Name: Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Scopri l'imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish per rilevare cellule sensibili agli estrogeni. Questo metodo utilizza microscopia a fluorescenza per visualizzare l'attività dei recettori degli estrogeni in vivo.

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Ringraziamo Susan Farmer e il personale della struttura di ricerca zebrafish UAB per la cura zebrafish. Finanziamenti erogati dai fondi di start-up del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia.

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Animal Care ed uso comitato. 1. Allevamento Zebrafish e collezioni Egg <ol><li> Tre giorni prima di iniziare esposizioni chimiche, montare vasche di allevamento con divisori per maschi e femmine separati. Riempire ogni metà serbatoio con acqua sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete, trasferire Tg (5xERE: GFP) i pesci c262/c262 a vasche di allevamento, mettendo 2 maschi e 3 femmine in ciascun serbatoio separato da un divisorio. Mettere un coperchio su ogni serbatoio e l&#39;etichetta con la data e le tensioni da attraversare. </li><li> La mattina seguente, rimuovere tutte le barriere e inclinazione deflettori per creare una zona poco profonda ad una estremità della vasca di allevamento. Lasciare zebrafish per accoppiarsi, la raccolta di embrioni a intervalli di 10 min per assicurare precisione messa in scena dello sviluppo. Uova Clean di risciacquo attraverso un colino da tè con E3B medio e embrioni filo delicatamente in piastre di Petri. Ritorno pesci adulti di permanenteserbatoi. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, ordinare, contare, e rimuovere gli embrioni non fecondate, anomali o danneggiati. Luogo embrioni in piastre di Petri in E3B medio e casa a 28,5 ° C con 14:10 di luce: ciclo scuro. Densità embrione può influenzare lo sviluppo. Mettere non più di 100 embrioni in un piatto mm 100 x 35 e non più di 50 embrioni in un piatto mm 60 x 15. </li><li> Entro il 24 hpf, sostituire il supporto con E3B contenente 200 mM 1-fenil 2-tiourea (PTU). PTU previene la formazione di pigmenti e mantiene embrioni di zebrafish e larve trasparenti per una migliore chiarezza di immagine. ATTENZIONE: concentrato PTU magazzino è pericoloso; indossare i guanti quando si effettua soluzione E3B + PTU. </li><li> Al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), rimuovere manualmente il corion da ogni embrione utilizzando una pinza sottile. Il corion non sembra influenzare la penetrazione degli estrogeni, tuttavia rimozione migliora la nitidezza delle immagini. Non vi è alcuna necessità di rimuovere chorions dal supporto. NOTA: In alternativa alla dechorionation manuale, lotti di embrioni possono essere Chémically dechorionated usando 1 mg / ml pronasi trattamento, come descritto in precedenza 11. </li></ol> 2. Trattamento chimico di embrioni <ol><li> Il giorno prima del trattamento, preparare soluzioni madre di ogni prodotto chimico in concentrazione di 1.000 volte in DMSO (o solvente appropriato). Ad esempio, per esporre embrioni per 10 pM bisfenolo A (BPA), preparare una soluzione madre BPA 10 mM in 100% DMSO. Questo assicura concentrazione DMSO uniforme in ogni trattamento e permette una 1:1000 diluizione non tossico di DMSO per servire come un controllo del veicolo. Le soluzioni Negozio di archivi a -20 ° C. Per questo protocollo, embrioni saranno esposti a 1 mM e 10 mM BPA, 18,5 nM e 1,85 pM genisteina, 367 nM di estradiolo (controllo positivo) e il veicolo (0,1% DMSO, controllo negativo). ATTENZIONE: Sostanze chimiche come il BPA e estradiolo sono pericolosi e possono avere effetti deleteri sul feto umano. Maneggiare interferenti endocrini con cura e usare sempre un equipaggiamento di protezione personale.</li><li> Il giorno del trattamento, disgelo preparato archivi soluzioni chimiche. Diluire 1:1.000 pipettando 1 ml E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione madre chimica. Vortex vigorosamente. Diluire DMSO 1:1000 in E3B + PTU come un controllo del veicolo. Utilizzare 1 mL E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml come un controllo non trattato. </li><li> Usando una grande pipetta di plastica foro, trasferimento di embrioni da piastre di Petri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 3 embrioni per pozzetto, 3 pozzi per ogni condizione. Per evitare l&#39;evaporazione durante il trattamento prolungato, omettere embrioni da righe e colonne esterne della piastra (righe A ed E, colonne 1 e 12). Pozzi esterni possono essere riempiti con 300 ml di E3B + PTU. Etichettare il coperchio piatto in modo appropriato. </li><li> Rimuovere i supporti da ogni pozzetto con una multa a punta pipetta di trasferimento di plastica. Lavorare velocemente per evitare di seccare gli embrioni. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di trattamento in corrispondenti bene. Mettere il coperchio underneath la piastra come guida per garantire aggiunta di trattamenti nei pozzetti appropriati. Vortex ogni provetta prima di pipettare di distribuire il prodotto chimico in soluzione. Visivamente confermare ogni embrione è nella soluzione di trattamento. Se gli embrioni sono sul lato del pozzo, utilizzare una pipetta pulita per lavarli nel pozzetto con la soluzione di trattamento. </li><li> Porre la piastra in incubatore a 28,5 ° C. Gli embrioni saranno analizzate per fluorescenza a 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging di embrioni in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Anestetizzare embrioni aggiungendo 10 ml di 4 mg / ml tricaine a ciascun pozzetto. NOTA: Anestetizzare gli embrioni prima di imaging. A 24-96 hpf, zebrafish esporre movimento spontaneo e una risposta ad uno stimolo alla fonte di luce che cambia durante l&#39;acquisizione delle immagini. Anestetizzante embrioni riduce il movimento durante l&#39;imaging. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti in fase motorizzato e calibrare lo stadio. Utilizzando Zeiss Zen Blu software 2011 per la microscopia automaticamentesu e controllo, selezionare l&#39;opzione porta-campioni e selezionare multiwell 96. Selezionare Calibra. Seguire le istruzioni graduali per calibrare il palco. NOTA: Non deselezionare il pulsante di piastrelle dopo questo passaggio. Se il pulsante piastrelle è deselezionata, le impostazioni di calibrazione possono essere persi e la piastra a 96 pozzetti dovranno essere ricalibrato. </li><li> Utilizzando un obiettivo 10x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione appropriato per BF e canali GFP, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. Concentrarsi su un unico embrione e programmare il microscopio per acquisire 3 totali Z-sezioni, una immagine 50 pm sopra e una 50 micron sotto il piano focale corrente. NOTA: Poiché i vari tessuti occupano diversi piani focali, questo farà sì che per ogni immagine zebrafish vengono catturate con il cuore e il fegato a fuoco. </li><li> Impostare i parametri del software per acquisire un&#39;immagine in maiolica con GFP e BF channels. Nella scheda di acquisizione, selezionare la configurazione avanzata. Selezionare le regioni piastrelle, poi le piastrelle. Scegli l&#39;opzione cerchio bene. NOTA: Piastrelle viene utilizzato per creare un&#39;immagine composita di ogni bene. Un campo di vista singolo cattura solo una piccola parte di ogni pozzetto. La funzione di segmentazione in grado di catturare automaticamente aerei adiacenti da ciascun pozzetto campi di vista, creando un&#39;immagine composita di tutto il bene. È quindi possibile catturare automaticamente 96 immagini composite per piastra, dove ogni immagine composita contiene diverse decine di immagini singole di un singolo pozzetto. </li><li> Selezionare vettore e fattore di riempimento del 90%. Selezione di un fattore di riempimento del 90% di catturare immagini multiple dei pozzetti scelti in modo che il 90% della superficie di ciascun pozzetto sarà visibile nell&#39;immagine composita. NOTA: Quando si seleziona fattore di riempimento, un diagramma verrà visualizzato rappresentante l&#39;area da acquisire. Selezionare una percentuale che includerà la zona del pozzoche è appropriato per l&#39;esperimento. </li><li> In Opzioni, selezionare la quantità di sovrapposizione desiderato. NOTA: Quando cucire insieme le piastrelle per una singola immagine rappresentativa, una sovrapposizione di 5-10% consente una cucitura uniforme tra le immagini. Tuttavia, se l&#39;immagine cuciture è inutile, con una sovrapposizione 0% ridurrà il tempo di imaging. Uso 90% fattore di riempimento e 5% di sovrapposizione, un&#39;immagine composita di un singolo pozzetto consiste di 59 immagini singole. </li><li> Inizia imaging. Il microscopio acquisirà automaticamente le immagini. </li><li> Ispezionare manualmente immagini composite di ogni pozzetto per fluorescenza tessuto-specifico (Figura 1). </li><li> NOTA: E &#39;meglio iniziare con il controllo positivo per confermare che l&#39;esposizione chimica ha lavorato prima di osservare i pozzi trattamento sperimentale. </li></ol> 4. Manuale Acquisizione Immagine di embrioni in piastra a 96 pozzetti NOTA: Per confermare i risultati, utilizzare un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro a corrente alternataquaderno immagini più dettagliate manualmente (Figura 2). <ol><li> Utilizzando un obiettivo 20x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione per i canali BF e GFP in modo appropriato, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. </li><li> Identificare le singole embrioni e catturare immagini manualmente. NOTA: Una volta che le impostazioni di esposizione sono state selezionate per l&#39;embrione controllo positivo, non modificare le impostazioni. Questo consente un confronto dell&#39;intensità di fluorescenza come ogni immagine viene catturata in condizioni uniformi. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo semplice per automaticamente immagine di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un Zeiss Axio Observer. Z1 con Zen software Blu 2011, ma la tecnica può essere adattata utilizzando qualsiasi microscopio invertito con un palco motorizzato e software di controllo del microscopio in grado di eseguire piastrelle per creare immagini composite. Dotare un microscopio invertito con una fase motorizzato può fornire una pratica alte...

