Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare automaticamente le cellule sensibili agli estrogeni nelle larve di zebrafish vive. Ciò si ottiene allevando prima cinque pesci adulti X-E-R-E-G-F-P per generare embrioni di pesce zebra reporter di estrogeni. Successivamente, gli embrioni vengono posti in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti.

Quindi gli estrogeni vengono aggiunti alla piastra degli embrioni. Infine, la lastra viene scansionata per la fluorescenza utilizzando un microscopio epifluorescente con tavolino motorizzato. In definitiva, la microscopia fluorescente viene utilizzata per mostrare l'attività tissutale specifica dei recettori degli estrogeni.

Quindi il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ad altre tecniche tradizionali come lo screening ad alto rendimento o ad alto contenuto, è che la fluorescenza tessuto-specifica nelle larve di zebrafish può essere visualizzata utilizzando solo un microscopio epifluorescente standard. Dotato di un tavolino motorizzato, non è necessario alcun lettore di lastre specializzato. Attenzione: le sostanze chimiche con BPA ed estradiolo sono pericolose e possono avere effetti deleteri sul feto umano.

Maneggiare con cura gli interferenti endocrini e utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati. In questa dimostrazione, il pesce zebra sarà esposto agli estrogeni 17 beta estradiolo, bisfenolo A e genina in varie dosi, a partire da 48 ore dopo la fecondazione dopo l'allevamento del pesce zebra e la raccolta e l'equiparazione delle uova. Secondo il testo il giorno del trattamento, diluire le soluzioni chimiche di riserva, da uno a 1000 in un millilitro di E tre B più vortice PTU vigorosamente.

Come controllo del veicolo. Utilizzare una diluizione da 1 a 1000 di DMSO in E tre, B e PTU utilizzando un trasferimento in plastica di grande diametro. Pipettare: trasferire tre embrioni per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti, preparando tre pozzetti per condizione.

Evitare di posizionare gli embrioni nei pozzetti esterni per evitare l'evaporazione del terreno durante il trattamento prolungato. Lavorando rapidamente per evitare di seccare gli embrioni, rimuovere il terreno da ogni pozzetto e aggiungere 200 microlitri di soluzione di trattamento ben miscelata. Confermare visivamente che tutti gli embrioni siano immersi nella soluzione e non siano attaccati al lato del pozzetto.

Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius a 72 ore. Dopo la fecondazione, anestetizzare gli embrioni aggiungendo 10 microlitri da quattro milligrammi per millilitro di trica. Per ciascuno, posizionare bene la piastra a 96 pozzetti su un palco motorizzato e utilizzando il software Zeiss Zen Blue 2011.

Calibrare lo stadio selezionando l'opzione di supporto del campione e scegliendo multi pozzetto 96. Quindi selezionare calibra prima di seguire le indicazioni passo passo, utilizzando un obiettivo 10x e l'impostazione del campo chiaro o BF, identificare un embrione di controllo positivo e impostare le impostazioni di esposizione in modo appropriato per i canali BF e GFP, assicurandosi che il segnale di fluorescenza non stia saturando la fotocamera. Concentrati su un singolo embrione e programma il microscopio per acquisire un totale di tre sezioni Z che includono un'immagine 50 micrometri sopra e una 50 micrometri sotto il piano focale corrente.

Successivamente, impostare i parametri del software per acquisire un'immagine piastrellata utilizzando i canali GFP e BF. Nella scheda di acquisizione, selezionare Configurazione avanzata, selezionare le aree di riquadro, quindi i riquadri. Scegli il cerchio.

Opzione pozzetto selezionare il vettore e il fattore di riempimento 90% per acquisire più immagini dei pozzetti selezionati, in modo tale che il 90% dell'area di ciascun pozzetto sia visibile nell'immagine composita. In opzioni, seleziona la quantità di sovrapposizione desiderata, ad esempio dal cinque al 10%, che consente una cucitura uniforme tra le immagini. Quindi avviare l'imaging per acquisire manualmente le immagini utilizzando un obiettivo 20x e l'impostazione BF, identificare un embrione di controllo positivo.

Impostare le impostazioni BF e GFP come prima e scattare immagini. Questa figura mostra le immagini composite dei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Ogni immagine è composta da 59 immagini singole con il 5% di sovrapposizione dell'immagine.

Si noti che i pesci zebra vivi sono orientati in modo casuale all'interno di ogni pozzo. Eppure siamo in grado di distinguere la fluorescenza nel cuore dalla fluorescenza nel fegato. Le immagini in campo chiaro sono utili come riferimenti per valutare l'orientamento del pesce zebra e visualizzare le anomalie morfologiche.

Le immagini mostrate qui sono state catturate con un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20 x per un'analisi più dettagliata e sono state scattate direttamente dopo la scansione automatizzata appena mostrata senza rimuovere la lastra dal tavolino del microscopio. Utilizzando un obiettivo 20x, la fluorescenza nel cuore può essere localizzata con precisione alle valvole ventricolari atriali indicate dalle frecce e alle valvole aortiche come indicato dalla punta della freccia. Una volta padroneggiata questa tecnica, è possibile acquisire immagini da 3.96 lastre murali al giorno.

Non dimenticare che lavorare con composti che alterano il sistema endocrino può essere pericoloso, quindi prendi sempre le dovute precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale adeguati durante l'esecuzione di questa procedura.