Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare i cambiamenti dinamici nella proteina FTSZ durante la divisione cellulare nei batteri. Ciò si ottiene applicando cellule sottili di bacillo che esprimono la fusione FTS detta GFP sulla superficie di un piccolo cuscinetto di aros. Il tampone viene quindi capovolto e trasferito in una piastra di Petri con fondo in vetro.

Il secondo passo consiste nell'acquisire immagini time-lapse dei batteri durante la divisione cellulare utilizzando una microscopia a illuminazione strutturata 3D o un sistema di imaging SIM 3D. Successivamente, viene valutata la qualità dei dati grezzi e le immagini con una diminuzione di intensità superiore al 30% dovuta al fotosbiancamento vengono scartate. Il passo finale consiste nell'analizzare quantitativamente i cambiamenti nella localizzazione proteica durante la divisione cellulare misurando la distribuzione dell'intensità di fluorescenza della proteina F-T-S-Z-G-F-P nel tempo.

In definitiva, la SIM 3D veloce viene utilizzata per mostrare quanto siano dinamiche le proteine dione durante la divisione cellulare nei batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la microscopia confocale, è che otteniamo informazioni tridimensionali sui cambiamenti che si verificano nella divisione cellulare nelle cellule vitali. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla citocinesi batterica, potrebbe anche essere applicato ad altri sistemi in cui vogliamo osservare i cambiamenti dinamici delle proteine come le cellule M dei mammiferi.

Abbiamo avuto l'idea per la prima volta quando abbiamo visto le tradizionali immagini di simulazione 3D di cellule batteriche fissate che mostravano che la proteina FDZ non era distribuita in modo omogeneo attorno all'anello zed. Volevamo esaminare ulteriormente se questa distribuzione fosse collegata ai cambiamenti che si verificavano durante la costrizione dell'anello di Zed. In generale, le persone che sono nuove a questa tecnica avranno difficoltà a causa dell'incapacità di abbinare l'indice di rifrazione del loro olio al loro campione, e questo porterà a immagini di scarsa qualità.

Per preparare le cellule più sottili del bacillo per l'imaging, far crescere le cellule fino alla metà della fase esponenziale come descritto nel protocollo di testo. Quindi, fissare una cornice adesiva su un vetrino da microscopio in vetro standard rimuovendo prima il sottile foglio di poliestere. Quindi applicare la superficie adesiva esposta del telaio sulla superficie del vetrino del microscopio per creare efficacemente un pozzetto quadrato sulla parte superiore del vetrino, lasciare lo spesso foglio di poliestere attaccato al telaio per evitare che si attacchi del vetrino coprioggetto nei passaggi successivi.

Quindi, sciogliere una soluzione di aro nel microonde fino a far bollire la pipetta 67 microlitri di aros fusi nel telaio adesivo. Posizionare immediatamente un vetrino coprioggetti sopra l'aros per creare una superficie piana e lasciare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Rimuovere il vetrino coprioggetti per uno o due minuti durante la raccolta del campione.

Raccogliere un'aliquota di un millilitro del campione dopo la centrifugazione a 8.000 giri/min per i secondi, decantare il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di terreno fresco. Prelevare 2,5 microlitri di campione concentrato e pipettare sul tampone aros pre-preparato. Distribuire uniformemente il campione lungo la superficie piana del tampone aros.

Quindi rimuovere la cornice adesiva dal vetrino del microscopio utilizzando una pinzetta senza toccare il tampone aros. Trasferire il tampone aros dal microscopio. Far scorrere su una piastra di Petri di 35 millimetri di diametro con fondo in vetro.

Per l'imaging ad alta risoluzione. Capovolgere l'aros pad in modo che la sospensione cellulare sia a contatto con il vetrino coprioggetto della capsula di Petri. Il giorno dell'esperimento, accendere il sistema di imaging OMX 3D SIM almeno un'ora prima dell'imaging per consentire al sistema e ai laser di stabilizzarsi completamente.

Quindi accendere i diversi componenti come elencato nel protocollo di testo sulla workstation del controller master. Aprire il software OMX facendo clic sull'icona. Impostare il percorso del file per il salvataggio dei dati in una cartella di dati appropriata.

Quindi, avvia il software di lavoro morbido. Attiva i laser necessari per gli esperimenti nella schermata principale nella sezione dei parametri di luce. Attivare la telecamera FITC dalla selezione del canale e procedere al controllo dei parametri come elencato nel protocollo di testo.

Applicare una goccia di olio sulla parte superiore dell'obiettivo. Posizionare la piastra di Petri del campione contenente le cellule preparate nell'inserto del tavolino e coprire con il coperchio riscaldante circolare. Abbassare il tavolino fino a quando l'olio tocca il fondo della piastra di Petri del campione.

Lasciare che il piatto si scaldi e si equilibri per 15 minuti Nel tavolino utilizzando un'impostazione di esposizione bassa, mettere a fuoco il campione utilizzando i controlli del tavolino di posizionamento nanometrico. Metti a fuoco verso l'alto e verso il basso attraverso il campione per determinare se la luce si diffonde uniformemente sopra e sotto il piano focale del campione. Quindi utilizzare incrementi di 0,5 micron e contrassegnare la parte superiore e inferiore della pila di immagini prima di tornare al centro del campione nella scheda dell'esperimento, fare clic sul pulsante Ottieni spessore per impostare lo spessore di acquisizione del campione.

Determinare il valore massimo di intensità dell'immagine campione con le impostazioni correnti di esposizione e percentuale di luce trasmessa. Questo valore si trova sotto la finestra dell'immagine. Per l'imaging time-lapse, regolare l'esposizione e la percentuale di luce trasmessa per ottenere un'intensità massima compresa tra 1100 e 1400.

