Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare la formazione complessa di proteine SNARE in cellule vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico di membrana, come l'identificazione degli insiemi di proteine SNARE che catalizzano le specifiche fasi del traffico degli organelli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione diretta delle posizioni cellulari in cui gli SNARE si impegnano in una formazione complessa.

In questo esperimento, per la trasfezione vengono utilizzate 900.000 cellule HeLa divise tra tre provette Eppendorf. Trasfetta le celle come descritto nel protocollo di testo con i seguenti costrutti. Campione numero uno con il costrutto sintaxina-4 mcitrino, campione numero due con sintassimina-4 mCitrine e VAMP3-mCherry e campione numero tre con sintassimina-3 fusa sia con mCitrine che con mCherry.

Colture di cellule trasfettate in DMEM ad alto contenuto di glucosio fornito con il 10% di FCS e l'1% di antibiotico antimicotico a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 in un incubatore per colture cellulari durante la notte. Il giorno seguente, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con il terreno di imaging di cellule vive per due minuti. Successivamente, posizionare le cellule in un nuovo terreno di imaging.

Per iniziare questa procedura, posizionare il campione numero due a 37 gradi Celsius, su un tavolino riscaldato, sotto un microscopio confocale per imaging a fluorescenza nel dominio del tempo con una sorgente di eccitazione pulsata per il fluoroforo donatore e l'acquisizione dei dati risolta nel tempo. Prima di ogni microscopia di imaging a fluorescenza o misurazione FLIM, selezionare una cellula con espressione visibile delle proteine SNARE marcate con mCitrine e mCherry e registrare un'immagine confocale di 256 x 256 pixel con eccitazione simultanea di entrambi i fluorofori. Registrare un'immagine FLIM facendo clic su Esegui FLIM con l'immagine FLIM registrata con le stesse dimensioni e risoluzione spaziale dell'immagine confocale registrata in precedenza.

Registrare l'immagine con almeno 50.000 fotoni per l'analisi FLIM a cella intera o almeno 400 fotoni per pixel. È importante registrare le misurazioni FLIM ad almeno un micrometro di distanza dalla superficie del vetro per evitare una vista riflessa. Ripetere l'imaging da più celle nel campione numero due e per le celle nel campione numero uno e nel campione numero tre.

Quindi, posizionare un vetrino di vetro pulito sul tavolino del microscopio per registrare una funzione di risposta dello strumento o IRF. Sintonizzare il monocromatore del rivelatore di emissione sulla lunghezza d'onda di eccitazione e fare clic sul pulsante esegui FLIM per registrare un'immagine FLIM con la diffusione posteriore dal vetrino coprioggetti. Le registrazioni fotografiche verranno convertite in immagini FLIM con il software di conversione PT32ICS.

Configurare il software. Impostare l'output su ImageJ per la generazione di immagini FLIM. Impostate le dimensioni dell'immagine su 256 x 256 pixel e il canale su due.

Premi converti e carica una o più tracce di fotoni. Tenere premuto il tasto Ctrl per selezionare più tracce di fotoni. Le immagini FLIM devono essere generate nella stessa cartella in cui sono salvate le tracce dei fotoni.

Inizia aprendo il programma software di analisi dei dati in grado di adattarsi con la deconvoluzione. Importa il file di testo contenente l'istogramma per ogni traccia di fotone. Riorganizzare la tabella in modo che l'IRF si trovi nella seconda colonna della tabella, accanto ai valori temporali nella colonna A.Determinare la qualità delle tracce di fotoni registrate selezionando tutte le colonne.

Non analizzare tracce di fotoni con un picco di riflessione elevato. Di seguito è riportato un esempio. Utilizzare il tasto Ctrl per selezionare tutte le colonne contenenti gli istogrammi di durata controllata di qualità che verranno montati, nonché l'IRF nella colonna B, e caricare il raccordo non lineare.

Caricare la funzione di adattamento deconvoluto aggiungendo questa funzione al software di analisi. Selezionare il file della funzione di adattamento. Questa funzione si adatta agli istogrammi del tempo di vita della fluorescenza con una funzione di decadimento monoesponenziale deconvoluta con l'IRF.

Eseguire la scalatura dell'asse X delle curve adattate. Adatta le curve premendo Adatta. Questo convertirà l'adattamento e genererà un foglio di report nell'array con la tabella contenente i tempi di vita, gli offset e le ampiezze della fluorescenza.

Genererà anche una scheda tecnica con le curve adattate e i residui dell'adattamento. Sono mostrate immagini confocali rappresentative di elocelle che esprimono solo la sintassi in quattro mcitrino, la snitaxina in quattro mCitrine con VAMP3 mCherry, o la sintassi in tre mCitrine mCherry costrutto tandem. In queste immagini di accompagnamento della durata della fluorescenza, il colore indica la durata media apparente della fluorescenza.

Le immagini sono state poi contorte con le intensità di fluorescenza del fluoroforo donatore mcitrino. Seguono le stesse immagini con fitting con funzioni di decadimento bi-esponenziale. I colori dei pixel indicano le frazioni stimate della sintassiin quattro in complesso con VAMP3.

La funzione di risposta dello strumento della configurazione è stata misurata utilizzando la retrodiffusione sull'interfaccia dell'acqua in vetro. Gli istogrammi del tempo di vita dell'intera cellula sono mostrati per le cellule che esprimono solo la sintassi quattro mCitrine, che co-esprimono la sintassi quattro mCitrine con VAMP3 mCherry e che esprimono il costrutto tandem mCitrine mCherry della sintassi tre. Il pannello E mostra una sovrapposizione delle curve di decadimento dei pannelli B, C e D.Gli intarsi mostrano gli stessi grafici, ma con scala logaritmica dell'asse Y.

Un istogramma fluorescente registrato troppo vicino alla superficie del vetrino del microscopio ha prodotto un grande picco di riflessione, rappresentato dall'area ombreggiata gialla. Infine, viene mostrato un istogramma del tempo di vita con adattamento rappresentativo con la funzione di decadimento biesponenziale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di registrare più cellule mentre i livelli di espressione del donatore e dell'intercettore SNARES possono influenzare la vita. Seguendo questa procedura, le cellule possono essere attivate per rispondere a domande specifiche del tipo di cellula relative al re-rooting del traffico di membrana mediato da SNARE. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico di membrana per esplorare le vie intercellulari del traffico degli organelli in tutte le cellule eucariotiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e analizzare i dati FLIM. Non dimenticare che lavorare con organismi geneticamente modificati e laser ad alta potenza può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come guanti e protezioni per gli occhi, durante il tentativo di questa procedura.