Name: Imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri l'imaging a superrisoluzione con microscopia confocale e rilevamento multiplex. Questo protocollo consente di ottenere risoluzione di circa 120 nm per studiare strutture subcellulari dinamiche in cellule fisse e vive.

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<ol><li>Prakash, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+in+super-resolution+microscopy+-+definition%2C+trade-offs+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).</li>
<li>Bond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+advances+in+super-resolution+microscopy+to+study+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes.</a> Mol Cell. 82, 315-332 (2022).</li>
<li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+2D+super-resolution+mode+for+ZEISS+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nat Methods. 14, 1223(2017).</li>
<li>Wu, X., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEISS+Airyscan%3A+Optimizing+Usage+for+Fast+Gentle%2C+Super-Resolution+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging.</a> Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).</li>
<li>Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+strategy+for+fast+super-resolution+imaging+parameters+based+on+LSM+900%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900.</a> Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).</li>
<li>Moore, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cables+and+comet+tails+organize+mitochondrial+networks+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis.</a> Nature. 591, 659-664 (2021).</li>
<li>Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+live+cell+imaging+of+subcellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution live cell imaging of subcellular structures.</a> J Vis Exp. (167), e61563(2021).</li>
<li>Harmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super+resolution+microscopy+to+study+trypanosomatid+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology.</a> Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).</li>
<li>Lin, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+functions+and+management+of+laser+scanning+confocal+microscopy+LSM880+with+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chin+Electron+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan.</a> J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+imaging+characteristics+and+applications+of+LSCM880+with+Airyscan+and+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Innov+Appl%22%5BJournal%5D)">Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy.</a> Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Vasohibin+1+speeds+contraction+and+relaxation+in+failing+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes.</a> Circ Res. 127, 14-27 (2020).</li>
<li>Sandin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+simultaneous+laser+scanning+confocal+and+atomic+force+microscopy+%28conpokal%29+on+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells.</a> J Vis Exp. (162), e61433(2020).</li>
<li>Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Imaging+of+Proteus+mirabilis+biofilm+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy.</a> J Vis Exp. (221), e67932(2025).</li>
<li>Wolf, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+live-cell+super-resolution+imaging+of+mitochondrial+cristae+and+quantification+of+submitochondrial+membrane+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials.</a> Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).</li>
<li>Wu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+perylene+carboximide+fluorophores+for+live-cell+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging.</a> J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).</li>
<li>Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+suppress+the+release+of+vaccinia+virus+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells.</a> J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).</li>
<li>Kolossov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super-resolution+microscopy+of+mitochondrial+morphology+and+dynamics+in+living+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells.</a> Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+macrophages+monitor+and+remove+particles+from+urine+to+prevent+tubule+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction.</a> Immunity. 57, 106-123 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Celle COS7</td><td>ATCC (o simili)</td><td>CRL-1651</td><td>Linea cellulare di fibroblasti renali della scimmia verde africana. Utilizzato per la preparazione di campioni a cellula fissa per immagini multicolore a super-risoluzione &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; IgG anti-topo per asini, coniugato Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen (o simili)</td><td>A10037</td><td>Anticorpo secondario per la colorazione dei microtubuli. Usato a diluizione 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM), alto livello di glucosio</td><td>Gibco (o simile)</td><td>11965092</td><td>Mezzo di coltura standard per cellule COS7, integrato con FBS al 10%.</td></tr><tr><td>&nbsp; Siero bovino fetale (FBS), inattivato dal calore</td><td>Gibco (o simile)</td><td>10082147</td><td>Integratore siero usato al 10% (v/v) in tutti i mezzi di coltura cellulare.