Name: Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Impara a visualizzare la formazione di complessi proteici SNARE in cellule HeLa vive mediante microscopia FLIM. Questo metodo consente di osservare direttamente i siti cellulari dove avviene il trafficking intracellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio di Ipazia da Radboud University Medical Center, il Career Development Award da Human Frontier Science Program, il programma di gravitazione 2013 dall'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO; ICI-024.002.009), un VIDI concedere da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e una sovvenzione a partire dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (Grant contratto numero 336479).

1. preparazione dei campioni microscopio
<ol>
	<li>Espressione di Qa-SNARE sintaxina 4 fuso a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoroforo donatore) e il R-rullante VAMP3 fusa a mCherry (VAMP3-mCherry) Nota: Altri Rullanti con proteine fluorescenti fuse a loro eliche transmembrane del C-terminale possono essere utilizzati anche. Invece di mCitrine-mCherry, altre coppie donatore-accettore di fluorofori spettralmente separati possono anche essere usato (ad es., CFP-YFP).<ol>
		<li>Cellule HeLa di crescere e dividersi 900.000 cellule HeLa sopra tre 35 mm-diametro vetro fondo piatti per microscopia. Nota: In linea di principio, questo protocollo può essere adattato per altri tipi di cellule eucariotiche e piatti di microscopia.<ol>
			<li>Mantenere le colture delle cellule HeLa in T75 boccette con 10 mL di glucosio elevato Dulbecco di medium dell'Aquila per volta (DMEM), supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 1% antibiotico antimicotico (contenente amfotericina B, penicillina e streptomicina) a 37 ° C e 5% CO 2 in un'incubatrice di coltura cellulare.</li>
			<li>Ricostituire il mezzo due volte a settimana e dividere le celle 01:10, una volta a settimana o quando le cellule raggiungono 85-90% confluenza al nuovo T75 boccette (500.000 cellule/boccetta, in media).</li>
			<li>Rimuovere il DMEM e lavare i monostrati di HeLa due volte con 8 mL di sterile tampone fosfato salino (PBS) per 3 min.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di PBS con acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed).</li>
			<li>Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C e 5% di CO2 in incubatrice della coltura cellulare e successivamente leggermente agitare la beuta per separare le cellule HeLa dalla parte inferiore del pallone.</li>
			<li>Lavare le cellule con 10 mL di medium, trasferire la sospensione in una provetta da 15 mL e rimuovere un'aliquota di 10 µ l per il conteggio.</li>
			<li>Diluire l'aliquota 1:1 con 0,4% trypan blu macchia e contare le celle con un emocitometro di Bürker9. Nota: Contare due 4x4 piazze e più il numero di cellulare di 10.000 per il numero di cellule/mL.</li>
			<li>Dopo cella contando, prendere 900.000 cellule dal tubo da 15 mL, li divide sopra i piatti di fondo di 3 vetro (Vedi punto 1.1.1) e preparare per la transfezione.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfect le cellule di elettroporazione10 (Vedi Tabella materiali) con sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo, campione n. 1), sintaxina 4-mCitrine insieme VAMP3-mCherry (esempio n. 2) e sintaxina 3 fuso a sia mCitrine e mCherry ( Esempio n. 3). Nota: Altri metodi di transfezione delle cellule possono anche essere usato11. Il costrutto di tandem in campione #3 è un controllo positivo per stimare la durata più breve si presenterebbe (cioè, massima si presenterebbe FRET).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cultura che delle cellule durante la notte in alto glucosio DMEM fornito con 10% FCS e 1% antibiotico antimicotico a 37 ° C con 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare.</li>
	<li>DMEM di aspirare e lavare le cellule una volta con live cell imaging medio (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2, 20mm HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; Vedi Tabella materiali) per 2 min e successivamente posizionare le cellule nel fresco imaging medio.</li>
</ol>
2. registrazione dei dati FLIM
<ol>
	<li>Posto n. 2 di campione sotto un microscopio confocale FLIM di dominio del tempo con una sorgente di eccitazione pulsato per il fluoroforo donatore (cioè, mCitrine) e acquisizione dati risolta nel tempo. Mantenere le cellule a 37 ° C con un piatto riscaldato. Nota: Il microscopio confocale utilizzato nel presente protocollo è dotato di un obiettivo a immersione in acqua NA 63 X 1,20, un laser a luce bianco (80 MHz pulsare, &lt; durata impulso 100 ps), un tubo di fotomoltiplicatore (PMT) di fotoni e un Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) sistema (Vedi Tabella materiali per installazione specifico utilizzato). Altri microscopi FLIM possono anche essere usato (ad es., diodi di valanga del singolo-fotone (SPAD) invece di PMTs, singolo-lunghezza d'onda laser pulsati invece di un laser pulsato a luce bianca).</li>
