Imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di metodi di imaging a super-risoluzione accessibili per visualizzare strutture subcellulari dinamiche, superando il limite di diffrazione della microscopia convenzionale. Il metodo super-risoluzione affronta fototossicità, funzionamento complesso e preparazione specializzata. Questo protocollo riduce queste barriere attraverso il rilevamento multiplex basato su confocale.

Per cominciare, accendi l'unità principale del microscopio, il modulo di lancio laser, la sorgente luminosa LED e il computer di controllo. Avvia il software operativo del microscopio. Dall'interfaccia principale, seleziona GFP, poi scegli spegnere la luce riflessa.

Naviga fino al pannello Acquisizione. Dal menu a tendina degli obiettivi, seleziona l'obiettivo appropriato. Per l'imaging a cellule vive, 45-60 minuti prima dell'imaging, attivano la camera ambientale e il sistema attivo di stabilizzazione a fuoco.

Dopo che il sistema è stato stabilizzato, verifica la stabilità utilizzando i sensori a camera. Applica olio a immersione sull'obiettivo frontale senza introdurre bolle. Posiziona il campione preparato sul palco del microscopio.

Alzalo con attenzione finché il sottocoperto non entra in contatto con l'olio a immersione. Poi, apri il software di acquisizione. Vai nella scheda Acquisizione e seleziona crea un nuovo esperimento.

Ora, aggiungi tracce di imaging per i fluorofori usati. Per ogni tracciato, imposta il diametro del foro stenopeico confocale a un'unità d'aria. Per ottimizzare la potenza del laser, seleziona il primo canale e passa alla modalità di scansione in tempo reale.

Imposta la potenza laser iniziale a un valore basso, poi imposta il guadagno del rivelatore a un livello moderato all'interno del suo intervallo lineare. Dopodiché, aumenta gradualmente la potenza del laser finché le strutture del bersaglio non sono chiaramente visibili sopra lo sfondo nell'immagine in tempo reale. Imposta la dimensione dei pixel usando il pulsante Nyquist del software per calcolarla automaticamente.

Poi, imposta il tempo dei pixel. Ora, seleziona la modalità scansione sequenziale tra le tracce per minimizzare la diafonia. Clicca su Snap per acquisire una singola immagine.

Salva l'immagine con i metadati pertinenti. Per impostazioni coerenti tra le sezioni ottiche, confermare che tutti i parametri di imaging siano configurati su un unico piano focale ottimale prima di definire lo stack Z. Apri la scheda Acquisizione e seleziona la modalità Z-stack.

Definisci il volume di interesse usando una scansione live a velocità elevata per concentrarti prima sulla struttura più bassa di interesse, poi clicca su Imposta Ultimo o Fondo. Regola con attenzione la messa a fuoco verso l'alto verso la struttura di interesse e clicca su Imposta prima o in cima. Il software mostrerà quindi la profondità totale.

La dimensione dello stack Z è impostata per soddisfare il criterio di campionamento di Nyquist. Usa il pulsante Ottimale per calcolarlo automaticamente. Dopo aver configurato i parametri di imaging per ogni canale, aumentare leggermente la potenza o il guadagno del laser per segnali deboli rispetto a un'immagine bidimensionale singola.

Avvia l'acquisizione per raccogliere l'intera pila di immagini. Per la visualizzazione, usa il modulo di elaborazione nativo del microscopio. Genera proiezioni di massima intensità per vedere tutti i segnali a fuoco in un'unica immagine bidimensionale.

Successivamente esegui il rendering volumetrico utilizzando gli algoritmi integrati del software per generare una rappresentazione tridimensionale. Regola luminosità, opacità e illuminazione secondo necessità. Successivamente, si generano sezioni trasversali ortogonali XZ e YZ per ispezionare l'estensione assiale e la registrazione.

L'imaging a fluorescenza multicolore delle cellule COS-7 fissate ha mostrato che nuclei, mitocondri e microtubuli erano chiaramente marcati con una sovrapposizione minima, confermando una scansione sequenziale efficace e una rilevazione ottimizzata. La proiezione di massima intensità integra i segnali su tutte le sezioni ottiche, evidenziando la distribuzione spaziale delle strutture marcate fluorescente. Una ricostruzione tridimensionale fornisce una visione consapevole della profondità dell'architettura campionaria.

L'imaging time-lapse di cellule Hep 3B vive con mitocondri marcati con EGFP viene confrontato tra le modalità. I fotogrammi confocali attraverso i punti temporali mostrano strutture chiare, ma una perdita graduale del segnale. I fotogrammi standard a super risoluzione o SR mostrano una risoluzione più alta, ma con un aumento dello sbiancamento fotografico nel tempo.

Le immagini a super risoluzione rapida o SR-4Y mantengono una fluorescenza stabile anche in momenti di tempo successivi. Il grafico dell'intensità media di fluorescenza EGFP su 100 punti temporali dimostra che la modalità SR-4Y ha mantenuto il segnale più stabile. Le prestazioni di imaging nelle celle COS-7 fisse venivano confrontate tra le modalità, e le modalità a super-risoluzione fornivano dettagli strutturali più chiari rispetto a quelle confocali.

La misurazione della funzione di diffusione puntuale utilizzando perle fluorescenti da 100 nanometri ha mostrato che Airyscan SR con la successiva deconvoluzione articolare migliorava sia la risoluzione laterale che assiale rispetto alla sola Airyscan SR. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la morfologia degli organelli, la dinamica del citoscheletro e la localizzazione delle molecole sia in cellule fisse che in quelle vive a una risoluzione di circa 120 nanometri. La considerazione più critica di questo protocollo è la preparazione meticolosa del campione utilizzando vetro di copertura di alta qualità e una colorazione ottimizzata per garantire l'integrità del segnale per un processo a super-risoluzione.

Seguendo questa procedura, i ricercatori possono eseguire analisi quantitative delle immagini, come la misurazione del rapporto segnale-rumore o la colocalizzazione, utilizzando software dedicati come ImageJ.