Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish
27 febbraio 2014
Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di montare un embrione di pesce zebra per microscopie a foglio luminoso in vivo a lungo termine. Questo viene ottenuto innanzitutto pulendo un tubo in polipropilene etilene fluorurato o FEP e rivestendolo con metilcellulosa. Successivamente, un embrione di pesce zebra di interesse viene rivestito.
Quindi l'embrione viene trasferito prima in agarosio fuso, e successivamente nel tubo FEP rivestito. Infine, il fondo del tubo viene chiuso con un tappo di aros e l'orientamento dell'embrione montato viene controllato con attenzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo non perturbato di embrioni di pesce zebra per diversi giorni, con elevata risoluzione spaziale e temporale, mediante microscopia a foglio luminoso in vivo.
Beh, il principale vantaggio rispetto alle tecniche esistenti è che ora possiamo osservare gli embrioni di pesce super per diversi giorni e non solo per poche ore. Questo metodo può fornire informazioni preziose sullo sviluppo embrionale a lungo termine del pesce zebra mediante microscopia a foglio luminoso. Può inoltre essere applicato ad altri organismi piccoli, come piccoli organismi marini.
È inoltre possibile utilizzarlo con altre tecniche di microscopia come la tomografia a proiezione ottica, la microscopia in campo chiaro o la microscopia confocale. Le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché il protocollo comprende alcuni passaggi critici nel tempo e la valutazione della posizione finale dell'embrione richiede una certa esperienza. Per preparare un tubo in FEP, innanzitutto pulirlo facendovi passare ripetutamente una soluzione di idrossido di sodio uno molare. Successivamente trasferire il tubo in un tubo da centrifuga da 50 millilitri riempito con idrossido di sodio 0,5 molare e sottoporlo a ultrasuoni per 10 minuti.
Trasferire il tubo polimerico in un piccolo contenitore con acqua deionizzata distillata e sciacquarlo. Successivamente, eseguire uno sciacquo con etanolo al 70% prima di trasferirlo in un nuovo tubo da centrifuga. Con etanolo ultras.
Sonicare il tubo per 10 minuti prima di trasferirlo in un piccolo contenitore con acqua distillata deionizzata e sciacquarlo nuovamente. Tagliare il tubo FEB pulito in pezzi lunghi tre centimetri e raddrizzarli se necessario. Conservare i tubi puliti in un nuovo tubo da 50 millilitri riempito con acqua distillata deionizzata.
Preparare la soluzione madre di Trica. 3% di metilcellulosa e sia 1,5% che 0,1% di Aros secondo il protocollo descritto nel testo. Sciogliere l'agarro allo 1,5% e versarlo in una piastra di Petri per formare uno strato di spessore pari a circa due millimetri.
Prelevare embrioni di pesce zebra allo stadio desiderato che esprimono positivamente il gene fluorescente scelto e trasferirli in una nuova piastra con E tre sotto uno stereomicroscopio. Utilizzando due pinzette appuntite, rivestire con attenzione gli embrioni usando una pinzetta per trattenere la coriona e la seconda pinzetta per aprirla strappandola via, al fine di eseguire il montaggio multistrato. Con le mani guantate, fissare un cannulo a estremità ottusa su una siringa.
Inserire con attenzione la cannula di circa tre millimetri in un'estremità di un pezzo di tubo FEP pulito. Successivamente, immergere l'estremità libera del tubo FEP in una soluzione di metilcellulosa al 3% e riempire il tubo con la soluzione. Poi spingere lentamente sulla siringa per rilasciare la metilcellulosa utilizzando il mezzo E tre, ripetere i passaggi di immersione ed espulsione.
Nel frattempo, in un blocco riscaldante, riscaldare un'aliquote di aros allo 0,1% a 70 gradi Celsius. Vortexare brevemente il tubo di reazione prima di trasferirlo in un blocco riscaldante impostato a 38 gradi Celsius. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare brevemente il tubo e aggiungere trica fino a una concentrazione finale di 133-200 milligrammi per litro e vortexare.
Di nuovo, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, trasferire un embrione rivestito nel tubo della reazione con l'aROS, trasferendo il minor quantitativo possibile di E3. Con il tubo FEP e la siringa collegata, aspirare delicatamente una piccola quantità di aROS prima di prelevare l'embrione e riempire completamente il tubo con aROS.
