luce sono descritti in Figura 1. Questo metodo presuppone che il microscopio ha calibrazione appropriato, funzione di trasferimento ottico (OTF)file e luce manutenzione collimazione eseguite. <ol><li> Per gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, assicurarsi che la fase di riscaldamento è collegato alla fase ceramica e il collare dell&#39;obiettivo-riscaldamento è collegato all&#39;obiettivo (60X 1.42 oggettiva olio NA). </li><li> Attivare i riscaldatori oggettivi e stage di almeno 4 ore prima di imaging e lentamente rampa la temperatura al valore desiderato ad una velocità massima di 5 ° C / h. Si raccomanda di avviare questo processo la sera prima di imaging e rampa a 3 ° C / 4 ore. Per gli esperimenti dal vivo con cellule B. subtilis, la maggior parte degli esperimenti vengono eseguiti a 30 ° C. Per S. aureus, tutti gli esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, attivare il sistema di almeno 1 ora prima di imaging per consentire al sistema e laser per stabilizzare completamente. Caricare il piccolo inserto palco piatto sul palco riscaldato per preriscaldare. <ol><li> Accendere la workstation controller master. </li><li> Accendere il workstat elaborazione delle immaginiione. </li><li> Accendere il dispositivo di raffreddamento fotocamera si trova sul pavimento fuori del recinto microscopio. </li><li> Accendere tutte le telecamere sCMOS (anche se non saranno tutti utilizzati). </li><li> All&#39;interno del recinto laser ed elettronica, attivare: <ol><li> Instrument Controller telaio. </li><li> Nanomotion telaio. </li><li> Regolatore di Jena per Z piezo. </li><li> Tutti i controller del motore 4 galvo. </li><li> Modulo di controllo laser primario. </li><li> Modulo di controllo laser secondaria. </li><li> Tutte le stazioni di lavoro della macchina fotografica. </li><li> Workstation OMXIC. </li></ol></li><li> Sulla workstation controller master, aprire il software OMX facendo clic sull&#39;icona. Impostare il percorso del file per salvare i dati in una cartella di dati appropriato. </li><li> Per inizializzare l&#39;hardware, andare al menu Hardware, scegliere Hardware e fare clic sul pulsante Riavvia hardware. Chiudere la finestra. </li><li> Avviare il Softworx software.Turn sui laser necessari per gli esperimenti (488 nm). </li><li> Accendere l&#39;interruttore a chiave per il blocco di sicurezza laser. </li><li> Assicurarsi che il cassetto del filtro dicroico corretta viene inserita sotto l&#39;obiettivo. Per GFP, è lo standard (o fisso) cassetto. </li><li> In OMX SF, andare al menu File, scegliere Impostazioni e selezionare il cassetto fisso dal menu a discesa cassetto. Chiudere la finestra. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni dalla schermata principale del software, nella sezione Parametri di luce: <ol><li> Attivare la fotocamera appropriata per il laser di eccitazione e filtro per le emissioni (FITC) fotocamera dalla selezione del canale. </li><li> Controllare la modalità immagine è impostata su Sequenziale. </li><li> Controllare il percorso della luce è impostato su SI. </li><li> Controllare la modalità è impostata a 95 MHz. </li><li> Controllare il laser 488 viene selezionato in eccitazione. </li><li> Impostare il <strong&gt; Dimensioni di 512 x 512 per la dimensione della finestra e la categorizzazione di 1 x 1. </li></ol></li><li> Nella scheda Experiment, assicurarsi Type è impostato su SI dal menu a discesa. </li><li> Assicurarsi sezionamento viene attivata e che la spaziatura sezione ottica è impostata su 0.125. </li><li> Assicurarsi che il punto di messa a fuoco quando inizia la scansione è centrale. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Applicare una goccia di olio sulla parte superiore dell&#39;obiettivo. Per i 37 ° C, l&#39;olio iniziale raccomandata ha un indice di rifrazione di 1.518 per abbinare meglio l&#39;indice di rifrazione del pad gel utilizzato per montare le cellule batteriche a 37 ° C (fare riferimento al punto 1.1.3). </li><li> Porre la capsula di Petri campione contenente le cellule preparate nel riquadro palco e coprire con il coperchio di riscaldamento circolare. Abbassare il palco finché l&#39;olio tocca il fondo dila piastra di Petri campione. </li><li> Lasciare il piatto per riscaldare-equilibrare per 15 minuti nella fase. Utilizzando una bassa impostazione Esposizione di 5 msec o meno (che si trova nella sezione Parametri Luce), si concentrano sul campione utilizzando i comandi di posizionamento nano stadio (DZ, si trova nella sezione Nano di posizionamento). Primo su e giù attraverso il campione per determinare se la luce si diffonde in modo uniforme sopra e sotto il piano focale del campione. Se la funzione del punto di diffusione è nemmeno (aberrazione sferica), pulire il fondo del piatto del campione e l&#39;obiettivo con cloroformio. Cambiare l&#39;olio e ripetere questo passaggio fino a quando viene trovata una corrispondenza adeguata tra l&#39;indice di rifrazione del petrolio e del campione per ridurre al minimo l&#39;aberrazione sferica. </li><li> Utilizzo di 0,5 micron dimensioni passo dZ, segnare la parte superiore e inferiore della pila di immagini. Tornare alla metà del campione. Fare clic sul pulsante Get spessore nella scheda Experiment per impostare lo spessore di acquisizione del campione. Keep l&#39;altezza del camino al minimo pur facendo attenzione a non tagliare la parte superiore e inferiore dello Z-ring. Spessori tipici per B. campioni subtilis sono 2-3 micron. </li><li> Determinare il valore massimo di intensità (Max) dell&#39;immagine del campione con le impostazioni di esposizione e% T attuali. Questo valore si trova sotto la finestra dell&#39;immagine. Per time-lapse imaging, regolare l&#39;esposizione e% T per ottenere un&#39;intensità massima di 1.100-1.400 sopra sfondo per l&#39;immagine. È necessaria una intensità minima di 1.000 sopra sfondo per ottenere la ricostruzione dell&#39;immagine. Per un&#39;immagine di una tantum, aumentare l&#39;intensità massima di 4.000-5.000. </li><li> Attivare la sezione Time-lapse nella scheda Experiment. Impostare il frame rate desiderato e il tempo totale. In File di dati, immettere un nome di file appropriato. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Nota: acquisizione immagine è completa quando il green Barra di avanzamento è finito e viene visualizzato un file di log per il set di dati nella cartella di dati appropriato. </li></ol> 4 Controllo di qualità dei dati <ol><li> All&#39;inizio dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine, nota del valore massimo di intensità dell&#39;immagine all&#39;inizio dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine per il primo fotogramma della serie temporale. Al termine dell&#39;acquisizione del primo telaio, controllare che non vi è stato più di una riduzione del 10% dell&#39;intensità del segnale attraverso il z-stack di questo primo fotogramma. Se vi è stato più di questo livello di photobleaching nel primo punto temporale, i dati attraverso la serie storica sarà di qualità insufficiente per l&#39;analisi e l&#39;acquisizione della serie volte può essere fermato. </li><li> Al termine dell&#39;acquisizione delle serie temporali, aprire il file immagine raw risultante con .dv suffisso e accertare la diminuzione di intensità massima del segnale dall&#39;inizio delle serie temporali per l&#39;immagine finale. Eliminare eventuali punti di tempo in cui ci deve apen oltre il 30% photobleaching. </li></ol> 5. immagini Ricostruzione 3D-SIM <ol><li> Dal menu Processo, attivare la finestra SI ricostruzione. Utilizzare le impostazioni preesistenti per tutti i parametri. </li><li> Attivare il pulsante OTF specifico uso del canale, e impostare il set di filtri standard. Attivare l&#39;uso specifico del canale pulsante KO angoli e impostato il set di filtri standard. </li><li> Trascinare il grezzo (.dv) il file nello spazio file di input. Fare clic su Esegui. Il file di output avrà lo stesso