	<li>Selezionare una cella con espressione visibile della mCitrine e mCherry-etichettato proteine SNARE e registrare un'immagine confocale di 256 × 256 pixel con eccitazione simultanea dei due fluorofori prima di ogni misurazione di FLIM. Un passo del pixel di circa 2 volte più piccola di quanto la diffrazione limitata risoluzione spaziale del microscopio (~ 200 nm) dovrebbe essere usato. Per mCitrine, eccitare a 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm; per mCherry, eccitare 610 nm e raccogliere emissione da 613-668 nm. Nota: Non non posizione l'imaging aereo troppo vicino alla parte inferiore del piatto (all'interno di ~ 2 µm di distanza), come questo si tradurrà in un picco di riflessione nell'istogramma di corso della vita di fluorescenza. Simultanea eccitazione del donatore e accettore fluorophores è preferito, come questo permette di superare il potenziale problema di movimento del campione. Tuttavia, eccitazione sequenziale può essere utilizzato come bene.</li>
	<li>Record registrata un'immagine FLIM facendo Eseguire FLIM con l'immagine FLIM registrata con le stesse dimensioni e la risoluzione spaziale dell'immagine confocale al punto 2.2. Registrare i fotoni immagine almeno 50.000 per analisi FLIM di cellule intere, o almeno 400 fotoni/pixel. Solo eccitare il fluoroforo donatore di mCitrine e non il fluoroforo accettore di mCherry e così eccitare 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.1-2.3 per più celle e per le altre campione n. 1 (solo donatore) e campione n. 3 (il costrutto di tandem mCitrine-mCherry).</li>
	<li>Registrare una funzione di risposta dello strumento (IRF). Sintonizzare il monocromatore del rivelatore di emissione alla lunghezza d'onda di eccitazione (ad esempio, registrare emissioni da 510-550 nm) e quindi registrare un'immagine FLIM con dispersione indietro da un vetrino coprioggetto vetro pulito facendo clic sul pulsante Esegui FLIM. Utilizzare la stessa lunghezza d'onda di eccitazione (516 nm) e laser di potenza come utilizzato per registrare i dati di cella a passi 2.1-2.4. Nota: Se picchi multipli sono visibili in IRF o se il monocromatori di emissione non possono essere ottimizzato, l'IRF può anche essere misurata con una soluzione di colorante fluorescente con durata ultraveloce, per esempio estiguendo fluorescenza di un colorante organico in una satura acquoso soluzione di ioduro di potassio. Inoltre, non è strettamente necessario per registrare un IRF, perché la pendenza di decadimento degli istogrammi fluorescenza può anche essere montata senza deconvoluzione dell'IRF. Tuttavia, un IRF consente di correggere per le caratteristiche di temporizzazione del rivelatore del fotone utilizzato e quindi rende gli accoppiamenti degli istogrammi durata più accurato.</li>
</ol>
3.Conversione delle registrazioni del fotone a FLIM immagini
<ol>
	<li>Scaricare e installare il software di conversione PT32ICS5. Nota: I dati di durata possono essere analizzati anche da altri software, tra cui software di diversi fornitori di microscopio.</li>
	<li>Configurare il software di PT32ICS.<ol>
		<li>Impostare la dimensione per dimensione 256 × 256 pixel tramite impostazioni | Dimensioni.</li>
		<li>Impostare il canale a 2 via impostazioni | Dimensioni. Nota: Il canale dell'emissione mCitrine dipende esclusivamente dalla configurazione del microscopio. Un canale sbagliato si tradurrà in un'immagine FLIM con nessun fotoni (cioè, nero immagine) e di conseguenza un vuoto 'LifetimeTable.txt'-file. Il canale corretto può essere identificato da trial-and-error.</li>
		<li>Impostare l'uscita di ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) per generare immagini FLIM (punto 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Premere convertire e caricare una o più tracce di fotone (file .pt3). Per selezionare più tracce di fotone, tenere premuto il tasto Ctrl . Nota: Il formato di .ptu 64 bit più recente può anche essere convertito.</li>
	<li>Assicurarsi che il software di PT32ICS genera i seguenti file nella stessa cartella dove vengono salvati i file pt3: uno stack di fotone per .pt3 traccia di fotone in formato di immagine cytometry standard (ICS), file di una bitmap per la traccia di .pt3 fotone (BMP), un file di testo per conversione (_Report.txt) contenente le informazioni sulle statistiche di fotone (cioè, il numero totale di fotoni in ogni traccia del fotone di .pt3, la risoluzione di tempo del rivelatore) e un secondo file di testo per conversione (_LifetimeTable.txt) contenente il totale istogrammi di corso della vita di fluorescenza in formato delimitato da tabulazioni per ogni traccia del fotone di .pt3. Nota: Il file con estensione ICS può essere utilizzato per singolo pixel montaggio al fine di generare immagini FLIM, per esempio con TRI2 software12,13 o la curva sottile montaggio libreria in FIJI ImageJ14,15. Questo file può anche essere utilizzato per fasore analisi16, per esempio con il plugin di tempo Gated fasore per FIJI da Spechron. Il file bitmap non contiene nessuna informazione di vita. Il secondo file di testo viene utilizzato per l'analisi FLIM di cellule intere nel passaggio 4.</li>
</ol>
4. raccordo di istogrammi di vita di fluorescenza per l'analisi di cellule intere FLIM
Nota: Questo passaggio (riconducibili raccordo dell'IRF) richiede software in grado di raccordo riconducibili. Le piste degli istogrammi fluorescenza senza deconvoluzione dell'IRF di montaggio può essere fatto con altri software, come pure.
