La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione In Vivo Usando un test citometria a flusso basato su

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione fagocitaria della microglia retinica in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia, ad esempio se alcuni composti alterano la funzione fagocitaria della microglia in un contesto fisiologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza la citometria a flusso, consentendo un'analisi quantitativa rapida e precisa della fagocitosi microgliale.

Ad aiutarmi a dimostrare la procedura sarà Susumu Sakimoto, un postdoc del mio laboratorio. Inizia caricando un ago calibro 33 e una siringa con 0,5 microlitri di soluzione di particelle marcate in fluorescenza. Quindi posizionare un topo anestetizzato lateralmente su un materiale morbido sotto un microscopio operatorio e confermare il livello appropriato di sedazione in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.

Quindi, usa una pinza per applicare con cura una pressione attorno a una palpebra, in modo che il bulbo oculare fuoriesca leggermente dall'orbita. Quindi afferra la testa con due dita appena sopra l'orecchio e dalla mascella dell'animale e allunga delicatamente la pelle parallelamente alle palpebre per mantenere l'occhio leggermente sporgente fuori dall'orbita. Le iniezioni intravitreali sono impegnative e, se non eseguite correttamente, porteranno a risultati distorti e variabili.

Per ridurre il trauma oculare, tenere l'animale in una posizione stabile con un movimento minimo della testa. Per perforare il bulbo oculare, afferrare delicatamente il mouse con una mano. Quindi individua il limbus corneale dove la cornea e la sclera si collegano, che è visibile come un cerchio grigio nei topi pigmentati.

Tenendo la siringa nell'altra mano, inserire l'ago nel limbus. Quindi ritrarre leggermente l'ago per espellere un piccolo volume di liquido vitreo e premere lentamente lo stantuffo per iniettare le particelle. Quando tutte le perle sono state erogate, ritirare lentamente la siringa per evitare il reflusso del materiale iniettato e applicare gocce idratanti per mantenere l'occhio idratato una volta che l'occhio si è ritratto in posizione.

Quindi posizionare l'animale su un termoforo nella propria gabbia con monitoraggio fino a quando non si è completamente ripreso. Tre ore dopo l'iniezione intravitreale, utilizzare una pinza con angolo di 45 gradi per premere delicatamente contro la palpebra per proptosare il bulbo oculare. Posizionare la pinza dietro il bulbo oculare e tirare.

Quindi trasferire il bulbo oculare nell'area asciutta di una capsula di Petri, contenente un piccolo volume di PBS con calcio e magnesio al microscopio da dissezione. E usa una punta di una pinza superfine per perforare l'occhio nel limbus corneale. Successivamente, tenendo il bulbo oculare con una pinza angolata di 45 gradi, usa le forbici a molla per tagliare intorno al limbus corneale fino a tagliare circa la metà della circonferenza.

Trasferisci il bulbo oculare nella PBS e usa un secondo paio di pinze sottili con angolo di 45 gradi per strappare la cornea e la sclera. Il cristallino e la retina usciranno intatti. Assicurarsi che il cristallino e la retina siano separati e trasferire la retina in una provetta di polistirene da 5,4 millilitri, contenente due millilitri di PBS con calcio e magnesio.

Per ottenere una sospensione di una singola cellula delle cellule retiniche, utilizzare un kit di dissociazione del tessuto neuronale secondo le istruzioni del produttore e risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone di colorazione. Quindi trasferire il campione in un pozzetto di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione, capovolgere la piastra per scartare il surnatante e bloccare i recettori FC con 25 microlitri di tampone colorante contenente anticorpi CD16, CD32 per pozzetto per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi etichettare le cellule con gli anticorpi di interesse per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi pellettare le celle e seguire questo con un lavaggio in 200 microlitri di tampone di colorazione fresco per pozzetto. Ora risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone colorante e colorante vitalizzante e trasferire i campioni in provette per microtitolazione da 1,2 millilitri.

Quindi lavare i pozzetti con altri 100 microlitri di tampone di colorazione e colorante di vitalità e raggruppare i lavaggi con i campioni corrispondenti per l'analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere utilizzato in topi postnatali o adulti di età compresa tra 10 e 20 giorni e può essere adattato per testare l'effetto dei composti e/o la manipolazione genetica della fagocitosi microgliale. Ad esempio, in questo esperimento dopo provocazione intraperitoneale con dosi variabili di LPS, è stato determinato che una dose di LPS di 1,42 milligrammi per chilogrammo induce un aumento statisticamente significativo della percentuale di microglia fagocitica, rispetto ai controlli con provocazione del veicolo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come lo smistamento cellulare seguito da qPCR o analisi proteomica, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande sulle differenze tra microglia fagocitiche e non fagocitiche nella retina. Nello sviluppo di questa tecnica, ci aspettiamo di poter ora rendere possibile agli scienziati della vista e dei neuroscienziati di esplorare ulteriormente la funzione fagocitaria microgliale in situ e in un contesto fisiologicamente rilevante.