nome del file di input con _SI aggiunto alla fine. Nota: Questo processo di ricostruzione può essere eseguito come un compito utilizzando la funzione Task Builder dal menu Processo, se più file devono essere elaborati. </li></ol> 6. Esportazione dati e analisi <ol><li> Utilizzare Imaris di visualizzare immagini in 3D in modalità ed ex superaredati di immagine porta come tiff (300 dpi) o file avi (senza compressione). Misure di formato in Imaris possono essere eseguite utilizzando lo strumento di misurazione in modalità superare. </li><li> Generazione di grafici 3D di intensità del ring Z dalla 3D-SIM dati di immagine: <ol><li> Esaminare la distribuzione dei FtsZ intorno al ring Z e creare grafici 3D di intensità <ol><li> Aprire un file di immagine 3D per visualizzare i singoli z-fette. Utilizzare lo strumento visualizzatore del volume si trova sotto la scheda menu Visualizza per ritagliare una regione di interesse. </li><li> Inserire il numero di finestra per questa immagine 3D nella finestra di immissione e immettere un nuovo e inutilizzato numero finestra nella finestra di output. Il pulsante di selezione regione sarà disponibile per ritagliare un singolo anello Z di interesse dall&#39;originale 40 × 40 micron campo visivo. </li><li> Regolare l&#39;asse desiderato e il grado di rotazione nella scheda di rotazione. Fare clic sul pulsante Esegui. Scorrere il volume per ottenere la prospettiva desiderata dell&#39;anello Z. </li><li> Utilizzare lo strumento ispettore dati e regolare tha dimensioni colonna / riga per creare una nuova regione di interesse attorno a un anello individuo Z. Fare clic sul centro dell&#39;immagine per posizionare questa nuova regione di interesse. I dati dell&#39;immagine testo è una tabella generata automaticamente che visualizza l&#39;intensità di fluorescenza di ciascun pixel all&#39;interno della regione di interesse. </li><li> Fare clic sul pulsante 3D del grafico per visualizzare inizialmente la trama intensità. </li><li> In alternativa, i dati di immagine di testo possono essere esportati facendo clic sul pulsante Salva dati della tabella nel menu File. </li><li> Copiare i dati di immagine dal file di testo salvato in un nuovo foglio di calcolo. Selezionare tutte le celle all&#39;interno del foglio di calcolo e creare un nuovo grafico 3D Surface. Formattare il grafico plot intensità 3D per la pubblicazione. </li></ol></li><li> Per time-lapse ripetere i passi dati 6.2.1.1 - 6.2.1.7 su ciascuno dei diversi punti temporali del file di immagine 3D. </li></ol></li><li> Monitoraggio intensità media di fluorescenza nel tempo <ol><li> Utilizzare i dati di immagine del testo di tracciare i fluorescenintensità ce nel tempo in una regione di interesse. </li><li> Selezionare le celle che corrispondono alla regione di interesse. </li><li> Calcolare l&#39;intensità media di fluorescenza ad ogni tempo per questa regione di interesse. </li><li> Utilizzare i valori medi di intensità di fluorescenza per generare un grafico a linea separata. </li></ol></li></ol>

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<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
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Questa pubblicazione è sponsorizzata da GE Healthcare.

Fluorescente live-cell imaging è un potente strumento che permette l&#39;osservazione dei cambiamenti dinamici all&#39;interno delle cellule nel corso del tempo. Immagini dal vivo della biologia cellula batterica è stato difficile a causa delle dimensioni piccole cellule e la capacità delle cellule batteriche di sopportare l&#39;esposizione ripetuta alla luce di eccitazione ridotta. F3D-SIM ha ampliato gli strumenti a disposizione per interrogare tutta la biologia cellulare, ma è necessario eseguire attentamente questa tecnica come artefatti possono essere introdotte se mal implementato. Ci sono una serie di considerazioni importanti per il successo nell&#39;uso di questa tecnica. Come è un metodo di imaging di fluorescenza a grande campo che si basa sull&#39;utilizzo della funzione punto diffusione della luce emessa, indice di rifrazione disadattamento e l&#39;aberrazione sferica della luce emessa deve essere evitata per consentire la ricostruzione delle immagini accurate. L&#39;uso di coprioggetto di 0,17 mm di spessore di alta qualità per evitare variazioni di intensità di segnale dovuta al vetro variabilità dello spessore nelle coperturelabbro è altamente raccomandato. E &#39;di fondamentale importanza per valutare attentamente l&#39;aberrazione sferica della luce emessa durante le fasi iniziali di tutti gli esperimenti e regolare l&#39;indice di rifrazione olio per immersione se necessario. Questo può variare da giorno per giorno perché dipende sia dalla temperatura e il montaggio di mezzi / substrato del campione. L&#39;uso dell&#39;olio invertita determina ricostruzione inferiore delle immagini con manufatti come aloni e segnali di eco. Al termine del processo di ricostruzione dell&#39;immagine, per ciascuna fase una misura della qualità della ricostruzione può essere ottenuta con il &quot;best fit per angolo kO&quot; per ogni fase / angolo di illuminazione. Se questo valore è inferiore a 1 per ogni angolo, quindi la qualità del ricostruito molto probabilmente sarà elevato. Se questo valore è superiore a 6, è più probabile che l&#39;immagine ricostruita conterrà manufatti. Artefatti comuni includono i) la comparsa di strisce nell&#39;immagine che corrispondead uno degli angoli della griglia. Ciò può derivare da basso segnale da questo punto di vista griglia; ii) haloing attorno a strutture. Ciò può derivare da livelli molto irregolari di segnale da strutture luminose rispetto alle strutture circostanti, una mancata corrispondenza di indice di rifrazione dell&#39;olio e il campione o può essere dovuto alle strutture presenti nell&#39;immagine essendo troppo amorfa e non contengono abbastanza &quot;struttura&quot; per essere riconosciuto dalla algoritmo; iii) &#39;nido d&#39;ape&#39;, che deriva da un segnale basso di rumore nell&#39;immagine, di solito a causa di elevato segnale di fondo; iv) le strutture che sono allungati / allungate in xy, che possono essere dovuti a rifrazione indice mancata corrispondenza del petrolio e del campione. Questo artefatto è difficile discernere per un utente inesperto. Si raccomanda che i nuovi utenti di consultare un ricercatore esperto SIM per consigli sulla interpretazione delle immagini e analisi quando si inizia ad utilizzare questa tecnica. Come per tutte le fluorescenti esperimenti di imaging live-cella, è importformica bilanciare attentamente l&#39;assorbimento di energia di eccitazione in modo da minimizzare il grado di photobleaching e fototossicità delle cellule con segnale di emissione sufficienti necessarie per ricostruire immagini con artefatto minima. Fotodecolorazione eccessiva (maggiore del 30% in una singola acquisizione z-stack) porterà ad un pattern striping nell&#39;immagine ricostruita. Con l&#39;uso di telecamere sCMOS, immagini super-risoluzione possono essere ricostruiti con successo da immagini RAW con segnale di emissione a partire da 1.000 conteggi sopra sfondo. Questo può consentire di tempi di esposizione molto brevi riducendo fotoscolorimento e consentendo acquisizione rapida per ogni fotogramma. Inoltre aumenta la quantità di tempo tra i fotogrammi per le cellule di recuperare dall&#39;ingresso energia di eccitazione. Inoltre, il tempo di acquisizione per ciascun telaio può essere molto breve, il grado di artefatto introdotto dal &#39;effetto movimento&#39; durante una cattura individuo si riduce con l&#39;uso di questo metodo. Questa parte variabilezione di 3D-SIM offre una serie di altri vantaggi rispetto alle altre tecnologie disponibili e super imaging ad alta risoluzione per l&#39;imaging dal vivo di biologi cellulari batteriche. L&#39;aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e 3 le dimensioni e la capacità di immagine fino a 30 