<ol>
	<li>Aprire il programma di software analisi di dati in grado di montare con deconvoluzione (Tabella materiali) e importare il file di testo contenente l'istogramma per ogni traccia di fotone (_LifetimeTable.txt) via File | Importazione | Singola ASCII.</li>
	<li>Riorganizzare la tabella tale che l'IRF è nella seconda colonna della tabella (mediante copia e Incolla). Posizionare l'IRF nella seconda colonna B accanto ai valori di tempo nella prima colonna A.</li>
	<li>Determinare la qualità delle tracce registrate fotone selezionando tutte le colonne premendo Ctrl + A e selezionando trama | Multi-pannello | 9 pannello. Non analizzare le tracce di fotone con un picco di alta riflessione (Figura 4F).</li>
	<li>Selezionare tutte le colonne contenenti gli istogrammi di qualità controllata vita che saranno montati così come l'IRF nella colonna B usando Ctrl chiave e caricare il montaggio non lineare tramite analisi | Montaggio | Curva non lineare Fit | Aprire la finestra di dialogo.</li>
	<li>Caricare la funzione di forma deconvoluted (disponibile in 1 File supplementari) aggiungendo questa funzione al software di analisi (tramite categoria | Definito dall'utente | Funzione | Aggiungi). Selezionare il file di forma funzione 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Questa funzione si inserisce gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con una funzione mono-esponenziale decadimento riconducibili con IRF (cioè, la seconda colonna B della tabella) (equazione 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Equazione 1) con t il tempo, τ la fluorescenza apparente vita, all'ampiezza e il y0 l'offset. Nota: Un'altra opzione è per adattare gli istogrammi di vita con una funzione di forma bi-esponenziale (equazione 2): 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Equazione 2) Fissando la durata del componente lenta (τ1) per l'unica condizione di donatore (punto 1.1.2: esempio n. 1) e che del componente veloce (τ2) per il costrutto di tandem (esempio n. 3), questo permette la stima della frazione di Proteine SNARE in complesso (F) le ampiezze del lento (A1) e dei componenti veloce (A2; si veda discussione; L'equazione 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Equazione 3) Il file di funzione adatta per montaggio bi-esponenziale riconducibili 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' è disponibile in 2 File supplementari.</li>
	<li>Selezionare montato curve | X tipo di dati come stesso come dati di Input. Nota: Questo si tradurrà in appropriato x-scala degli assi delle curve componibile.</li>
	<li>Montare le curve premendo Fit. Nota: Questo convertirà la vestibilità e generare un 'foglio di relazione' nella matrice con una tabella contenente i corsi della vita di fluorescenza, offset e ampiezze. Genererà inoltre un foglio di dati con le curve di misura e i residui del fit.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo del FLIM in apprensione per la visualizzazione delle interazioni SNARE sintaxina 4 e VAMP3 in cellule HeLa vive. Sintaxina 4 è una proteina di Qa-rullante localizzare prevalentemente sulla membrana plasmatica dove media esocitosi1,2,20,21. VAMP3 è un R-rullante che principalmente è descritto per individuare a riciclare endosomal scomparti e media il traffico ad altri gli endosomi pure per quanto riguarda la membrana plasmatica1,2,20. Tuttavia, il dosaggio di FRET-FLIM può essere facilmente adattato per lo studio di altre proteine SNARE. L'unica condizione è che queste trappole contengono un'elica transmembrana del C-terminale, che è il caso per la maggior parte delle proteine SNARE da lontano1,2. Inoltre, il protocollo descritto qui può essere adattato per la visualizzazione dei complessi SNARE in qualsiasi tipo di cellula eucariotica, comprese piante e lievito. In questo protocollo, abbiamo usato l'accorciamento della vita di fluorescenza del fluoroforo donatore come una misura di FRET. Come un approccio complementare, della durata del fluoroforo accettore potrebbe essere esaminata, che fornisce la prova inequivocabile che trasferimento di energia di risonanza si verifica perché l'emissione sensibilizzato provoca una fase di netto aumento.
Attualmente, la tecnica FLIM FRET può non essere in grado di visualizzare complessi SNARE in compartimenti lisosomiale. Per il costrutto di 3-mCitrine-mCherry tandem sintaxina, la fluorescenza di mCherry si trovano spesso più accumulata in una zona di juxtanuclear, che probabilmente corrisponde ai compartimenti lisosomiale, considerando che il segnale di mCitrine è più abbondante nei cellulari periferia5. È stato osservato un accumulo di juxtanuclear simili di mCherry rispetto a mCitrine, quando le stesse proteine SNARE fuse a queste proteine fluorescenti erano co-espressi5. I lisosomi sono caratterizzati da un pH estremamente basso (&#60; 4) e un'elevata attività degli enzimi proteolitici. L'accumulo di juxtanuclear di mCherry è probabilmente causato da una maggiore resistenza del fluoroforo mCherry a degradazione lisosomiale rispetto al fluoroforo mCitrine. Non è a causa di pH-tempra di mCitrine, come juxtanuclear accumulo di mCherry si verifica anche al momento della fissazione delle cellule5. Così, la tecnica FRET-FLIM sottovaluta la quantità di apprensione nelle regioni juxtanuclear (lisosomiali) e questo richiederebbe altre proteine reporter fluorescenti che sopravvivono ai termini duri all'interno dei lumen dei lisosomi.
FRET-FLIM in linea di principio permette di ottenere una stima quantitativa (semi-) della frazione di insidie nel complesso5. Come abbiamo spiegato in questo protocollo, ciò richiede il montaggio degli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con funzioni di decadimento doppio-esponenziale (equazione 2), dove l'ampiezza della componente veloce è proporzionale alla frazione di insidie nel complesso ( L'equazione 3). Tuttavia, tale accessorio con un modello bi-componente è tecnicamente impegnativo. Raccordo con più parametri di forma gratuiti (due corsi della vita di fluorescenza e due ampiezze) richiede un numero molto grande di fotoni, soprattutto perché i parametri influenzano a vicenda e piccoli errori nel corso della vita influenzerà le ampiezze e vice versa. Per superare questi problemi di montaggio, le durate di fluorescenza del componente lenta possono essere fissate per la durata della condizione unico donatore (cioè, non FRET; solo mCitrine presenti) e quella del componente veloce alla durata del tandem costruire ( massima si presenterebbe FRET). Tuttavia, questo dovrebbe anche essere interpretato con cautela, perché le durate di fluorescenza non possono essere lo stesso come in questi stati di controllo e potrebbero deviare a causa di diverse ragioni (self-tempra, orientamento del dipolo, variazioni nel microambiente). Più complessi SNARE nelle immediate vicinanze (&#60; 10 nm) può risultato in distanza-dipendente FRET, lo stesso principio che permette FRET essere utilizzato come un "righello molecolare", ma in questo caso, oscura la quantificazione di complessi SNARE. Inoltre, una stima quantitativa non è sempre significativa, perché le insidie con etichettate competono con endogeno SNAREs (senza etichetta). Di conseguenza, il livello di espressione di mCherry-labeled rullante è un determinante principale per la percentuale FRET5. A causa di tutti questi avvertimenti, si consiglia di montare gli istogrammi di vita fluorescente con una funzione di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Questo ha il vantaggio che non richiede alcuna conoscenza a priori dei tempi di vita e la vita fluorescente media apparente risultante fornisce una misura tinta per rullante complessanti5.
