Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari
13 gennaio 2021
Presentato qui è un protocollo per l'imaging a cellule vive a super-risoluzione nel tessuto intatto. Abbiamo standardizzato le condizioni per l'imaging di una popolazione di cellule staminali adulte altamente sensibile nel suo ambiente di tessuti nativi. Questa tecnica prevede il bilanciamento della risoluzione temporale e spaziale per consentire l'osservazione diretta dei fenomeni biologici nei tessuti vivi.
Il nostro protocollo utilizza sonde fluorofore regolari e semplici tecniche di preparazione dei campioni che mantengono la cellula immagine in condizioni fisiologiche per studiare un processo cellulare altamente dinamico e strutture subcellulari dettagliate. Questa tecnica ci permette di indagare i processi cellulari ad una super risoluzione e in condizioni fisiologiche per un lungo periodo senza sacrificare né la risoluzione speciale né temporanea. Inizia tagliando una membrana di dialisi di taglio del peso molecolare da 12 a 14 kilodalton in piccoli pezzi e immergendo i pezzi con 100 microlitri di mezzo cellulare vivo per circa cinque minuti.
Mentre le membrane sono in ammollo, tagliare l'anello esterno di un tubo da 50 millilitri a piccoli pezzi e sterilizzare i pezzi in 70%etanolo. Per la dissezione e il montaggio dei teste, trasferire le mosche anestetizzate di dieci o tre giorni in una piastra di dissezione al microscopio di sezionamento e utilizzare forcep fini per rimuovere i teste. Una volta raccolti tutti i tester, lavare i tester due volte in mezzo a cellule vive e utilizzare una punta di pipetta per stendere da 100 a 150 microlitri di mezzo cellulare vivo al piatto inferiore di vetro preparato.
Utilizzare forcep fini per trasferire i tester di mosca al centro del piatto e rimuovere tutti tranne circa 10 microlitri del mezzo. Rapidamente, posizionare la membrana pre-bagnata sui teste e posizionare da due a tre piccoli pesi di plastica sulla membrana. Immediatamente, aggiungere da 100 a 150 microlitri di mezzo fresco a cellule vive e riposizionare l'anello sul lato elevato del piatto.
Posizionare il coperchio scivolare di nuovo sull'anello e ruotare un pezzo di carta velina in acqua prima di posizionare la carta sul foglietto di copertura. Quindi, coprire il piatto con un coperchio e fissare il piatto sul palco di un microscopio a super risoluzione. Per l'imaging di cellule staminali germinali, aprire il software di imaging e accendere la luce trasmessa.
Utilizza l'obiettivo 63X per concentrarti sul tessuto dei teste e accendere i laser. Fare clic su Live" per individuare le cellule staminali germinali. Regola lo stato attivo e fai clic su Dimensioni fotogramma"per impostare le dimensioni del fotogramma su 512 per 512 e 1024 per 1024 pixel e media"per impostare la media fotogrammi su uno o due.
Fare clic su Guadagno master"per impostare il guadagno di moltiplicazione degli elettroni su meno di 800 e laser"per impostare la potenza del laser sull'1%-2%Ingrandisci la regione o la cella di interesse per ridurre il tempo di acquisizione dell'immagine e ridurre lo sbiancamento delle foto e confermare che l'immagine è stata configurata in modo ottimale prima di fare clic su Avvia esperimento"per avviare l'acquisizione dell'immagine time lapse. Se Airyscan Acquisition non è configurato in modo ottimale", fare clic su Optimal"nelle sezioni frame size, Z-Stack e Scan Area" e ottimizzare l'intervallo di tempo, il numero di fette Z e la durata dell'imaging time-lapse, in base al design sperimentale e al tipo di campione. Dopo l'imaging, selezionate Elaborazione, Batch" e Elaborazione Airyscan e selezionate le immagini da elaborare.
Quindi fare clic su Esegui processo"per ottenere le immagini con super risoluzione. L'imaging a cellule vive di test di drosofilia che esprimono GFP di tubulina alfa nelle cellule germinali in fase iniziale utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, consente la visualizzazione dell'intensità asimmetrica dei segnali GFP a due centrosomi, come un segnale più luminoso al centrosoma madre e un segnale relativamente più debole ai centrosomi figli. La differenza di luminosità è probabilmente riflessa dall'asimmetria temporale della nucleazione del microtubulo, ma la morfologia dettagliata e la quantità dei microtubuli non possono essere risolte usando la microscopia confocale a disco rotante.
Al contrario, l'imaging a super risoluzione delle cellule vive consente la visualizzazione e la quantificazione della morfologia e dei numeri dei microtubuli. Questa migliore risoluzione rivela anche modelli di nucleazione asimmetrica dei microtubuli, allungamento e maggiore interazione con la membrana nucleare. L'imaging a cellule vive consente anche la visualizzazione dell'invaginazione asimmetrica della membrana nucleare, ma non dei singoli microtubuli che entrano direttamente nel nucleo.
Al contrario, questa tecnica di super risoluzione delle cellule vive permette l'osservazione diretta di questi eventi mediante imaging simultaneo sia dei microtubuli che della lamina nucleare. Durante la metafase, entrambi i centromeri sorelle possono essere rilevati come un unico segnale usando la microscopia a disco rotante, anche se l'attacco centrale del microtubulo non può essere osservato. Al contrario, l'imaging dal vivo a super risoluzione consente la visualizzazione dell'attacco barimero microtubulo nella propase precoce.