micron in un campione permette l&#39;imaging di cellule batteriche (e mammiferi) interi durante un esperimento. Tecniche come la localizzazione singola molecola che vengono comunemente eseguite in onda evanescente non possono raggiungere la profondità di penetrazione in un campione e non offrono informazioni sulle cellule intere. I recenti progressi che permettono profondità di campionamento più elevati per questa tecnica può risultare in una migliore risoluzione assiale di cellule intere. Inoltre, tecniche di localizzazione singola molecola che richiedono migliaia di immagini raw da acquisire sono anche limitati nel frame rate che possono essere catturate e possono richiedere compromesso tra frame rate di cattura e la risoluzione spaziale finale conseguito, in quanto la risoluzione spaziale dipende dal numero di EvaNTS registrate all&#39;interno di uno spazio definito. Diminuendo il numero di fotogrammi catturati si tradurrà in una risoluzione spaziale inferiore, ma può essere sufficiente per ottenere la risoluzione temporale necessaria per il processo biologico di interesse. La quantità di tempo di recupero tra i fotogrammi può anche essere necessario aumentare per ridurre al minimo fototossicità in cellule vive limitando in tal modo la durata e la frequenza con cui le serie storiche può essere ottenuto. Tecniche ad alta risoluzione, come la microscopia elettronica (EM) o elettroni cryotomography (ECT) offrono maggiore risoluzione su 3D-SIM (e altre tecniche di microscopia ottica super-risoluzione), ma devono essere eseguite su campioni fissi. Il fissaggio e la lavorazione possono introdurre artefatti e la mancanza di etichettatura possono rendere difficile l&#39;interpretazione. Libero-Label ECT ha scarso contrasto e può raggiungere profondità di penetrazione campione di circa 500-200 nm 24, quindi, anche se la proteina di interesse può essere identificata, non può essere osservata la struttura della proteina in una cellula batterica insieme.Anche quando etichettatura può essere utilizzato in EM, come ad esempio con immunogold, imaging viene eseguita solo in 2D. 3D è realizzabile solo con sezionamento sottile e ricostruzione di calcolo delle sezioni. La sottile sezionamento richiede un tecnico esperto, ma può essere problematico e portare a artefatto. Con cellule vive o fissi, 3D-SIM non ha bisogno di essere incorporato in modo specifico e cellule possono essere rapidamente preparato per l&#39;imaging in uno stato nativo vicino. Questo metodo è relativamente facile da implementare da ricercatori con una minima esperienza in microscopia a fluorescenza. Gli esperimenti possono essere eseguiti in media che supportano la funzione delle cellule sane fintanto che non fluorescenza o generare indebite segnale di fondo. Per le cellule batteriche, questo può consentire l&#39;uso di molti tipi di complessi e dei media minime o l&#39;uso di mezzi solidi o semi-solidi per controllare la motilità cellulare batterica. Molti biologi che hanno già ingegnerizzati proteina fluorescente (FP) fusioni e testato la funzionalità diqueste fusioni possono occupare questa tecnologia in rapida senza ulteriore progettazione e validazione di nuove fusioni FP fotoattivabile. Abbiamo trovato, come osservazione generale, che S. aureus era più suscettibile di photobleaching durante l&#39;imaging con fusioni FP rispetto a B. subtilis. Utilizzando i nostri metodi 3D-SIM originali, dove la griglia è stato generato da un reticolo fisico, siamo stati in grado di eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo con un numero di S. fusioni aureus FP. Tuttavia, con questo metodo F3D-SIM avanzata, siamo stati in grado di immagine queste fusioni FP e ad effettuare serie breve tempo per catturare la dinamica di queste proteine ​​taggati. Ciò è probabilmente dovuto ai tempi di esposizione ridotti necessari per l&#39;imaging e l&#39;aumento di tempo tra i fotogrammi per il recupero delle cellule. OMX Blaze 3D-SIM è una tecnologia disponibile in commercio che possono essere abbastanza facilmente realizzato in un singolo laboratorio o un centro di imaging di base. Bisogna fare attenzione a eseguire la tecnica per evitare di artifatti a causa della scarsa preparazione del campione o l&#39;acquisizione di immagini poveri. Una volta che la tecnica è padroneggiata, studi di struttura delle proteine ​​e la dinamica di piccoli organismi come i batteri possono essere eseguite in fluorescenza singola o multi-color.

Un certo numero di tecnologie di imaging diversi sono stati utilizzati nel corso degli anni a studiare i batteri tra cui vari elettrone e tecniche di microscopia ottica. Mentre microscopia elettronica offre risoluzione estremamente elevata, fino al nanometri, la necessità di un vuoto e l&#39;uso di agenti di contrasto ha limitato questa tecnica per campioni fissati ed embedded. Gli artefatti possono anche essere introdotte a causa di preparazione del campione lungo e un professionista esperto è necessario per preparare i campioni, e di analizzare e interpretare le immagini risultanti. La microscopia ottica offre i vantaggi di semplice preparazione del campione e l&#39;applicazione di etichette multiple con relativa facilità rispetto al microscopio elettronico. Utilizzo di proteine ​​fluorescenti e coniugati di tintura, la capacità di studiare cellule vive con la microscopia a fluorescenza è anche possibile. Con i miglioramenti nella stabilità fluoroforo e proteina fluorescente dimensione / struttura che portano alla diminuzione della tossicità delle cellule, così come i progressi nella fotocamera tecn rilevamentoology, microscopia a fluorescenza utilizzando sistemi di imaging confocale a largo campo e ha ampliato significativamente la nostra comprensione delle dinamiche spaziali di cellule. Utilizzando queste tecniche, la nostra conoscenza della cellula batterica negli ultimi 20 anni è progredita notevolmente ad un ben più dettagliato che rivela un elevato livello di organizzazione strutturale e proteine ​​all&#39;interno della cellula batterica 1. Tuttavia, i metodi convenzionali di microscopia ottica sono diffrazione limitata, il che significa che la risoluzione intrinseca è circa la metà della lunghezza d&#39;onda della luce di eccitazione utilizzato. Di conseguenza, anche con il sistema di microscopia ottica convenzionale più ottimale, la migliore risoluzione laterale è di circa 220-250 nm e la risoluzione assiale è di circa 500 nm (per una rassegna vedi Schermelleh et al. 2). Per i biologi delle cellule batteriche in particolare, questo ancora limita fortemente la nostra comprensione della organizzazione spaziale di queste piccole cellule; essendo solo 1-2 micron di diametrometro e 1-10 micron di lunghezza. Vi è anche la necessità di tecniche ad alta risoluzione che possono essere eseguite su cellule vive dove comportamento spaziale dinamica di una proteina può essere analizzato per integrare dati in vitro. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate diverse tecniche di imaging di fluorescenza super-risoluzione. Super-risoluzione di microscopia descrive le tecniche di imaging che almeno il doppio della risoluzione laterale ottenibile con microscopia ottica convenzionale, superando così la barriera di diffrazione. Queste tecniche manipolare l&#39;illuminazione e / o analisi della luce emessa per creare aumenti reali nella risoluzione apparente. Ci sono attualmente tre principali tipi di tecniche di super-risoluzione - i) stimolato microscopia deplezione di emissione 3 (STED); ii) la microscopia localizzazione singola molecola, comprese le tecniche quali la microscopia localizzazione fotoattivazione 4,5 (PALM), stocastico la microscopia ottica ricostruzione <sup&gt; 6 (STORM), STORM diretta 7 (dSTORM), e la terra esaurimento Stato con singola molecola di ritorno 8 (GDSIM); e iii) l&#39;illuminazione strutturata microscopia 9-12 (SIM). Tecniche di localizzazione singola molecola offrono i maggiori incrementi di risoluzione laterale, fino a tra 10-40 nm in campioni biologici. In molte implementazioni di singola molecola microscopia localizzazione, la profondità di campionamento è limitato ad onda evanescente e le implementazioni iniziali di STED stati inoltre limitata profondità di campionamento. Tuttavia, recenti progressi come l&#39;uso di ottiche adattive, sfruttamento della astigmatismo in funzione del punto di diffusione in diversi punti focali, rilevamento multi-piano e utilizzando due obiettivi per dedurre la posizione assiale della luce emessa hanno visto miglioramenti sia assiale risoluzione e profondità di campionamento sia molecola STED e singola localizzazione 13,14. Velocità di acquisizione dati per STED e tecniche di localizzazione singola molecolasono anche relativamente lento a causa del gran numero di immagini che devono essere acquisiti per risoluzione massima (fino a 50.000 per tecniche di localizzazione). Questo lento acquisizione dati non si presta alla ripresa dei campioni vivi senza modifiche personalizzate che sono spesso piuttosto costosi. Queste due tecniche sono attualmente prestano perfettamente per i campioni fissi (per una rassegna vedi 2,15), tuttavia, molto lavoro è stato fatto per affrontare questa limitazione. Tridimensionale strutturato microscopia illuminazione (3D-SIM) è una tecnica a grande campo che migliora sia la risoluzione laterale e assiale con conseguente risoluzione di circa 110 e 280 nm, rispettivamente. Profondità di campionamento è fino a 30 micron dal coprioggetto, consentendo per l&#39;imaging di cellule intere. La variazione di 3D-SIM sviluppato da Sedat, Agard, e Gustaffsson sul Optical Microscope sperimentali (OMX) piattaforma comporta illuminando il campione con un modello di griglia nota che viene spostato in 15 diverseposizioni in ogni piano z 9-11. Le frange dei conseguenti effetti moiré che vengono creati nello spazio di frequenza al di fuori della regione osservabile sono misurati. Le informazioni dallo spazio di frequenza è computazionalmente ricostruito per generare un&#39;immagine visibile super-risoluzione di 10,11. La velocità relativa alla quale le immagini crude possono essere acquisite utilizzando questa tecnica permette l&#39;imaging delle cellule vive. Tuttavia, è importante notare che per i processi biologici che si verificano su una scala temporale di secondi, la velocità di acquisizione delle immagini prime è ancora troppo lento per catturare cambiamenti dinamici. Per la serie temporale con una velocità di acquisizione di secondi, l&#39;acquisizione ripetuto senza tempo di recupero sufficiente può portare a fototossicità e photobleaching, soprattutto durante l&#39;imaging dal vivo di piccole cellule batteriche. Per superare questi problemi, sono stati sviluppati i recenti progressi per rapida 3D-SIM (F3D-SIM). Qui si descrive uno noto come OMX Blaze 16 che ero iontroduced alla fine del 2011, questa tecnologia crea l&#39;illuminazione fantasia senza l&#39;uso di una rete fisica come è stato utilizzato nei sistemi precedenti. L&#39;uso di interferire fasci di luce e nuova tecnologia dell&#39;otturatore permette la creazione della luce modellata sul campione in modo molto rapido. La velocità di acquisizione delle immagini è stata ulteriormente migliorata con l&#39;introduzione della scientifica Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) telecamere, soprattutto se paragonata alle telecamere EMCCD esistenti. Questi cambiamenti hanno comportato un possibile tasso di acquisizione di immagini di un fotogramma al secondo per una profondità di campionamento di 1 micron (512 x 512 pixel, 9 z-fette), consentendo il monitoraggio dei cambiamenti dinamici all&#39;interno delle cellule che si verificano in pochi secondi 16. La riduzione dell&#39;esposizione (eccitazione) volte apparenti di vivere le cellule che utilizzano questo metodo consente sia di serie tempo per essere catturato o un aumento del tasso di cattura. Qui si descrive l&#39;applicazione della microscopia F3D-SIM per esae la struttura e il movimento dinamico dell&#39;anello cytokinetic Z nelle cellule delle due specie batteriche: organismo modello Bacillus subtilis a forma di bastoncello e il patogeno umano coccoidi Staphylococcus aureus. FtsZ è una proteina del citoscheletro tubulina-like che svolge un ruolo chiave nella divisione cellulare nei batteri 17,18. Si localizza al sito divisione di reclutare almeno 20 altre proteine ​​di divisione, che formano l&#39;apparato divisione 17,18, e si crede per fornire la forza di costrizione delle cellule 19-23. Questo metodo rivela che FtsZ è eterogeneo distribuito lungo l&#39;anello Z in entrambi gli organismi in una disposizione bead-simili; risolvendo la lunga data questione se l&#39;anello Z è una cintura uniforme continua intorno alla cella, come visualizzato dal grande campo convenzionale microscopia a fluorescenza, o una struttura discontinua come suggerito da elettroni Cryo-tomografia (ECT) 24. Mostriamo come la capacità del 3D-SIM in grado di migliorare notevolmente l&#39;esame spaziale di piccoli (1micron di diametro) cellule rotonde come S. aureus che dividono in tre piani perpendicolari consecutivi (x, y, z). Studi time-lapse che utilizzano queste tecniche mostrano che la struttura dell&#39;anello Z è dinamico, con i cambiamenti lordi organizzazione all&#39;interno dell&#39;anello, piuttosto che molecole FtsZ muovono dentro e fuori di un ponteggio fisso 24.

<table><tbody><tr><td>Agarosio I (grado Biotecnologico)</td><td>AMRESCO</td><td>0710-500G</td><td>Utilizzato per la costruzione di tamponi di agarosio al 2%. Utilizzare il microonde per sciogliere l'agarosio nei terreni di coltura.</td></tr><tr><td>N-(3-trietilammoniopropil)-4-(6-(4-(dietilammino) fenil) esatrienil) piridinio dibromuro (FM 4-64)</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Colorante lipofilo utilizzato per la colorazione delle membrane cellulari.</td></tr><tr><td>Microprovetta da 1,5 ml, laureata Natural</td><td>Scientific specialties Inc.</td><td>1210-00</td><td>Realizzato in polipropilene omopolimero, utilizzato per raccogliere cellule batteriche prima di essere posizionate su cuscinetti di agarosio per la visualizzazione.</td></tr><tr><td>Base per brodo Luria, Miller</td><td>BD</td><td>241420</td><td>Preparato secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere il 2% di agarosio dopo la sterilizzazione in autoclave.</td></tr><tr><td>BBL Brodo di dosaggio antibiotico, Terreno antibiotico 3</td><td>BD</td><td>210932</td><td>Preparato secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Telaio adesivo</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ABGAB-0577</td><td>Conosciuto come Gene Frame con questa azienda. Utilizzato per preparare tamponi di agarosio al 2% (Dimensioni: 15 x 16 mm).</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>111512-9</td><td>22 x 22 N. 1 Spessore</td></tr><tr><td>35 mm di diametro Piastra di Petri con fondo in vetro vetrino coprioggetti</td> Strumenti <td>di precisione mondiali</td><td>FD35-100</td><td>Conosciuto come FluoroDish con questa azienda. Piatto: &Oslash; 35 mm, Vetro: &Oslash; 23 mm, Spessore del vetro: 0,17 mm, non pirogeno</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>Produrre un impasto di 10 mg/ml in etanolo al 95%.</td></tr><tr><td>Lincomicina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>L6004-5MU</td><td>Produrre una produzione di 25 mg/ml in etanolo al 50%.</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Boehringer Mannheim GmbH</td><td>12390120-14</td><td>Produrre una dose di 10 mg/ml in etanolo al 95%.</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua combinato di agitazione orbitale/lineare</td><td>Grant scientific Instruments</td><td>OLS-200</td><td>Velocità di agitazione utilizzata per le colture: spettrofotometro UV visibile a 215 giri/min</td></tr><tr><td></td> La lunghezza d'onda di <td>Shimadzu</td><td>UV-1601</td><td>600 nm è stata utilizzata per misurare la densità ottica delle colture batteriche.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>I pellet di coltura batterica sono stati ottenuti centrifugando le colture a crescita esponenziale a 8.000 giri/min per 30 secondi.</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td>Preparare 1 M di brodo e filtrare sterilizzare prima dell'uso.</td></tr><tr><td>software softWoRx</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td>versione 5.0</td><td></td></tr><tr><td>software di analisi dati Imaris</td><td>Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td><td>versione 7.0.0</td><td>Matlab XTensions incluso</td></tr><tr><td>Sistema di imaging 3D-SIM DeltaVision OMX dotato di un modulo Blaze.</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td></td><td>Modulo Blaze montato su microscopio</td></tr><tr><td>a fluorescenza verticale</td> OMX V3 <td>Zeiss Axioplan 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