Tuttavia, si prevede che imaging FRET-FLIM quantitativo di modelli del due-componente raccordo avrà potenti applicazioni future. RULLANTE-codifica geni all'interno del cromosoma possono essere fuso con proteine reporter fluorescenti, ad esempio da CRISPR/CAS9. Questo provoca l'etichettatura fluorescente delle proteine SNARE endogene, con livelli di proteina endogena e senza sfondo delle insidie senza etichetta e quindi consente una stima quantitativa significativa della frazione di complessi SNARE di FRET-FLIM. Mentre i livelli di espressione delle insidie endogeni potrebbero essere piuttosto basso e dare relativamente basse segnali fluorescenti, si prevede che un numero sufficiente di fotoni possa essere ottenuto, soprattutto per l'intera cellula FLIM (che richiede solo pochi 1, 000s di fotoni). Inoltre, queste misurazioni FRET-FLIM possono essere eseguite con rivelatori di fotodiodo valanga più sensibili che comporterà anche i segnali di fluorescenza elevata e migliori statistiche di fotone.

Traffico di membrana è una caratteristica centrale delle cellule eucariotiche, dove vescicole di membrana bud fuori da un organello donatore e quindi spostarsi e fusibile con una destinazione organello1,2. Fatta eccezione per i mitocondri, tutti questi passaggi di fusione della membrana vengono catalizzati dai membri della proteina SNARE famiglia1,2. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 membri in cellule di mammiferi e circa 20 membri in lievito2. Proteine SNARE contengono uno o due ~ 52 residui-lungo, in modo nativo non strutturate aree denominate SNARE-motivi. Proteine SNARE sono spesso legati alle membrane di un C-terminale dell'elica del transmembrane1,2. Insidie possono essere classificati basato sui residui centrali che contribuiscono per il complesso SNARE in arginina (R) e glutammina (Q) insidie1,2. Fusione della membrana è guidato dall'interazione di 3 o 4 insidie cognate che insieme contribuiscono 4 SNARE-motivi e sono distribuiti sopra il donatore e accettore della membrana1,2. Un complesso SNARE è costituito da un motivo di R-rullante e tre motivi di Q-rullante (chiamati Qa, Qb e Qc). La formazione del complesso inizia alla N-termini di rullante-motivi, formando un cosiddetto trans-rullante-complessi e procede verso la C-termini, formando un fascio di arrotolato-arrotola α-elica stretto chiamato un cis-rullante-complesso. La formazione del complesso di persino un singolo complesso SNARE trascina le membrane donatore e accettore insieme e supera la barriera di energia per membrana fusion3.
Assegnazione di distinti complessi SNARE a vie di trasporto specifici all'interno delle cellule è spesso tecnicamente impegnativo. Sebbene insidie chiaramente contribuiscono alla specificità del traffico di membrane, sono promiscua, funzionalmente ridondanti e le loro funzioni si sovrappongono1,2. Per questo motivo, esperimenti di perturbazione targeting insidie, come per knockout del gene, l'interferenza del RNA, l'introduzione del blocco anticorpi o con frammenti di rullante solubili che agiscono come dominanti negativi, spesso non risultano in fenotipi chiari come gli altri Insidie compensano2,4. Inoltre, è difficile da differenziare passaggi fusione specifiche della membrana da eventi di traffici a Monte, perché insidie possono essere coinvolti in più percorsi di trasporto2. Studi di localizzazione delle insidie di approcci di microscopia, utilizzando immunolabeling o fusione genetica di proteine reporter fluorescenti, soffrono di problemi che: (i) insidie individuare al più organelli come mediano spesso più traffici passi e (ii) loro localizzazioni non significano automaticamente che funzionalmente sono impegnati nella formazione del complesso SNARE. Infine, complessi SNARE possono essere identificati mediante esperimenti di immunoprecipitazione utilizzando una delle insidie come esca e altre insidie come obiettivi, ma questo non consente l'assegnazione di questi complessi di organelli specifici o rotte del narcotraffico. Così, attualmente, non esiste nessuna tecnica alternativa per visualizzare complessi SNARE con risoluzione organellari. Immunofluorescenza non è in grado di dimostrare le interazioni di rullante, ma può mostrare solo la presenza o l'assenza di co-localizzazione, mentre immunoprecipitazione può mostrare solo rullante interazioni in tutta la popolazione di cella ma non assegnare gli organelli dove questi verificarsi di interazioni.