Zebrafish transgenici sono stati sviluppati che consentono la visualizzazione diretta di attività in vie di segnalazione, quali fattori di crescita dei fibroblasti 1, acido retinoico 2 e 3 estrogeni, in embrioni vivi. Tali strumenti consentono di screening per sostanze chimiche che perturbano vie di segnalazione (dosati come cambiamento di intensità di fluorescenza) o per le sostanze chimiche che modulano segnalazione in modo tessuto-specifico (cambiamento di localizzazione fluorescenza) 4. La cattura delle immagini automatica aumenta il throughput di schermi chimici drammaticamente 5,6. Schermi che la fluorescenza saggio automaticamente in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate. Cosiddetto screening ad alto contenuto offre il vantaggio di alta risoluzione, imaging quantitativo ma a costo di usare lettori di piastre specializzati attrezzati per microscopia confocale 7,8. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di dosaggio fluorescenza automaticamente tessuto-specifica in embrioni di zebrafishin una piastra a 96 pozzetti utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Fluorescenza tessuto-specifica può essere distinto con questa tecnica e può essere un approccio ragionevole per i laboratori che non hanno accesso ai lettori di piastre specializzati o apparecchiature ad alto contenuto di screening. In questo protocollo, utilizziamo l&#39;imaging automatizzato per rilevare il recettore degli estrogeni tessuto-specifica (ER) agonisti in zebrafish vivo in tre giorni dopo la fecondazione (dpf). La linea transgenica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 tandem risposta estrogenica elemento sequenze di DNA (ERE) a monte della proteina fluorescente verde (GFP) 3. In assenza di ligando, ER sono normalmente inattive. Legame del ligando innesca un cambiamento conformazionale, che permette recettori legano il DNA ERE e regolano la trascrizione 9. 5xERE: pesce GFP possono essere usati per lo screening librerie chimiche per modulatori ER e possono essere usati per lo screening campioni di acqua ambientale per contaminanti estrogenici.

<table><tbody><tr><td>Pipette di trasferimento in plastica; foro largo</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento in plastica; punta fine</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti, rotonda, piastre a fondo piatto</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>piastre 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>piastre 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>dimensioni della punta 0,05 x 0,01 mm, per la rimozione manuale dei corioni dagli embrioni</td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>vedi Zebrafish Book per la ricetta (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Preparare 20 mM stock (100x) e utilizzare a 200 &mu; M in E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Il protocollo richiede un microscopio a fluorescenza invertita con tavolino motorizzato</td></tr><tr><td>Obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Utilizziamo un obiettivo con 0,4 NA e 8,4 mm di distanza di lavoro</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale Axiocam HRm</td> Software di controllo del microscopio <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Il protocollo richiede l'automazione della microscopia e il software di controllo per consentire l'acquisizione di immagini piastrellate utilizzando un tavolino motorizzato</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma</td><td>Aldrich MB-1; 25 grammi</td><td>producono una soluzione al 2% in acqua RO per l'uso in E3B (sotto)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUZIONE: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17,2 grammi KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,76 grammi CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2,9 grammi MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 grammi o MgSO4 - 2,39 grammi Sciogliere in 1 litro di acqua Milli-Q; conservare in flacone sterile da 1 litro. 1X E3B SOLUZIONE PER ZEBRAFISH: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% blu di metilene&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; Portare a 9 litri con acqua Milli-Q &nbsp;</td></tr></tbody></table>

imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Embrioni di zebrafish sono un potente strumento per lo screening su larga scala di piccole molecole. Zebrafish transgenico che esprimono proteine ​​reporter fluorescenti sono spesso utilizzati per identificare le sostanze chimiche che modulano l&#39;espressione genica. Schermi chimici che saggio fluorescenza in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Descriviamo una procedura utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un palco motorizzato per l&#39;immagine automaticamente embrioni di zebrafish e rilevare la fluorescenza tessuto-specifica. Utilizzando zebrafish transgenico che segnala l&#39;attività del recettore degli estrogeni attraverso l&#39;espressione di GFP, abbiamo sviluppato una procedura semi-automatica per schermare per ligandi del recettore degli estrogeni che attivano il giornalista in maniera tessuto-specifica. In questo video si descrivono le procedure per arraying embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in una piastra a 96 pozzetti e l&#39;aggiunta di piccole molecole che legano i recettori degli estrogeni. A 72-96 hpf, immagini di ogni bene dal&#39;intera piastra vengono raccolte automaticamente e controllato manualmente per fluorescenza tessuto-specifica. Questo protocollo dimostra la capacità di rilevare estrogeni che attivano i recettori in valvole cardiache ma non nel fegato.

La Figura 1 mostra immagini composite di singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ogni immagine composita è composto di 59 immagini singole con 5% immagine sovrapposizione. Si noti che il zebrafish vivo sono orientati in modo casuale all&#39;interno di ogni bene, ma siamo in grado di distinguere la fluorescenza nel cuore dal fegato. Immagini Brightfield sono utili come riferimenti per valutare l&#39;orientamento zebrafish e visualizzare anomalie morfologiche (Figure 1A e 1C). Imag...