super-resolution imaging del cytokinetic z anello in batteri vivi uso di fast 3d structured illumination microscopy (f3d-sim)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging di campioni biologici mediante microscopia a fluorescenza è progredita notevolmente con le nuove tecnologie per superare la risoluzione barriera della diffrazione della luce permettendo super-risoluzione di campioni dal vivo. Ci sono attualmente tre principali tipi di tecniche di super-risoluzione - deplezione emissione stimolata (STED), microscopia localizzazione singola molecola (incluse le tecniche quali PALM, STORM, e GDSIM), e microscopia illuminazione strutturata (SIM). Mentre le tecniche di localizzazione STED e singola molecola mostrano i maggiori incrementi di risoluzione, sono stati più lenti per offrire maggiore velocità di acquisizione delle immagini. Tridimensionale SIM (3D-SIM) è una tecnica di microscopia a fluorescenza a livello di campo che offre una serie di vantaggi rispetto sia singola molecola localizzazione e STED. La risoluzione è migliorata, con risoluzioni tipiche laterali e assiali di 110 e 280 nm, rispettivamente, e la profondità di campionamento fino a 30 micron dal coprioggetto, consentendol&#39;imaging di cellule intere. I recenti progressi (veloce 3D-SIM) nella tecnologia aumentando la velocità di acquisizione delle immagini raw permette di rapida cattura dei processi biologici che avvengono in pochi secondi, riducendo in modo significativo foto-tossicità e photobleaching. Qui si descrive l&#39;uso di uno di questi metodi di immagine cellule batteriche che ospitano il cytokinetic proteina fluorescenza marcata FtsZ per mostrare come vengono analizzate le cellule e il tipo di informazioni uniche che questa tecnica può fornire.

In questo studio abbiamo visualizzato la proteina divisione cellulare batterica FtsZ, espresso in cellule vive come una fusione FtsZ-GFP, per illustrare i vantaggi potenti di F3D-SIM over microscopia a fluorescenza convenzionale per studiare la localizzazione della proteina batterica e la dinamica. FtsZ è una proteina del citoscheletro tubulina-like che polimerizza in una struttura ad anello dinamica intorno alla circonferenza della cella. L&#39;anello Z ha una funzione importante nella divisione cellulare: la sua assemblea segna il futuro sito della divisione, esso assume tutte le proteine ​​di divisione cellulare a questo sito, e l&#39;anello Z costrizione sembra fornire la forza per permettere il movimento verso l&#39;interno della busta cellulare durante cytokinesis 17 , 18. Quando visualizzate dalla grande campo convenzionale microscopia a fluorescenza, l&#39;anello Z appare come una singola banda trasversale della fluorescenza in batteri a forma di bastoncello, compresi gli organismi più ben studiato come B. subtilis (Figura 2A), &lt;em&gt; E. coli e C. crescentus. È importante sottolineare che l&#39;intensità di fluorescenza in questo gruppo sembra essere più o meno uniforme, e il modello di localizzazione offre molto poco spaccato l&#39;organizzazione strutturale e la distribuzione di polimeri FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello Z. Quando le stesse cellule vengono esaminate utilizzando il metodo F3D-SIM qui descritto (Figura 2B), tuttavia, i vantaggi di questa tecnica sono immediatamente evidenti. In primo luogo, la rotazione dell&#39;immagine 3D-SIM intorno all&#39;asse z consente la visualizzazione dell&#39;anello Z come una struttura ad anello genuino nello spazio tridimensionale (Figure 2C e 3A). Insieme con l&#39;aumento della risoluzione, questo rivela che la distribuzione del FtsZ nell&#39;anello Z è infatti estremamente eterogenee (Figura 3). Il miglioramento della risoluzione ci permette anche di vedere gli anelli Z che hanno iniziato il processo di costrizione per formare un setto di divisione (indicato dal invaginazione della membrana cellulare in &lt;strong&gt; Figura 2C e 2D). Ulteriori esempi di B. subtilis anelli Z visualizzati da questa tecnica sono illustrati nella Figura 3Bi - 3Biv e mostrano come l&#39;intensità di fluorescenza intorno al ring Z non è mai la stessa. Inoltre, le regioni di bassissima intensità di fluorescenza sono spesso osservate. Ci riferiamo a queste regioni lacune (punte di freccia bianche). Osserviamo queste lacune nel 15% di tutti gli anelli Z esaminati (n = 84) e prevalentemente in anelli Z aventi un diametro di 800-900 nm (93%). Per quantificare queste osservazioni, trame intensità 3D sono stati creati dell&#39;anello Z e sono mostrati in figura 3Ci e 3Cii utilizzando gli anelli Z mostrati nelle figure 3Biii e 3Biv. Le trame di intensità mostrano che in genere la quantità di fluorescenza sul ring Z può variare fino a 3 - 4 volte in diverse regioni del B. anello subtilis Z. Inoltre, le trame intensità 3D mostrano che la gaps della fluorescenza all&#39;interno dell&#39;anello Z quasi leggere i livelli basali di fluorescenza di fondo (freccia nera nella figura 3Ci). Questi esempi sopra riportati rappresentano buone ricostruzioni dell&#39;anello Z e dipendono luce sufficiente emessa dal campione senza significative photobleaching. Questo si realizza attraverso la luminosità del fluoroforo GFP fusa FtsZ e la sua abbondanza nella cella in queste condizioni (elevato rapporto segnale-rumore). In altre celle in cui il rapporto segnale-rumore è basso la ricostruzione dell&#39;immagine è scarsa. Per simulare questo evento con FtsZ-GFP, la quantità di segnale di emissione raccolti dal B. cellule subtilis è stata ridotta abbassando l&#39;energia di eccitazione. Come mostrato in Figura 3D una piega riduzione del 100 dei risultati energetici eccitazione in un&#39;immagine di Z-anello che ha artefatti significativi. Questo si verifica come conseguenza di insufficiente contrasto locale tra il segnale FtsZ-GFP e lo sfondo che porta a poor ricostruzione dell&#39;immagine. È interessante notare, B. anelli Z subtilis hanno mostrato lacune più pronunciate e eterogeneità nelle regioni superiori e inferiori l&#39;anello, ma non nei lati del ring (Figura 3B). Questo avviene a causa della differenza di risoluzione raggiunti da questa variazione di 3D-SIM nel piano laterale rispetto al piano assiale. Ciò si traduce nelle regioni superiori e inferiori del (piano laterale) anello Z di essere ripreso con risoluzione ottimale. Le lacune Z-ring sono troppo piccole per essere rilevate nei lati dell&#39;anello Z come visualizzato nel piano assiale, che ha circa la metà della risoluzione del piano laterale. I batteri che hanno una morfologia coccoidi, come S. aureus, ha gli anelli Z che sono posizionati in tutti i piani. Così l&#39;imaging l&#39;anello Z quando si trova nel piano laterale (o vicino ad esso) offre la possibilità di immagine tutte le regioni del ring con risoluzione ottimale. Approfittando di questo, abbiamo esaminato la struttura dil&#39;anello Z in diretta S. cellule aureus, utilizzando un ceppo che contiene un plasmide portante una fusione FtsZ-GFP. La produzione di questa fusione è sotto il