</td></tr><tr><td>&nbsp; Pannello di imaging con fondo di vetro (35 mm, piatto &micro;-Dish, #1.5 copertura polimerica, spessore 0,17 mm)</td><td>ibidi (o simili)</td><td>81156</td><td>Substrato per la placcatura cellulare e l'imaging di immagini. Fondamentale per la compatibilità con obiettivi di immersione in olio ad alto NA.</td></tr><tr><td>&nbsp; Elaborazione delle immagini e software di analisi (moduli ZEN)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (blu)</td><td>Utilizzato per la ricostruzione 3D, l'elaborazione a super-risoluzione (ad esempio, elaborazione Airyscan), la misurazione PSF e l'analisi SNR.</td></tr><tr><td>&nbsp; ImageJ / Fiji</td><td>Open Source</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per ulteriori ricostruzioni 3D, generazione di viste ortogonali e analisi generale delle immagini.</td></tr><tr><td>&nbsp; Olio a immersione (Indice di rifrazione = 1,518)</td><td>Carl Zeiss (o simile)</td><td>444960-0000-000</td><td>Da usare con obiettivi a immersione in olio (ad esempio, 63x/1,4 NA).</td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema di microscopio confocale a scansione laser con rivelatore multiplex array (ad esempio, ZEISS LSM 900 con Airyscan 2)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 900 (Airyscan 2)</td><td>La principale piattaforma di imaging utilizzata per tutte le modalità confocali e super-risoluzione descritte nel protocollo.</td></tr><tr><td>&nbsp; Medium Essenziale Minimo (MEM) con Earle' s Sali</td><td>Gibco (o simile)</td><td>11095080</td><td>Mezzo di coltura standard per cellule Hep3B, integrato con FBS al 10%.</td></tr><tr><td>&nbsp; Anticorpo monoclonale anti-&alfa-tubulina del topo (Clone DM1A)</td><td>Sigma-Aldrich (o simili)</td><td>T6199</td><td>Anticorpo primario per la marcatura dei microtubuli. Usato a diluizione 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Paraformaldeide (PFA), 4% nel PBS</td><td>&nbsp; Jinpan&nbsp; (o simili)</td><td>TBS5083</td><td>Fissativo per le cellule. Usa a temperatura ambiente per 15 minuti. Gestisci con le dovute precauzioni.</td></tr><tr><td>&nbsp; Mezzo di imaging privo di fenolo rosso</td><td>Gibco (o simile)</td><td>21063029</td><td>Mezzo a bassa autofluorescenza utilizzato per l'imaging di cellule vive. Pre-equilibrato con il 5% di CO2 a 37&deg; C prima dell'uso.</td></tr><tr><td>&nbsp; Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>CellWorld (o simili)</td><td>C0162-311</td><td>Utilizzato come buffer di lavaggio e diluizione per tutto il protocollo.</td></tr><tr><td>&nbsp; Montante antifade d'oro ProLong</td><td>Invitrogen (o simili)</td><td>P36930</td><td>Mezzo di montaggio indurito per preservare la fluorescenza in campioni fissi.</td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (o simili)</td><td>T8787</td><td>Utilizzato allo 0,1% (v/v) per la permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td>&nbsp; Preadolescente-20</td><td>Sigma-Aldrich (o simili)</td><td>P9416</td><td>Utilizzato allo 0,05% (v/v) nel PBS (PBST) per i passaggi di lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V</td><td>Sigma-Aldrich (o simili)</td><td>A7906</td><td>Usata all'1% (w/v) nel PBS per bloccare e come componente del tampone di diluizione degli anticorpi.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo)</td><td>Sigma-Aldrich (o simili)</td><td>D9542</td><td>Controcolorazione nucleare. Utilizzato a una concentrazione finale di 1 & micro; g/mL.</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di Asino, coniugato Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen (o simili)</td><td>A21206</td><td>Anticorpo secondario per la colorazione mitocondriale. Usato a diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti (Beads), diametro 100 nm</td><td>Invitrogen (ad esempio, TetraSpeck&trade;) o simili</td><td>T7279</td><td>Utilizzato per la misurazione empirica del sistema' funzione di diffusione dei punti (PSF) e risoluzione.</td></tr><tr><td>Cellule Hep3B che esprimono in modo stabile EGFP-mitocondri</td><td>IMMOCELL</td><td>IM-H367</td><td>Linea cellulare di epatoma umana ingegnerizzata per esprimere stabilmente EGFP mirata alla matrice mitocondriale. Utilizzato per l'imaging time-lapse di cellule vive.</td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES, 1 M</td><td>Gibco (o simile)</td><td>15630080</td><td>Utilizzato a una concentrazione finale di 25 mM in un mezzo di imaging per la stabilizzazione del pH durante immagini dal vivo all'esterno di un incubatore CO2.</td></tr><tr><td>Vetro coperto ad alta precisione (#1.5, spessore 0.17 mm)</td><td>Marienfeld (o simile)</td><td>107052</td><td>Utilizzato per montare campioni fissi.</td></tr><tr><td>Software operativo per microscopio (ad esempio, edizione ZEN blue)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (blu)</td><td>Utilizzato per il controllo di sistema, l'acquisizione di immagini e l'elaborazione di base.</td></tr><tr><td>Obiettivo obiettivo: Plan-apochromat 63x/1.40 NA DIC a olio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>421462-9900-000</td><td>Obiettivo principale utilizzato per l'imaging ad alta risoluzione.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-TOMM20 Rabbit</td><td>Abcam (o simile)</td><td>ab186735</td><td>Anticorpo primario per la marcatura dei mitocondri. Usato a diluizione 1:1000 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex

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