Per superare queste limitazioni, un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa dei complessi SNARE all'interno di cellule vive con risoluzione organellari recentemente è stato sviluppato da Verboogen et al. 5 questo metodo è basato sull'espressione di paia di lacci con proteine fluorescenti spettralmente spostate fuse C-terminale a loro eliche transmembrane. Dopo il completamento della fusione della membrana e la formazione di un cis-rullante complesso, questi fluorofori alla C-termini delle eliche transmembrane immediatamente vengono accostate a vicenda. I fluorofori sono quindi ben all'interno della distanza di Förster (in genere &#60; 5 nm), con conseguente FRET dal fluoroforo donatore verde-spostato al fluoroforo accettore rosso-spostato5,6. FRET risultati nell'estinzione del fluoroforo donatore e un'aumentata emissione del fluoroforo accettore che può essere misurato dai rapporti dell'emissione donatore e accettore (raziometrici FRET). Tuttavia, raziometrico FRET tra due diverse molecole è impegnativo, a causa di livelli di cross-talk e diversi di fluorescenza del donatore e accettore insidie a diversi organelli e tra cellule7,8. FRET può anche essere misurata dalla durata di fluorescenza, che è il tempo tra l'eccitazione e l'emissione di un fotone. Se il fluoroforo donatore può liberare la sua energia di FRET, questo risultato di processo concorrenti in un apparente accorciamento del ciclo di vita di fluorescenza. Ciò può essere misurata da FLIM7,8. Durata FRET è molto più robusto di raziometrici FRET per misurare le interazioni tra due molecole diverse, come la durata di fluorescenza è una proprietà intrinseca di un fluoroforo ed è insensibile alla sua concentrazione. Inoltre, FRET è da approssimazione quantitativa, perché l'efficienza della FRET è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra il donatore e accettore fluorofori (essenzialmente una funzione di passaggio). Quindi, montando gli istogrammi di vita di fluorescenza registrati da FLIM con un modello di decadimento doppio componente, FRET-FLIM consente la stima quantitativa (semi-) della frazione di molecole di rullante impegnati, la formazione del complesso SNARE5.
Recentemente, è stato utilizzato questo metodo di FLIM FRET da Verboogen et al. per visualizzare la formazione del complesso SNARE in cellule dendritiche primarie del sistema immunitario5. È stato dimostrato che, incontrando uno stimolo patogeno, cellule dendritiche reindirizzare loro traffico di membrane accompagnato da un complessante aumentata della proteina di membrana della vescicola-collegata di R-rullante (VAMP) 3 con il Qa-SNARE sintaxina 4 specificamente alla membrana del plasma. Questa maggiore formazione del complesso SNARE è probabilmente necessaria per soddisfare la maggiore capacità secretiva per la secrezione di citochine infiammatorie quali l'interleuchina-65. Questo protocollo descrive le fasi sperimentali necessarie per l'acquisizione di FRET-FLIM dati per la visualizzazione e (semi-) misurazione quantitativa dei complessi SNARE.Viene spiegato come adattare gli istogrammi di vita di fluorescenza di cellule intere con mono - e bi-esponenziale funzioni di decadimento, conseguente la durata apparente fluorescenza come una stima quantitativa alle interazioni di rullante. In questo protocollo, la linea delle cellule HeLa ampiamente usato è utilizzata come esempio, ma il metodo può essere facilmente esteso per studiare complessi SNARE in altre cellule eucariotiche.

<table><tbody><tr><td>DNA plasmidico 'syntaxin 4-mcitrino'Addgene</td><td></td> <td>ID 92422</td><td>Possono essere utilizzati anche altri SNARE con proteine fluorescenti fuse alle loro eliche transmembrana C-terminali. Al posto di mCitrine-mCherry, possono essere utilizzate anche altre coppie donatore-accettore di fluorofori spettralmente separati (ad esempio, CFP-YFP).</td></tr><tr><td>DNA plasmidico 'VAMP3-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92423</td><td>Possono essere utilizzati anche altri SNARE con proteine fluorescenti fuse alle loro eliche transmembrana C-terminali. Al posto di mCitrine-mCherry, possono essere utilizzate anche altre coppie donatore-accettore di fluorofori spettralmente separati (ad esempio, CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plasmide DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92426</td><td>Controllo positivo per il massimo FRET raggiungibile.</td></tr><tr><td>Celle</td><td></td><td></td><td></td>Hela</tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm&nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>Altre camere di imaging di cellule vive funzioneranno come sostituto</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep funzionerà come sostituto</td></tr><tr><td>Imaging di cellule vive Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>Qualsiasi altra soluzione di imaging di cellule vive funzionerà, a condizione che la fluorescenza dal mezzo sia impedita</td></tr><tr><td>Microscopio confocale Leica SP8 con obiettivo a immersione in acqua 63x 1,20 NA</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Possono essere utilizzati anche altri microscopi confocali in grado di eseguire FLIM nel dominio del tempo</td></tr><tr><td>Laser pulsato a luce bianca</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Possono essere utilizzate</td></tr> <tr>anche altre sorgenti laser pulsate<td>Sistema di conteggio di singoli fotoni correlati nel tempo (TCSPC)</td><td>PicoQuant</td><td>PicoHarp 300</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> di conversione PT32ICS <td>Disponibile nella sezione "Software" di www.membranetrafficking.com programma software di analisi dei</td></tr><tr><td>dati in grado di deconvoluzione</td><td>Originlabs</td><td>OriginPro 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macro Fiji ImageJ personalizzata per la convoluzione dell'immagine FLIM con l'intensità</td><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td>Disponibile nella sezione 'Software' di www.membranetrafficking.com</td></tr><tr><td>B&uuml; Emocitometro rker</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>ATCC ATCC</td><td>&nbsp; CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun Melsungen&nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>provette da 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>Elettroporazione di celle NEON</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza lifetime imaging microscopia

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Solubile N- ethylmaleimide sensibile della proteina (NSF) allegato proteina recettore (rullante) proteine di fusione sono la chiave per il traffico di membrana, come essi catalizzano la fusione della membrana all'interno delle cellule eucariotiche. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 diversi membri. Rotte di trasporto intracellulare specifico vengono catalizzate da specifici gruppi di 3 o 4 proteine SNARE che quindi contribuiscono alla specificità e fedeltà del traffico di membrana. Tuttavia, studiando la funzione precisa di proteine SNARE è tecnicamente impegnativo, perché le insidie sono molto abbondanti e funzionalmente ridondanti, con la maggior parte delle insidie avendo multipli e funzioni di sovrapposizione. In questo protocollo, è descritto un nuovo metodo per la visualizzazione della formazione del complesso SNARE in cellule vive. Questo metodo si basa su che esprimono le proteine SNARE C-terminale fuse a proteine fluorescenti e loro interazione di misura di energia di risonanza di Förster transfer (FRET) durata di fluorescenza impiegando imaging microscopia (FLIM). Montando gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con un modello di decadimento multicomponente, FRET-FLIM permette (semi-) stima quantitativa della frazione della formazione del complesso SNARE alle diverse vescicole. Questo protocollo è stato applicato con successo per prevedere la formazione del complesso SNARE alla membrana del plasma e alle endosomal scomparti in linee cellulari di mammifero e cellule del sistema immunitario primarie e può essere facilmente esteso per studiare funzioni rullante presso altri organelli in animale, pianta e cellule fungine.