controllo di un promotore inducibile P Spac (vedi punto 1.2.1). Quando ripreso con sul ​​piano assiale, S. anelli Z aureus è apparso identico a B. anelli Z subtilis che sono presenti nello stesso piano (Figura 4AI). Tuttavia, anelli di imaging Z nel piano laterale confermato che l&#39;intero anello Z apparso sia bead-simile ed eterogeneo. Circa il 26% di questi anelli ha anche mostrato almeno un &quot;gap&quot; visibile di fluorescenza (Figura 4Aii, 4B). Simile a B. subtilis FtsZ, piazzole di intensità di fluorescenza mostrano che l&#39;intensità della fluorescenza nell&#39;anello Z varia tanto quanto 4 - 6 volte in differenti aree del S. aureus Z anello (Figura 4C). La lunghezza e la larghezza delle sfere possono essere misurate (fare riferimento alla schematica nella Figura 4D). Questo ha dimostrato che l&#39;80% degli anelli Z (n = 43) che sono stati esaminati aveva una lunghezza cordone di 200 nm, raggiungendo una lunghezza massima di 400 nm. La larghezza di perline, dall&#39;altro, misurata a 200 nm. C&#39;era in media 12 ± 2 (SEM) perline FtsZ per anello Z. Dati di localizzazione simile è stata osservata quando FtsZ nativo è stato visualizzato con questi metodi che utilizzano la microscopia di immunofluorescenza (IFM), che dimostrano che questo modello localizzazione eterogenea e tallone-come era genuino e non un artefatto causato da espressione di FtsZ-GFP oltre al nativo FtsZ (dati non mostrato). Questo progresso del 3D-SIM è in grado di dimostrare che l&#39;anello Z appare come una struttura eterogenea ed è forse discontinuo in natura. Per affrontare la questione di come questa struttura Z-ring eterogeneo subisce costrizione e facilita la divisione cellulare, l&#39;analisi time-lapse della dinamica dell&#39;anello Z può essere eseguita. Una delle principali sfide conmicroscopia a fluorescenza studi time-lapse è nella minimizzazione di photobleaching campione e fototossicità durante l&#39;imaging. 3D-SIM richiede un gran numero di immagini raw per ottenere che significa che photobleaching di un campione nel tempo si tradurrà in cattivo rapporto segnale-rumore del segnale che porta alla insufficiente per consentire opportune ricostruzioni immagine. L&#39;applicazione della nuova tecnologia minimizza la quantità di energia di eccitazione utilizzata per ogni esposizione e quindi una diminuzione dell&#39;energia entrare nelle cellule vive. Ciò avviene mediante una combinazione di luce interferometria fascio per creare il modello strutturato sul campione e l&#39;uso di telecamere scientifici CMOS che aumentano la sensibilità e l&#39;efficienza quantica. Questa combinazione provoca l&#39;acquisizione z-pila di 1 micron per sec (512 × 512 pixel x 8 z-fette) rispetto a 1 micron per 5-8 sec (512 x 512 pixel x 8 z-fette) ottenuto con la nostra precedente iterazione di 3D-SIM (descritto nel Riglar et al. 26).Diminuendo il tempo di acquisizione dell&#39;immagine e impostazioni di esposizione può anche aiutare a minimizzare fototossicità di cellule vive, che è particolarmente rilevante negli studi time-lapse. La nuova tecnologia qui presentata affronta anche un altro problema in live-cell imaging che noi chiamiamo &#39;effetto movimento&#39; che in questo contesto si riferisce alla localizzazione delle proteine ​​cambiano durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Diminuendo il tempo di acquisizione dell&#39;immagine della quantità di &#39;motion blur&#39; è minimizzato creando così una ricostruzione un&#39;immagine più accurata. Precedenti studi che hanno affrontato come FtsZ è organizzato all&#39;interno dell&#39;anello Z non sono stati in grado di mostrare come struttura ad anello Z cambia nel tempo. Per indagare questo aspetto abbiamo effettuato time-lapse utilizzando F3D-SIM. Questa acquisizione permesso di una immagine 3D-SIM dell&#39;anello Z in B. subtilis ogni 5-10 sec su un periodo di 50 secondi, che in precedenza non era possibile in questa scala temporale. Mostrato in Figura 5A è un example dei rapidi cambiamenti nella distribuzione FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello Z nel tempo (diametro di 890 nm). Altri anelli Z che erano visibilmente nel processo di costrizione stati anche dimostrato di avere dinamiche simili che hanno interessato la distribuzione di FtsZ intorno all&#39;anello Z (non mostrati). Trame intensità 3D possono anche essere generati per ciascuno dei punti di tempo per quantificare e apprezzare i continui cambiamenti di intensità di fluorescenza e l&#39;abbondanza relativa di così FtsZ in diverse regioni dell&#39;anello Z su una scala temporale di secondi (Figura 5B). Regioni di interesse possono essere identificati da queste trame intensità per monitorare le fluttuazioni di intensità di fluorescenza (Figura 5C). Il monitoraggio di tali cambiamenti nella struttura ad anello Z in queste condizioni sarebbe praticamente impossibile senza la tecnologia avanzata F3D-SIM. Inoltre, questo lavoro ha rivelato che in S. aureus il movimento dinamico della FtsZ è simile a quello osservato in B. subtilis. S. cellule aureus RN4220 producing FtsZ-GFP è stato ripreso per 50 sec a 10 intervalli di tempo sec. Modifiche alla eterogeneità dell&#39;anello Z in S. aureus con F3D-SIM erano simili a B. subtilis (vedi punte di freccia e le frecce in Figura 6). Questi studi time lapse supportano un modello di costrizione anello Z (il modello pizzicotto iterativo) che è stato previsto attraverso l&#39;esame di C. fisso cellule crescentus, ma non poteva essere dimostrato a causa della necessità di esaminare le dinamiche Z-ring in cellule vive 27. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 schematica della configurazione ottica del F3D-SIM utilizzata in questo studio luce. Laser dalla tabella laser è diretto attraverso una fibra SIM per un collimatore e fissato grata, poi nel modulo di controllo di fase che crea sia la lunghezza d&#39;onda specifica ottimale spaziatura of i ± 1 ° ordine travi della trave centrale di ordine zero ed i passaggi di fase per la raccolta SIM. Le travi poi entrano nel modulo di controllo dell&#39;angolo in cui i raggi si riflettono per i 3 gruppi per creare i 3 angoli di illuminazione. Le travi quindi immettere il microscopio e il percorso della luce come mostrato (Modificata con il permesso di Paul Goodwin, API). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2 Confronto tra convenzionale fluorescenza a largo campo e imaging 3D-SIM di B. cellule che esprimono subtilis FtsZ-GFP. (A) a grande campo convenzionale imaging di fluorescenza di B. cellule che esprimono subtilis FtsZ-GFP (SU570, verde) come un unico esemplare sono stati colorati con la membrana colorante FM4-64 (rosso). Bar Scala = 5 micron. L&#39;immagine è stata acquisita utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale.(B) 3D-SIM immagini dello stesso B. subtilis ceppo che esprime FtsZ-GFP, macchiata di FM4-64. Regioni di interesse dall&#39;immagine possono essere selezionati (casella tratteggiata) per ingrandire. L&#39;immagine può anche essere ruotata intorno all&#39;asse z per visualizzare anelli 3D FtsZ sul piano assiale. (C, D) La rimozione di out-of- messa a fuoco della luce e una migliore risoluzione d&#39;immagine che possiede 3D-SIM consente chiara visualizzazione di anelli Z (compresi quelli che sono costrizione) e la membrana cellulare interna durante la divisione (indicato dalle frecce bianche). Si noti che il testo protocollo descrive la visualizzazione di un singolo fluoroforo. Tuttavia, il procedimento può essere adattato per acquisire fino a quattro diverse lunghezze d&#39;onda simultaneamente. Questo dato è stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Immagini rappresentative della dell&#39;anello Z in cellule vive a forma di bastoncello batteriche (B. subtilis) che esprimono FtsZ-GFP con 3D-SIM. (Ai) L&#39;anello Z si osserva come una banda di fluorescenza perpendicolare all&#39;asse lungo della cella che si trova nel piano xy. (Aii) L&#39;immagine è stata ruotata attorno alla z -axis utilizzando software di visualizzazione Imaris 3D (fare riferimento al protocollo punto 6.1), in modo che si sta cercando attraverso la struttura ad anello per vedere chiaramente come FtsZ è distribuito all&#39;interno dell&#39;anello Z. Questa immagine, ora nel piano zx mostra che l&#39;anello ha una distribuzione eterogenea di FtsZ con le regioni di nessun o pochissimo fluorescenza (frecce bianche). L&#39;immagine deve essere ruotata rispetto di queste regioni gap &#39;di fluorescenza. Bi-Biv mostrano ulteriori esempi di anelli Z ruotati che ora giacciono nel piano zx. Anelli Z in (Bi-iii) hanno un diametro di circa 0,9 micron. (BIV) mostra un anello Z con un diametro di ONLy 0,65 micron subire differenze di FtsZ-GFP attorno all&#39;anello Z avente un diametro di 0,85 micron (vedi protocollo passaggi 6.1-6.3) costrizione. (Ci) Questo profilo di intensità 3D tipica illustra l&#39;intensità di fluorescenza (cioè concentrazione). Il livello di fluorescenza a queste lacune è basso e si avvicina a livelli di fluorescenza di fondo (freccia nera). (CII) Un profilo di intensità simile 3D di un anello Z nel processo di costrizione. Concentrazione FtsZ-GFP è anche non uniforme; diametro, 0,65 micron. Pannelli A, B, CI e CII sono stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 immagini Rappresentante 3D-SIM di S. cellule aureus producono FtsZ-GFP. Poiché queste cellule sono rotonde (cocchi), l&#39;anello Z si havdi e diversi orientamenti. Le cellule che mostrano una banda di fluorescenza nel normale orientamento di visualizzazione (cioè nel piano xy) come in (Ai), sono molto simili a quelli nelle celle astiformi quando ruotato intorno all&#39;asse Z come per la Figura 1AI. In (Aii) l&#39;anello Z è già nel piano xy; orientamento laterale e la risoluzione massima è sopra l&#39;intero anello che ora dà una struttura tallone-come (B). (C) Una trama intensità 3D della relativa abbondanza di FtsZ-GFP nell&#39;anello Z. (D) Rappresentazione schematica del S . anello aureus Z. Le frecce rosse indicano la lunghezza cordone e larghezza (fare riferimento al protocollo step 6.1). Questo dato è stato modificato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figura 5 F3D-SIM consente l&#39;analisi rapida di localizzazione FtsZ nel tempo in 3D-SIM. (A) Variazioni nella distribuzione FtsZ-GFP all&#39;interno dell&#39;anello Z a B. a forma di bastoncello cellule subtilis possono essere visualizzati per indicare la dinamica dell&#39;anello. Tempo (sec) è indicato nell&#39;angolo in alto a sinistra di ogni immagine. (B) appezzamenti di intensità di fluorescenza 3D mostrano la non uniforme e la distribuzione dinamica del FtsZ nell&#39;anello Z. (C) dinamica FtsZ (FtsZ-GFP cambiamenti fluorescenza del ring) può essere esaminata anche in modo più dettagliato quantificando intensità di fluorescenza nel tempo in due regioni di interesse. Questo dato è stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 F3D-SIM immagini time-lapse mostrano cambiamenti nella localizzazione FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello nel tempo a S. unureo. Una freccia bianca indica una lacuna quando viene inizialmente rilevata sul ring Z. La comparsa e la scomparsa di lacune nella stessa posizione (come indicato dalla freccia bianca) nel tempo illustra come FtsZ viene ridistribuito in tutto il Z-ring. Frecce bianche indicano la formazione di lacune sul ring Z a successivi intervalli di tempo. Tempo (sec) viene visualizzato sul lato superiore sinistro delle immagini. Questo dato è stato modificato da Strauss et al 16.

Le informazioni spazio-temporali sulle proteine dinamiche all'interno delle cellule vive sono fondamentali per comprendere la biologia. Un tipo di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata in 3D veloce (f3D-SIM) rivela informazioni uniche sull'anello Z citocinetico nei batteri: sia il suo aspetto simile a una perlina che la rapida dinamica di FtsZ all'interno dell'anello.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare i cambiamenti dinamici della proteina FTSZ durante la divisione cellulare nei batteri. Questo viene ottenuto applicando cellule di bacillus subtiles che esprimono la fusione FTSZ-GFP sulla superficie di un piccolo pad in agarosio. Il pad viene quindi capovolto e trasferito in una piastra di Petri con fondo in vetrino.Il secondo passaggio consiste nell'acquisire immagini in time-lapse dei batteri durante la divisione cellulare utilizzando un microscopio a illuminazione strutturata 3D o un sistema di imaging 3D SIM. Successivamente, si valuta la qualità dei dati grezzi e vengono scartate le immagini con una diminuzione dell'intensità superiore al 30% dovuta al fotobiancamento. L'ultimo passaggio prevede l'analisi quantitativa dei cambiamenti nella localizzazione della proteina durante la divisione cellulare misurando la distribuzione dell'intensità di fluorescenza della proteina F-T-S-Z-G-F-P nel tempo.Alla fine, la SIM 3D ultrarapida viene utilizzata per mostrare quanto siano dinamiche le proteine DnaN durante la divisione cellulare nei batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi esistenti come la microscopia confocale è che otteniamo informazioni tridimensionali sui cambiamenti che avvengono durante la divisione cellulare in cellule vive. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla citocinesi batterica, potrebbe anche essere applicato ad altri sistemi in cui desideriamo osservare cambiamenti proteici dinamici, come nelle cellule M dei mammiferi.L'idea è nata quando abbiamo osservato immagini tradizionali in 3D di cellule batteriche fissate, che mostravano come la proteina FDZ non fosse distribuita in modo omogeneo attorno all'anello Zed. Volevamo esaminare ulteriormente se tale distribuzione fosse collegata ai cambiamenti che avvengono durante la costrizione dell'anello Zed. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà a causa dell'incapacità di adattare l'indice di rifrazione dell'olio al campione, il che porterà a immagini di scarsa qualità.Per preparare le cellule di bacillus subtilis per l'analisi microscopica, coltivare le cellule fino alla fase esponenziale intermedia come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, fissare un telaio adesivo su un normale vetrino da microscopio rimuovendo prima il sottile foglio di poliestere. Quindi applicare la superficie adesiva esposta del telaio sulla superficie del vetrino, creando efficacemente una camera quadrata sulla parte superiore del vetrino; lasciare il foglio spesso di poliestere attaccato al telaio per evitare l'adesione del coverslip nei passaggi successivi.Successivamente, sciogliere una soluzione di aro nel microonde fino all'ebollizione; pipettare 67 microlitri della soluzione fusa di aro nel telaio adesivo. Posizionare immediatamente un coprioggetto sulla soluzione di aro per creare una superficie piana e lasciare a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti. Rimuovere il coprioggetto per uno-due minuti mentre il campione viene raccolto.Prelevare un'aliquote di un millilitro del campione dopo la centrifugazione a 8.000 giri al minuto per alcuni secondi, decantare il soprannatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di mezzo fresco. Prelevare 2,5 microlitri del campione concentrato e pipettare sulla piastra di aros precedentemente preparata. Distribuire il campione uniformemente lungo la superficie piana della piastra di aros.Quindi rimuovere il telaio adesivo dal vetrino utilizzando pinzette, senza toccare il tampone aros. Trasferire il tampone aros dal vetrino a una piastra di Petri di diametro 35 millimetri con fondo in vetro coprioggetto.Per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Capovolgere il pad aros in modo che la sospensione cellulare venga a contatto con il coperchio del vetrino della piastra di Petri. Nel giorno dell'esperimento, accendere il sistema di acquisizione OMX 3D SIM almeno