Imaging di transitori veloci di calcio nelle terminazioni nervose di topo mediante microscopia confocale

Inizia con una camera sperimentale rivestita in elastomero siliconico contenente un muscolo di topo fissato posizionato sotto un microscopio confocale.

Il muscolo è immerso in una soluzione fisiologica contenente inibitori che bloccano le contrazioni muscolari.

Il moncone nervoso marcato con un colorante di calcio fluorescente è posizionato all'interno dell'elettrodo di aspirazione, che è collegato a uno stimolatore elettrico.

Alla giunzione neuromuscolare, il nervo periferico è collegato al muscolo.

Applicare uno stimolo elettrico al nervo usando l'elettrodo. Questo innesca un rapido afflusso di ioni calcio che si legano al colorante intracellulare di calcio.

Illuminare la giunzione neuromuscolare per eccitare il colorante di calcio, provocandone la fluorescenza.

Quindi, acquisisci immagini ad alta risoluzione per registrare rapidi transitori di calcio nelle terminazioni nervose periferiche.

Seleziona la regione di interesse e misura l'intensità della fluorescenza.

Un rapido aumento dell'intensità della fluorescenza indica un afflusso di calcio alle terminazioni nervose periferiche, mentre una diminuzione riflette la clearance del calcio.

Riempire il sistema di perfusione con la soluzione di Ringer contenente 10 micromolari di D-tubocurarina e accendere la pompa di aspirazione per perfusione per avviare la perfusione. Nel microscopio confocale a scansione laser, o software LSCM, scegliere l'elettrofisiologia e la modalità di acquisizione per impostare i parametri di imaging. Nelle impostazioni del menu Lavoro, selezionare le impostazioni di trigger per attivare lo stimolatore con l'impulso di sincronizzazione del microscopio e impostare il Trigger Out on Frame Field sul canale OUT 1.

Impostare la modalità di scansione su xyt a una frequenza di scansione di 1.400 Hertz. Il fattore di zoom dovrebbe essere 6.1 con il foro stenopeico completamente aperto. Assicurarsi che la modalità x bidirezionale con passaggio sequenziale sia attiva. Quindi imposta il tempo minimo per formare un fotogramma a 52 millisecondi e raccogli i fotogrammi in un video grezzo a 20 fotogrammi. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser ad argon a 488 nanometri, con l'8% della potenza di uscita.

Una volta impostati i parametri, premere il pulsante Live Mode per ottenere un'anteprima dal vivo dei terminali nervosi caricati con il colorante. In modalità live, cerca la regione di interesse, o ROI, per ottenere la messa a fuoco migliore, quindi sposta il ritardo sullo stimolatore di 2 millisecondi in meno rispetto al valore precedente. Ed esegui il software di acquisizione dati per acquisire 26 sequenze spostando ogni sequenza di due millisecondi dalla precedente.