Assicurarsi di posizionare una membrana sopra i tester per assicurarsi che non si muovano o galleggino durante l'imaging e per ottimizzare le impostazioni del microscopio per evitare lo sbiancamento delle foto e la tossicità fotografica. Ci sono molti modi in cui questo metodo può essere applicato, ad esempio per indagare la dinamica proteica, lo stress lineare o le difese e i processi cellulari.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per l'immagine in tempo reale a super-risoluzione in tessuto integro, finalizzato allo studio di processi cellulari dinamici all'interno di una popolazione di cellule staminali adulte nel loro ambiente naturale. Esso bilancia la risoluzione temporale e spaziale per osservare efficacemente fenomeni biologici in tessuto vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Microscopia
- Imaging di cellule vive
Contesto
- Importanza del mantenimento delle condizioni fisiologiche nell'acquisizione di immagini
- Sfide nell'osservazione di processi cellulari dinamici
- Confronto con le tecniche tradizionali di microscopia
Metodi Utilizzati
- Microscopia vitale a super-risoluzione
- Testicoli di Drosophila come sistema biologico
- Utilizzo di sonde fluorofore e microscopia confocale a disco rotante
Risultati principali
- Visualizzazione migliorata della dinamica e della morfologia dei microtubuli
- Messa in evidenza della nucleazione asimmetrica dei microtubuli e delle interazioni con la membrana nucleare
- Permessi l'osservazione dell'attacco del centromero durante la metafase e la profase
Conclusioni
- Questo studio dimostra l'efficacia dell'imaging a super-risoluzione nell'osservazione della dinamica cellulare.
- Il metodo contribuisce in modo significativo alla comprensione dei processi cellulari nella biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging in tempo reale a super-risoluzione in tessuti intatti consente un'osservazione ad alta fedeltà di processi subcellulari dinamici in condizioni fisiologiche, colmando una lacuna critica nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistica. Preservando la risoluzione spaziale e temporale senza richiedere sonde specializzate o un'elevata illuminazione, questo metodo supporta schermate fenotipiche affidabili e lo sviluppo di saggi in sistemi rilevanti per le malattie. La sua compatibilità con fluorofori endogeni a bassa intensità amplia l'applicabilità ai flussi di lavoro della scoperta precoce, dove la sicurezza del bersaglio e il valore predittivo sono fondamentali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette la visualizzazione diretta dell'interazione con il bersaglio e della localizzazione subcellulare nel contesto nativo del tessuto, riducendo l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Consente la verifica di ipotesi riguardo alla dinamica proteica e alla formazione di complessi senza artefatti da fissazione.
- Valore traslazionale: Facilita la valutazione della fiducia sul bersaglio in modelli rilevanti per la malattia, come le nicchie di cellule staminali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative della morfologia dei microtubuli, dei modelli di nucleazione e delle interazioni con gli organelli, utili per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Consente l'acquisizione di immagini in time-lapse con bassa fototossicità, supportando campagne di screening longitudinali.
- Valore traslazionale: Genera dati riproducibili ad alto contenuto informativo, adatti alla validazione dei risultati positivi e all'ottimizzazione dei composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la fase di scoperta a quella preclinica osservando i processi cellulari in tessuti integri in condizioni prossime a quelle fisiologiche.
- Valore operativo: Mantiene la morfologia del tessuto e la funzione cellulare per periodi prolungati di imaging, favorendo studi longitudinali.
- Valore traslazionale: Permette osservazioni correlate a biomarcatori, come il rimodellamento della membrana nucleare e l'asimmetria del centrosoma.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro delle prime fasi di scoperta fornendo letture a super-risoluzione che orientano le decisioni di validazione del bersaglio e di identificazione dei composti attivi prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Permette un'indagine basata su ipotesi sulla dinamica del citoscheletro e sulle interazioni nucleo-citoplasmatiche in tessuti vivi.
- Screening: Fornisce output di imaging quantitativi e riproducibili, adatti alla standardizzazione dei saggi e alla valutazione degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera set di dati a super-risoluzione che quantificano il numero di microtubuli, le velocità di allungamento e l'organizzazione spaziale, per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dall'osservazione a livello subcellulare ai fenotipi a livello tissutale nelle nicchie di cellule staminali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile, applicabile a diversi tipi cellulari e modelli di malattia senza necessità di progettazione di sonde.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva risolvendo meccanismi subcellulari invisibili alla microscopia limitata dalla diffrazione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso l'immobilizzazione dei campioni, l'acquisizione con laser a bassa intensità e flussi di lavoro per l'elaborazione in batch.
- Valore strategico: Riduce l'abbandono in fasi avanzate migliorando la validazione degli obiettivi in contesti fisiologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di avanzamento corrette in base al rischio grazie alla riduzione del rischio meccanicistica degli obiettivi citoscheletrici e nucleoscheletrici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di tessuti vivi, nella microscopia a super-risoluzione e nelle procedure di elaborazione delle immagini.
- Presuppone l'accesso a sistemi di super-risoluzione dotati di Airyscan o capacità equivalenti e a camere di controllo ambientale.
- Necessita di una standardizzazione della preparazione del campione, del montaggio e della composizione del mezzo tra diversi utenti e sedi.
- Comporta considerazioni di adattamento relative alla diversa fragilità dei tessuti, all'autofluorescenza e alla accessibilità genetica al di là del testicolo di Drosophila.
- È limitato dalla necessità di etichettare geneticamente le proteine bersaglio con fluorofori compatibili, come EGFP o mCherry, a livelli endogeni.