La spiegazione razionale del dosaggio per interazioni di rullante di FRET-FLIM di misura è illustrato nella Figura 1. La C-termini delle eliche transmembrane delle proteine SNARE cognate sono fusi a una coppia di proteine fluorescenti spettralmente spostate (ad es., mCitrine e mCherry). La formazione di un cis-rullante complesso sopra i risultati di fusione della membrana in queste proteine fluorescenti diventando immediatamente giustapposti a vicenda e FRET. La figura 2 Mostra immagini confocal rappresentative delle cellule HeLa esprimendo fluorescente etichettato proteine SNARE. Mostrato una cella esprimono la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore) con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore), così come le condizioni di controllo delle cellule che esprimono solo la sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo; non FRET) e sintaxina 3 fuso a entrambi mCitrine e mCherry in tandem (maximal expectable FRET). La figura 3 Mostra l'accompagnamento fluorescenza durata e immagini FLIM generati inserendo gli istogrammi di corso della vita di ogni pixel con funzioni di decadimento mono-esponenziale (Figura 3A–B) e funzioni (decadimento bi-esponenziale Figura 3 - D). Figura 4A Mostra l'IRF della nostra impostazione misurato dallo scattering posteriore di un vetro di copertura del microscopio. In Figura 4B–E, istogrammi vita fluorescenza rappresentativo della cella intera analisi FLIM con accompagnamento fit curve per funzioni di decadimento mono-esponenziale sono illustrate. 4F figura viene illustrato un istogramma di vita fluorescente di un esperimento imaged troppo vicino alla superficie del vetro di copertura microscopio, risultante in un picco prominente riflessione. Figura 4 Mostra un istogramma di vita con il rappresentante in forma con una funzione di decadimento bi-esponenziale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Figura 1: schema della logica per la visualizzazione di complessi SNARE di FRET. (A) modello strutturale della proteina di membrana della vescicola-collegata di insidie (proteina database 3HD717) (VAMP) 2 neuronale (blu; R), sintaxina 1 (rosso; Qa-SNARE) e SNAP25 (verde; contiene sia un motivo di Qb - e Qc-rullante). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di sintaxina-1 è coniugato a mCitrine (fluoroforo donatore; proteina database 3DQ118). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di VAMP2 è coniugato a mCherry (fluoroforo accettore; proteina database 2H5Q19). (B) schema di rullante mediata fusione della membrana con conseguente FRET. Dopo la fusione della membrana dalla formazione di un cis-complesso SNARE, le insidie sono giustapposti immediatamente a vicenda conseguente FRET. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Figura 2: espressione di proteine SNARE fusa a proteine fluorescenti. Prima colonna: fluoroforo donatore, eccitato a 516 nm. Seconda colonna: fluoroforo accettore, eccitato a 610 nm. (A) donatore unica condizione. Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore; verde nell'Unione). Il canale di accettore (seconda colonna) Mostra il cross-talk di fluorescenza. (B) controllo negativo (nessun tasto). Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo entrambi sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore; magenta a merge). (C) controllo positivo (maximal expectable FRET). Immagine rappresentativa confocal di una cella di HeLa esprimendo il tandem 3-mCitrine-mCherry sintaxina costruire. Si noti che il segnale di fluorescenza del mCitrine e mCherry segnali non aderisce più sovrapposizione, probabilmente a causa di una minore resistenza di mCitrine a degradazione lisosomiale rispetto al mCherry (Vedi sezione discussione). BF: campo luminoso. Scala bar, 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Figura 3: immagini FLIM di formazione del complesso SNARE. (A) immagini di vita di fluorescenza rappresentativo delle cellule illustrate nella Figura 2. Le immagini sono state generate da prima convertire le tracce di fotone registrate da un sistema TCSPC (.pt3) per l'immagine cytometry standard (con estensione ICS) utilizzando il software PT32ICS. Singolo pixel montato vita di fluorescenza immagini poi sono stati generati utilizzando il software TRI212,13 con soglia da 15-100% di intensità, 7 circolare Pixelbinning e monoexponential algoritmo di adattamento (Marquardt). Il colore indica la durata media di fluorescente apparente. (B), FLIM immagini dove le immagini di vita di fluorescenza (mostrato nel pannello A) erano contorto con l'intensità di fluorescenza del fluoroforo donatore di mCitrine (illustrato nella Figura 2). La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). (C) durata di fluorescenza e FLIM immagini della cellula HeLa che esprimono sia sintaxina 4-mCitrine e VAMP3-mCherry da pannelli A-B, ma ora con raccordo con curve di decadimento bi-esponenziale (con vite fissate le condizioni di controllo; vedere passo in 4,4 Protocol). I colori dei pixel indicano le frazioni stimate F di sintaxina 4 in complesso con VAMP3 (equazione 3). (D) come pannello B, ma per il bi-esponenziale in forma. La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Figura 4: cellula intera analisi FLIM. (A) la funzione di risposta dello strumento (IRF) del programma di installazione. L'IRF è stata misurata utilizzando la dispersione indietro sull'interfaccia vetro-acqua (usando un piatto di microscopia di vetro pulito contenente acqua).