Qui descritto è un protocollo per l&#39;imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare automaticamente le cellule sensibili agli estrogeni in larve di zebrafish vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto incrociando cinque esemplari adulti di X-E-R-E-G-F-P per generare embrioni di zebrafish reporter per gli estrogeni. Successivamente, gli embrioni vengono posizionati in singole pozzette di una piastra a 96 pozzette.Successivamente, gli estrogeni vengono aggiunti alla piastra contenente gli embrioni. Infine, la piastra viene scansionata per rilevare la fluorescenza mediante un microscopio a fluorescenza episcopica dotato di un palchetto motorizzato. In ultima analisi, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare l'attività tissuto-specifica dei recettori per gli estrogeni.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre tecniche tradizionali, come lo screening ad alto rendimento o ad alto contenuto, consiste nel fatto che la fluorescenza specifica per il tessuto nei larve di pesce zebra può essere immaginata utilizzando semplicemente un microscopio epi-fluorescente standard, dotato di un palco motorizzato, senza necessità di un lettore di piastre specializzato. Le sostanze chimiche di cautela come il BPA e l'estradiolo sono pericolose e possono avere effetti dannosi sul feto umano.Maneggiare gli interferenti endocrini con cautela e utilizzare sempre idonei dispositivi di protezione individuale. In questa dimostrazione, i pesci zebra verranno esposti agli estrogeni 17 beta-estradiolo, bisfenolo A e genisteina a diverse dosi, a partire dalle 48 ore successive alla fecondazione, dopo l'accoppiamento dei pesci zebra e la raccolta e selezione delle uova. Nel giorno del trattamento, secondo quanto indicato, diluire le soluzioni chimiche congelate in rapporto di uno a 1000 in un millilitro di E3B più PTU, quindi vortexare energicamente.Come controllo con veicolo. Utilizzare una diluizione 1:1000 di DMSO in E3B e PTU mediante un trasferimento plastico con pipetta a grande diametro. Trasferire con pipetta tre embrioni per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, preparando tre pozzetti per ogni condizione.Evitare di posizionare gli embrioni nelle pozzette esterne per prevenire l'evaporazione del mezzo durante trattamenti prolungati. Procedere rapidamente per evitare che gli embrioni si secchino: rimuovere il mezzo da ogni pozzetta e aggiungere 200 microlitri di soluzione di trattamento ben mescolata. Verificare visivamente che tutti gli embrioni siano immersi nella soluzione e non siano attaccati ai lati della pozzetta.Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per 72 ore. Dopo la fecondazione, anestetizzare gli embrioni aggiungendo 10 microlitri di trica a quattro milligrammi per millilitro. In ogni pozzetto, posizionare la piastra a 96 pozzetti su un palco motorizzato e utilizzare il software Zeiss Zen Blue 2011.Calibrare la piastra selezionando l'opzione portacampioni e scegliendo la piastra multi-well da 96. Quindi selezionare calibrazione e seguire le istruzioni passo dopo passo, utilizzando un obiettivo 10x e l'impostazione campo chiaro o BF, identificare un embrione con controllo positivo e impostare correttamente i parametri di esposizione per i canali BF e GFP, assicurandosi che il segnale di fluorescenza non saturi la fotocamera. Mettere a fuoco su un singolo embrione e programmare il microscopio per acquisire un totale di tre sezioni Z, comprensive di un'immagine a 50 micrometri sopra e una a 50 micrometri sotto il piano focale corrente.Successivamente, impostare i parametri del software per acquisire un'immagine a tasselli utilizzando i canali GFP e BF. Nella scheda di acquisizione, selezionare configurazione avanzata, selezionare regioni a tasselli, quindi tasselli. Scegliere il cerchio.Selezionare l'opzione pozzetta per scegliere il supporto e un fattore di riempimento del 90% per acquisire più immagini delle pozzette selezionate, in modo che il 90% della superficie di ciascuna pozzetta risulti visibile nell'immagine composita. Nelle opzioni, selezionare la percentuale di sovrapposizione desiderata, ad esempio dal 5 al 10%, che consente una transizione uniforme tra le immagini. Quindi avviare l'acquisizione per catturare manualmente le immagini utilizzando un obiettivo 20x e l'impostazione BF, identificando un embrione di controllo positivo.Impostare le impostazioni per BF e GFP come in precedenza ed acquisire le immagini. Questa figura mostra immagini composite provenienti da singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ogni immagine è composta da 59 immagini singole con un sovrapposizione del 5% tra le immagini.Si noti che i zebrafish vivi sono orientati in modo casuale all'interno di ogni pozzetta. Tuttavia, siamo in grado di distinguere la fluorescenza presente nel cuore da quella presente nel fegato. Le immagini in campo chiaro sono utili come riferimento per valutare l'orientamento dei zebrafish e visualizzare eventuali anomalie morfologiche.Le immagini mostrate qui sono state acquisite con un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x per un'analisi più dettagliata, e sono state ottenute immediatamente dopo la scansione automatica appena mostrata, senza rimuovere la piastra dal palchetto del microscopio. Utilizzando un obiettivo 20x, la fluorescenza nel cuore può essere localizzata con precisione alle valvole atrioventricolari indicate dalle frecce e alle valvole aortiche come indicato dalla testa della freccia. Una volta padroneggiata questa tecnica, è possibile acquisire immagini da 3 piastre a 96 pozzetti al giorno.Non dimenticare che lavorare con composti che interferiscono con il sistema endocrino può essere pericoloso, quindi prendi sempre le opportune precauzioni, come indossare l'equipaggiamento di protezione individuale adeguato durante l'esecuzione di questa procedura.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Fonte: Zhang, X., et al. Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'imaging a fluorescenza di embrioni di zebrafish iniettati con Staphylococcus aureus, consentendo la quantificazione della progressione dell'infezione e della distribuzione batterica per valutare l'impatto delle microsfere di biomateriali sulle interazioni ospite-patogeno in...

 Imaging a fluorescenza dell'infezione batterica associata a biomateriale in embrioni di zebrafish

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Questo protocollo utilizza l'imaging a foglio luminoso per studiare la funzione contrattile cardiaca nelle larve di zebrafish e ottenere informazioni sulla meccanica cardiaca attraverso il monitoraggio cellulare e l'analisi interattiva.

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Scopri l'imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish per rilevare cellule sensibili agli estrogeni. Questo metodo utilizza microscopia a fluorescenza per visualizzare l'attività dei recettori degli estrogeni in vivo.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

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