Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di montare un embrione di pesce zebra per la microscopia ottica a foglio ottico in vivo a lungo termine. Ciò si ottiene pulendo prima un tubo fluorurato, etilene propilene o FEP e rivestendolo con metilcellulosa. Successivamente, viene rivestito un embrione di pesce zebra di interesse.

Quindi l'embrione viene trasferito prima nell'agarosio fuso e poi nel tubo FEP rivestito. Infine, il fondo della tuba viene chiuso con un tappo aros e l'orientamento dell'embrione montato viene attentamente controllato. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo imperturbato degli embrioni di pesce zebra per diversi giorni con un'elevata risoluzione spaziale e temporale attraverso la microscopia a foglio di luce in vivo.

Ebbene, il vantaggio principale rispetto alle tecniche esistenti è che ora possiamo osservare embrioni di super pesci per diversi giorni e non solo per poche ore. Questo metodo può fornire preziose informazioni sull'embriogenesi a lungo termine del pesce zebra utilizzando la microscopia a foglio di luce. Può essere applicato anche ad altri piccoli organismi come i piccoli organismi marini.

Può essere utilizzato anche con altre tecniche di microscopia come la tomografia a proiezione ottica, la microscopia a campo largo o la microscopia confocale. Le persone che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà perché il protocollo prevede alcuni passaggi critici in termini di tempo e giudicare la posizione finale dell'embrione richiede una certa esperienza. Per preparare un tubo FEP Innanzitutto, pulirlo sciacquandolo ripetutamente con un idrossido di sodio molare. Quindi trasferire la provetta in una provetta da centrifuga da 50 millilitri riempita con idrossido di sodio molare da 0,5 molari e otto ultrasuoni per 10 minuti.

Trasferire il tubo di polimero in una piccola bacinella con acqua distillata deionizzata e sciacquarlo. Quindi seguire con un lavaggio con etanolo al 70% prima di trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga. Con ultras all'etanolo.

Sonicare il tubo per 10 minuti prima di trasferirlo in una piccola bacinella con acqua deionizzata distillata e sciacquarlo. Di nuovo. Tagliare il tubo FEB pulito in pezzi lunghi tre centimetri e raddrizzarli se necessario. Conservare le provette pulite in una provetta fresca da 50 millilitri riempita con acqua distillata deionizzata.

Preparare la soluzione madre di Trica. 3% di metilcellulosa e 1,5% e 0,1% di Aros secondo il protocollo di testo. Sciogliere l'1,5% di agarro e versarlo in una pirofila di Petri fino a formare uno strato dello spessore di circa due millimetri.

Raccogli gli embrioni di zebrafish allo stadio desiderato che hanno espresso positivamente il gene della fluorescenza di scelta e trasferiscili in un piatto fresco di E tre sotto uno stereoscopio. Usando due pinze affilate, rivestire accuratamente gli embrioni usando una pinza per tenere il corion e la seconda pinza per aprirlo e tirarlo via per eseguire il montaggio multistrato. Con le mani guantate, collegare una cannula a punta smussata a una siringa.

Inserire con cautela la cannula di circa tre millimetri in un'estremità di un pezzo pulito di tubo FEP. Quindi, immergere l'estremità libera del tubo FEP nella metilcellulosa al 3% e riempire il tubo con la soluzione. Quindi spingere lentamente la siringa per rilasciare la metilcellulosa utilizzando il terreno E tre, ripetere i passaggi di immersione ed espulsione.

Nel frattempo, in un blocco termico, scaldare un'aliquota di 0,1% aros a 70 gradi Celsius. Agitare brevemente il tubo di reazione prima di trasferirlo in un blocco termico impostato a 38 gradi Celsius. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare brevemente il tubo e aggiungere trica a una concentrazione finale di 133-200 milligrammi per litro e vortice.

Ancora una volta, utilizzando una pipetta per pasta di vetro. Trasferire un embrione rivestito nella provetta di reazione con l'aros preriscaldato trasferendo il minor numero possibile di E tre. Con il tubo FEP e la siringa collegata, prelevare delicatamente una piccola quantità di aros prima di prendere l'embrione e riempire completamente il tubo con aros.

L'embrione deve essere posizionato su entrambe le estremità del tubo con la testa rivolta verso l'apertura. Per evitare perdite dal contenuto, mantenere il tubo in posizione orizzontale per tappare il tubo. Usa una lama di rasoio per tagliarlo dalla cannula.

Quindi, tenendo il tubo perpendicolare, attaccare lentamente l'estremità attraverso l'intero strato di aros all'1,5% e ruotarlo leggermente. Per evitare l'essiccazione, conservare il campione montato in una provetta di reazione da 1,5 millilitri riempita con terreno E tre prima dell'imaging. Verificare che il pesce all'interno del tubo FEP sia posizionato dritto, quindi la sua testa si trovi direttamente sopra il tappo per l'imaging.

Aggiungere trica al mezzo all'interno della camera di imaging. Qui è mostrato un transgenico di un giorno dopo la fecondazione. Embrione di pesce zebra K-G-R-L-G-F-P ripreso nel corso di due giorni per osservare lo sviluppo del sistema vascolare.

Il pesce zebra non è limitato dal mezzo di montaggio e può svilupparsi normalmente. Ad esempio, la sua testa si solleva. La coda si estende e la germinazione vascolare appare senza ostacoli.

Questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se eseguita correttamente e tutto il materiale è prontamente disponibile. Ricordati di eseguire tutti i passaggi principali senza alcun ritardo. Mantieni pulite tutte le soluzioni poiché lo sporco può compromettere la qualità dell'immagine finale.