(B–E) Complesso delle cellule gli istogrammi di vita per le cellule mostrate in Figura 2 e Figura 3. Sono stati riuniti tutti i fotoni presenti nelle immagini. Le curve erano riconducibili con IRF e dotate di funzioni di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Per queste cellule, i corsi della vita di fluorescenza sono stati ottenuti di 2,82 ns (le cellule che esprimono solo sintaxina 4-mCitrine; donatore solo; pannello B), 2,09 ns (cellule cheesprimono sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry; pannello C) e 2,08 ns (le cellule che esprimono la sintaxina 3 - mCitrine-mCherry tandem costruire; controllo FRET expectable massimale; pannello D). Gli intarsi Visualizza i grafici stessi, ma ora con scala logaritmica dell'asse y. Pannello E Mostra una sovrapposizione delle curve di decadimento dei pannelli B-D. (F) esempio di un istogramma di vita fluorescente registrato troppo vicino alla superficie del microscopio vetrini coprioggetto. Ciò provoca un picco di grande riflessione (raffigurato dall'area gialla ombreggiata). (G) stessa pannello C, ma ora opportuno con una curva di decadimento bi-esponenziale con vite fissa le condizioni di controllo (vedere punto 4.4 nel protocollo). Le ampiezze di digiuno (A1) e lento (A2) componenti erano 14,42 e 0,01, rispettivamente, risultante in una frazione di stimato di insidie nel complesso F di 0,99 (equazione 3). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1. Funzione file FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. Funzione file FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare la formazione complessa di proteine SNARE in cellule vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico di membrana, come l'identificazione degli insiemi di proteine SNARE che catalizzano le specifiche fasi del traffico degli organelli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione diretta delle posizioni cellulari in cui gli SNARE si impegnano in una formazione complessa.In questo esperimento, per la trasfezione vengono utilizzate 900.000 cellule HeLa divise tra tre provette Eppendorf. Trasfetta le celle come descritto nel protocollo di testo con i seguenti costrutti. Campione numero uno con il costrutto sintaxina-4 mcitrino, campione numero due con sintassimina-4 mCitrine e VAMP3-mCherry e campione numero tre con sintassimina-3 fusa sia con mCitrine che con mCherry.Colture di cellule trasfettate in DMEM ad alto contenuto di glucosio fornito con il 10% di FCS e l'1% di antibiotico antimicotico a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 in un incubatore per colture cellulari durante la notte. Il giorno seguente, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con il terreno di imaging di cellule vive per due minuti. Successivamente, posizionare le cellule in un nuovo terreno di imaging.Per iniziare questa procedura, posizionare il campione numero due a 37 gradi Celsius, su un tavolino riscaldato, sotto un microscopio confocale per imaging a fluorescenza nel dominio del tempo con una sorgente di eccitazione pulsata per il fluoroforo donatore e l'acquisizione dei dati risolta nel tempo. Prima di ogni microscopia di imaging a fluorescenza o misurazione FLIM, selezionare una cellula con espressione visibile delle proteine SNARE marcate con mCitrine e mCherry e registrare un'immagine confocale di 256 x 256 pixel con eccitazione simultanea di entrambi i fluorofori. Registrare un'immagine FLIM facendo clic su Esegui FLIM con l'immagine FLIM registrata con le stesse dimensioni e risoluzione spaziale dell'immagine confocale registrata in precedenza.Registrare l'immagine con almeno 50.000 fotoni per l'analisi FLIM a cella intera o almeno 400 fotoni per pixel. È importante registrare le misurazioni FLIM ad almeno un micrometro di distanza dalla superficie del vetro per evitare una vista riflessa. Ripetere l'imaging da più celle nel campione numero due e per le celle nel campione numero uno e nel campione numero tre.Quindi, posizionare un vetrino di vetro pulito sul tavolino del microscopio per registrare una funzione di risposta dello strumento o IRF. Sintonizzare il monocromatore del rivelatore di emissione sulla lunghezza d'onda di eccitazione e fare clic sul pulsante esegui FLIM per registrare un'immagine FLIM con la diffusione posteriore dal vetrino coprioggetti. Le registrazioni fotografiche verranno convertite in immagini FLIM con il software di conversione PT32ICS.Configurare il software. Impostare l'output su ImageJ per la generazione di immagini FLIM. Impostate le dimensioni dell'immagine su 256 x 256 pixel e il canale su due.Premi converti e carica una o più tracce di fotoni. Tenere premuto il tasto Ctrl per selezionare più tracce di fotoni. Le immagini FLIM devono essere generate nella stessa cartella in cui sono salvate le tracce dei fotoni.Inizia aprendo il programma software di analisi dei dati in grado di adattarsi con la deconvoluzione. Importa il file di testo contenente l'istogramma per ogni traccia di fotone. Riorganizzare la tabella in modo che l'IRF si trovi nella seconda colonna della tabella, accanto ai valori temporali nella colonna A.Determinare la qualità delle tracce di fotoni registrate selezionando tutte le colonne.Non analizzare tracce di fotoni con un picco di riflessione elevato. Di seguito è riportato un esempio. Utilizzare il tasto Ctrl per selezionare tutte le colonne contenenti