Sopra lo sfondo. Per l'immagine, attiva la sezione time lapse nella scheda dell'esperimento. Impostare la frequenza dei fotogrammi richiesta e il tempo totale nel file di dati.

Immettere un nome file appropriato. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare l'acquisizione dell'immagine all'inizio dell'acquisizione dell'immagine. Annotare il valore di intensità massima dell'immagine all'inizio dell'acquisizione dell'immagine per il primo fotogramma della serie temporale.

Al termine dell'acquisizione del primo fotogramma, verificare che non ci sia stata una diminuzione superiore al 10% dell'intensità del segnale attraverso lo Zack per questo primo fotogramma. Al termine dell'acquisizione della serie storica, aprire il file di immagine grezza risultante con un suffisso DV e accertare la diminuzione dell'intensità massima del segnale dall'inizio della serie temporale all'immagine finale. Scartare tutti i punti temporali in cui c'è stato più del 30% di sbiancamento fotografico dal menu del processo, attivare la finestra di ricostruzione SI.

Utilizzare le impostazioni preesistenti per tutti i parametri. Attivare il pulsante OTF specifico del canale utilizzato e impostarlo sul set di filtri standard. Attivare il pulsante degli angoli KO specifici del canale utilizzato e impostarlo sul set di filtri standard.

Trascina e rilascia il file raw nello spazio del file di input. Fare clic su Fallo. Esamina la distribuzione di FTSZ attorno all'anello Z per creare grafici di intensità 3D.

Quindi apri un file immagine 3D. Per visualizzare le singole sezioni z. Utilizzare lo strumento di visualizzazione del volume situato nella scheda del menu di visualizzazione.

Per ritagliare una regione di interesse, inserire il numero della finestra per questa immagine 3D nella finestra di input e inserire un numero di finestra nuovo e inutilizzato nella finestra di output. Il pulsante di selezione della regione sarà disponibile per ritagliare un singolo anello Z di interesse dal campo visivo originale di 40 x 40 micron. Regolare l'asse e il grado di rotazione desiderati nella scheda di rotazione.

Fare clic sul pulsante Fallo. Scorrere il volume per ottenere la prospettiva desiderata, l'anello Z. Utilizza lo strumento di ispezione dati per regolare le dimensioni delle righe delle colonne per creare una nuova area di interesse attorno a un singolo anello Z.

Fare clic sul centro dell'immagine per posizionare questa nuova regione di interesse. I dati dell'immagine di testo sono una tabella generata automaticamente che mostra l'intensità di fluorescenza di ciascun pixel all'interno della regione di interesse. Fare clic sul pulsante Grafico 3D per visualizzare inizialmente il grafico dell'intensità.

In alternativa, i dati dell'immagine di testo possono essere esportati facendo clic sul pulsante Salva dati tabella. Nel menu File, copiare i dati dell'immagine dal file di testo salvato in un nuovo foglio di calcolo. Seleziona tutte le celle all'interno del foglio di calcolo e crea un nuovo grafico di superficie 3D.

Formattare il grafico del grafico dell'intensità 3D per la pubblicazione dei dati time-lapse. Ripetere questi passaggi su ciascuno dei diversi punti temporali del file immagine 3D. Quando visualizzato dalla microscopia a fluorescenza convenzionale a campo largo, l'anello Z appare come una singola banda trasversale di fluorescenza nei sottili bacilli.

L'intensità della fluorescenza in tutta questa banda è uniforme. Il modello di localizzazione offre poche informazioni sull'organizzazione strutturale e sulla distribuzione dei polimeri FTS all'interno dell'anello, qui vengono esaminate le stesse cellule. Utilizzando il metodo di simulazione 3D VELOCE.

La rotazione dell'immagine della simulazione 3D attorno all'asse Z consente la visualizzazione dell'anello Z come una vera e propria struttura ad anello nello spazio tridimensionale. Il miglioramento della risoluzione consente la visualizzazione della distribuzione eterogenea di FTSZ all'interno dell'anello. Ulteriori esempi di anelli Z di Bacillus visualizzati con questa tecnica illustrano come l'intensità della fluorescenza attorno all'anello Z non sia mai la stessa.

Inoltre, si osservano regioni con intensità di fluorescenza molto bassa o lacune. Per quantificare queste osservazioni, sono stati creati grafici 3D di intensità dell'anello Z. I grafici di intensità mostrano che la quantità di fluorescenza può variare fino a quattro volte in diverse regioni dell'anello Z più sottile del bacillo.

I grafici di intensità 3D mostrano che gli spazi vuoti leggono quasi i livelli di base della fluorescenza di fondo per analizzare i cambiamenti dinamici che si verificano all'interno dell'anello Z. Nel corso del tempo, viene eseguito il time-lapse della simulazione 3D. Questo filmato mostra come FTSZ all'interno dell'anello Z sottile del bacillo cambi costantemente e venga misurato con un grafico di intensità che viene generato per ogni immagine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e preparare le cellule batteriche, come visualizzarle utilizzando la simulazione 3D, come analizzarle per ottenere dati quantitativi e, infine, come fornire immagini di qualità di presentazione. È molto importante durante l'acquisizione dell'immagine monitorare la salute delle cellule e anche monitorare il livello di espressione della proteina fluorescente durante l'acquisizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ad altre persone nel campo della biologia cellulare batterica per utilizzare altri metodi di microscopia a super risoluzione e per localizzare altre proteine batteriche in diversi organismi.

Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguite altre forme di microscopia a super risoluzione, come la microscopia di localizzazione fotoattivata per dare un'occhiata ai cambiamenti dinamici nella FDS detta proteina nel tempo.