un'ora prima dell'acquisizione delle immagini, per consentire al sistema e ai laser di stabilizzarsi completamente.Quindi accendere i diversi componenti elencati nel protocollo testuale sulla stazione di lavoro del controller principale. Aprire il software OMX facendo clic sull'icona. Impostare il percorso del file per il salvataggio dei dati su una cartella dati appropriata.Successivamente, avviare il software di acquisizione. Accendere i laser necessari per l'esperimento nella sezione dei parametri luminosi della schermata principale. Attivare la telecamera FITC dalla selezione del canale e procedere a verificare i parametri elencati nel protocollo testuale.Applicare una goccia di olio sulla parte superiore dell'obiettivo. Posizionare la piastra di Petri contenente le cellule preparate nell'apposito alloggiamento del palchetto e coprire con il coperchio riscaldante circolare. Abbassare il palchetto fino a quando l'olio non tocca il fondo della piastra di Petri del campione.Lasciare che la piastra raggiunga l'equilibrio termico per 15 minuti. Sullo stage, utilizzando un'impostazione di esposizione bassa, mettere a fuoco il campione mediante i controlli dello stage di posizionamento nano. Mettere a fuoco sopra e sotto il campione per verificare se la luce è distribuita uniformemente al di sopra e al di sotto del piano focale del campione. Successivamente, utilizzare passi di 0,5 micron e segnare la parte superiore e inferiore della serie di immagini prima di tornare al centro del campione. Nella scheda dell'esperimento, fare clic sul pulsante "get thickness" per impostare lo spessore di acquisizione del campione.Determinare il valore di intensità massima dell'immagine del campione con le impostazioni attuali di esposizione e percentuale di luce trasmessa. Questo valore si trova al di sotto della finestra dell'immagine. Per l'acquisizione di immagini in time-lapse, regolare l'esposizione e la percentuale di luce trasmessa in modo da ottenere un'intensità massima compresa tra 1100 e 1400.Sopra il livello di fondo. Per l'immagine, attivare la sezione acquisizione temporizzata nella scheda dell'esperimento. Impostare la frequenza dei fotogrammi richiesta e il tempo totale nel file di dati.Inserire un nome file appropriato. Fare clic sul pulsante di esecuzione per iniziare l'acquisizione dell'immagine all'inizio dell'acquisizione. Annotare il valore di intensità massima dell'immagine all'inizio dell'acquisizione per il primo fotogramma della serie temporale.Al termine dell'acquisizione del primo fotogramma, verificare che non ci sia stato un calo superiore al 10% dell'intensità del segnale attraverso il Zack per questo primo fotogramma. Al termine dell'acquisizione della serie temporale, aprire il file immagine grezzo risultante con suffisso DV e accertare la riduzione dell'intensità massima del segnale dall'inizio della serie temporale all'ultima immagine. Scartare tutti i punti temporali in cui si è verificato un foto-sbiancamento superiore al 30% dal menu del processo, attivare la finestra di ricostruzione SI.Utilizzare le impostazioni preesistenti per tutti i parametri. Attivare il pulsante OTF specifico per il canale utilizzato e impostarlo sul set di filtri standard. Attivare il pulsante degli angoli KO specifico per il canale utilizzato e impostarlo sul set di filtri standard.Trascina e rilascia il file grezzo nello spazio del file di input. Fai clic su esegui. Esamina la distribuzione di FTSZ attorno all'anello Z per creare grafici tridimensionali dell'intensità.Quindi aprire un file di immagine 3D. Per visualizzare le singole fette z, utilizzare lo strumento visualizzatore di volumi situato nella scheda del menu visualizza.Per ritagliare una regione di interesse, inserire il numero della finestra per questa immagine 3D nella finestra di input e un nuovo numero di finestra non utilizzato nella finestra di output. Il pulsante seleziona regione diventerà disponibile per ritagliare un singolo anello Z di interesse dal campo visivo originale di 40 per 40 micron. Regolare l'asse desiderato e il grado di rotazione nella scheda rotazione.Fare clic sul pulsante esegui. Scorrere il volume per ottenere la prospettiva desiderata, l'anello Z. Utilizzare lo strumento ispettore dati per regolare le dimensioni di colonna e riga e creare una nuova regione di interesse attorno a un singolo anello Z.Fare clic al centro dell'immagine per posizionare questa nuova regione di interesse. I dati dell'immagine testuale costituiscono una tabella generata automaticamente che mostra l'intensità di fluorescenza di ciascun pixel all'interno della regione di interesse. Fare clic sul pulsante del grafico 3D per visualizzare inizialmente il grafico dell'intensità.In alternativa, i dati dell'immagine testuale possono essere esportati facendo clic sul pulsante per salvare i dati della tabella. Nel menu file, copiare i dati dell'immagine dal file di testo salvato in un nuovo foglio di calcolo. Selezionare tutte le celle all'interno del foglio di calcolo e creare un nuovo grafico tridimensionale a superficie.Formattare il grafico dell'intensità 3D per la pubblicazione dei dati in time-lapse. Ripetere questi passaggi per ciascuno dei diversi punti temporali del file di immagine 3D. Quando viene visualizzato mediante microscopia a fluorescenza in campo chiaro convenzionale, l'anello Z appare come una singola banda trasversale di fluorescenza in Bacillus subtilis.L'intensità della fluorescenza lungo questa banda è uniforme. Il modello di localizzazione fornisce scarse informazioni sull'organizzazione strutturale e sulla distribuzione dei polimeri di FTS all'interno dell'anello; qui vengono esaminate le stesse cellule. Utilizzando il metodo FAST 3D sim.La rotazione dell'immagine 3D simulata attorno all'asse Z permette la visualizzazione del filamento Z come struttura ad anello genuina nello spazio tridimensionale. Il miglioramento della risoluzione consente di osservare la distribuzione eterogenea di FTSZ all'interno dell'anello. Ulteriori esempi di anelli Z di Bacillus visualizzati mediante questa tecnica illustrano come l'intensità di fluorescenza attorno all'anello Z non sia mai identica.Inoltre, si osservano regioni con intensità di fluorescenza molto bassa o lacune. Per quantificare queste osservazioni, sono stati creati grafici tridimensionali dell'intensità dell'anello Z. I grafici dell'intensità mostrano che la quantità di fluorescenza può variare fino a quattro volte in diverse regioni dell'anello Z di *bacillus subtilis*.I grafici tridimensionali dell'intensità mostrano che le interruzioni raggiungono quasi i livelli di base della fluorescenza di fondo, permettendo di analizzare i cambiamenti dinamici che avvengono all'interno dell'anello Z. Nel tempo, viene eseguita una sequenza temporale 3D sim. Questo filmato mostra come FTSZ all'interno dell'anello Z sottile del bacillo sia in continuo cambiamento ed è misurato mediante un grafico di intensità generato per ogni immagine.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare e preparare cellule batteriche, come osservarle mediante microscopia 3D Sim, come analizzarle per ottenere dati quantitativi e, infine, come produrre immagini di qualità adatte per presentazioni. È molto importante, durante l'acquisizione delle immagini, monitorare lo stato di salute delle cellule e anche il livello di espressione della proteina fluorescente durante l'acquisizione, dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo della biologia cellulare batterica, consentendo l'uso di altri metodi di microscopia a super risoluzione e la localizzazione di altre proteine batteriche in diversi organismi.Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguite altre forme di microscopia a super risoluzione, come la microscopia con localizzazione mediante attivazione fotochimica, per osservare le variazioni dinamiche della proteina FDS nel tempo.

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