gli istogrammi di durata controllata di qualità che verranno montati, nonché l'IRF nella colonna B, e caricare il raccordo non lineare.Caricare la funzione di adattamento deconvoluto aggiungendo questa funzione al software di analisi. Selezionare il file della funzione di adattamento. Questa funzione si adatta agli istogrammi del tempo di vita della fluorescenza con una funzione di decadimento monoesponenziale deconvoluta con l'IRF.Eseguire la scalatura dell'asse X delle curve adattate. Adatta le curve premendo Adatta. Questo convertirà l'adattamento e genererà un foglio di report nell'array con la tabella contenente i tempi di vita, gli offset e le ampiezze della fluorescenza.Genererà anche una scheda tecnica con le curve adattate e i residui dell'adattamento. Sono mostrate immagini confocali rappresentative di elocelle che esprimono solo la sintassi in quattro mcitrino, la snitaxina in quattro mCitrine con VAMP3 mCherry, o la sintassi in tre mCitrine mCherry costrutto tandem. In queste immagini di accompagnamento della durata della fluorescenza, il colore indica la durata media apparente della fluorescenza.Le immagini sono state poi contorte con le intensità di fluorescenza del fluoroforo donatore mcitrino. Seguono le stesse immagini con fitting con funzioni di decadimento bi-esponenziale. I colori dei pixel indicano le frazioni stimate della sintassiin quattro in complesso con VAMP3.La funzione di risposta dello strumento della configurazione è stata misurata utilizzando la retrodiffusione sull'interfaccia dell'acqua in vetro. Gli istogrammi del tempo di vita dell'intera cellula sono mostrati per le cellule che esprimono solo la sintassi quattro mCitrine, che co-esprimono la sintassi quattro mCitrine con VAMP3 mCherry e che esprimono il costrutto tandem mCitrine mCherry della sintassi tre. Il pannello E mostra una sovrapposizione delle curve di decadimento dei pannelli B, C e D.Gli intarsi mostrano gli stessi grafici, ma con scala logaritmica dell'asse Y.Un istogramma fluorescente registrato troppo vicino alla superficie del vetrino del microscopio ha prodotto un grande picco di riflessione, rappresentato dall'area ombreggiata gialla. Infine, viene mostrato un istogramma del tempo di vita con adattamento rappresentativo con la funzione di decadimento biesponenziale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di registrare più cellule mentre i livelli di espressione del donatore e dell'intercettore SNARES possono influenzare la vita. Seguendo questa procedura, le cellule possono essere attivate per rispondere a domande specifiche del tipo di cellula relative al re-rooting del traffico di membrana mediato da SNARE. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico di membrana per esplorare le vie intercellulari del traffico degli organelli in tutte le cellule eucariotiche.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e analizzare i dati FLIM. Non dimenticare che lavorare con organismi geneticamente modificati e laser ad alta potenza può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come guanti e protezioni per gli occhi, durante il tentativo di questa procedura.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra come le vescicole neuronali siano marcate con specifiche proteine fluorescenti per visualizzare il loro movimento. In primo luogo, un plasmide codificante per una proteina fluorescente viene incubato con un agente di trasfezione e quindi introdotto in una coltura di neuroni. Successivamente, le immagini dei neuroni vengono acquisite e analizzate per tracciare il movimento delle vescicole.

Visualizzazione delle motilità delle vescicole nei neuroni mediante imaging a fluorescenza

Fonte: Pigazzini, M. L., et. al. Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando l'imaging della durata di fluorescenza. J. Vis. Exp. (2020). Questo video dimostra l'uso della microscopia a fluorescenza (FLIM) per valutare l'aggregazione della proteina polyQ nei neuroni C. elegans, confrontando vermi di controllo e carenti di proteine chaperone. L'aumento dell'aggregazione nei vermi carenti di chaperone promuove il trasferimento di energia tra fluorofori...

Imaging a fluorescenza dell'aggregazione della proteina PolyQ nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

L'analisi iMSD (Imaging-derived mean square displacement) viene applicata ai macropinosomi per evidenziare la loro natura intrinseca in evoluzione temporale in termini di proprietà strutturali e dinamiche. I macropinosomi vengono quindi confrontati con i granuli secretori di insulina (ISG) come riferimento per strutture subcellulari con proprietà strutturali/dinamiche medie invarianti nel tempo.

Sondare le proprietà strutturali e dinamiche delle nanostrutture subcellulari di traffico mediante spettroscopia di fluttuazione spaziotemporale

L'articolo descrive l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione al microscopio a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi marcati endogeni con risoluzione di un singolo neurone in un nematode vivente.

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Impara a visualizzare la formazione di complessi proteici SNARE in cellule HeLa vive mediante microscopia FLIM. Questo metodo consente di osservare direttamente i siti cellulari dove avviene il trafficking intracellulare.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

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