L'embrione deve essere posizionato a un'estremità del tubo con la testa rivolta verso l'apertura. Per evitare fuoriuscite del contenuto, mantenere il tubo in posizione orizzontale per tapparlo. Utilizzare una lametta per tagliarlo dalla cannula.
Quindi, tenendo il tubo perpendicolare, inserire lentamente l'estremità attraverso l'intero strato di agarosio al 1,5% e ruotarlo leggermente. Per evitare l'essiccazione, mantenere il campione montato in un tubo da reazione da 1,5 millilitri riempito con mezzo E three prima dell'acquisizione delle immagini. Verificare che il pesce all'interno del tubo FEP sia posizionato in posizione verticale e che la sua testa sia esattamente sopra il tappo per l'acquisizione delle immagini.
Aggiungere trica al mezzo all'interno della camera di imaging. Qui mostrato è un embrione di pesce zebra transgenico a un giorno dalla fecondazione K-G-R-L-G-F-P, immaginato nell'arco di due giorni per osservare lo sviluppo della vascolarizzazione.
Il pesce zebra non è vincolato dal mezzo di montaggio e può svilupparsi normalmente. Ad esempio, solleva la testa. La coda si estende e la formazione di nuovi vasi sanguigni avviene senza ostacoli.
Questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se effettuata correttamente e se tutti i materiali sono prontamente disponibili. Ricordarsi di eseguire tutti i passaggi principali senza alcun ritardo. Mantenere tutte le soluzioni pulite, poiché lo sporco può compromettere la qualità dell'immagine finale.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish per l'analisi microscopica a foglio luminoso in vivo a lungo termine. La tecnica permette di osservare lo sviluppo del zebrafish per diversi giorni con elevata risoluzione spaziale e temporale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Il pesce zebra è un organismo modello per lo studio dello sviluppo dei vertebrati.
- Le tecniche tradizionali di imaging sono limitate a brevi periodi di osservazione.
- La microscopia a foglio luminoso fornisce un metodo non invasivo per osservare embrioni vivi.
- Incapsulare gli embrioni in un mezzo adeguato è fondamentale per un imaging di successo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'immagine a lungo termine di embrioni di pesce zebra.
- Migliorare la comprensione dell'embriogenesi attraverso un'osservazione continua.
- Fornire informazioni applicabili ad altri organismi piccoli.
Metodi Utilizzati
- Pulizia e preparazione dei tubi FEP per il montaggio degli embrioni.
- Rivestimento degli embrioni con metilcellulosa e inclusione in agarosio.
- Utilizzo della microscopia a foglio luminoso per acquisire i processi di sviluppo.
- Posizionamento corretto degli embrioni per un'ottimale acquisizione delle immagini.
Risultati principali
- Imaging a lungo termine riuscito di embrioni di pesce zebra per diversi giorni.
- Osservazione di processi di sviluppo normali senza perturbazioni.
- Dimostrazione dello sviluppo vascolare in pesci zebra transgenici.
- Il metodo può essere adattato per essere utilizzato con altre tecniche di microscopia.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato consente un'osservazione senza precedenti dell'embriogenesi del pesce zebra.
- Fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia dello sviluppo.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri piccoli organismi acquatici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'immagineggiamento a lungo termine in vivo di embrioni di pesce zebra permette di ridurre i rischi meccanicistici delle vie di sviluppo e supporta la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Questa tecnica di montaggio multistrato fornisce un sistema rilevante per la malattia per osservare l'embriogenesi normale con minima perturbazione, aumentando la fiducia predittiva nei test fenotipici. Tale approccio colloca la microscopia a foglio luminoso come strumento scalabile e riproducibile per la valutazione dei modelli preclinici e l'allineamento dei biomarcatori traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'osservazione in tempo reale dello sviluppo vascolare e morfologico in zebrafish transgenici.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli permettendo un'embriogenesi inalterata per diversi giorni, riducendo i falsi positivi nell'analisi dei percorsi molecolari.
- Valore predittivo: Migliora l'identificazione dei composti promettenti fornendo letture quantitative e longitudinali dei processi di sviluppo durante l'esposizione a composti chimici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati in tubi FEP trasparenti otticamente per lo screening di composti successivi, con un posizionamento costante degli embrioni.
- Riproducibilità: Standardizza la preparazione dei campioni utilizzando agarosio a bassa concentrazione e rivestimento di metilcellulosa, riducendo al minimo la variabilità tra i replicati.
- Scalabilità: Consente configurazioni di imaging multiplex grazie a un protocollo di montaggio rapido della durata di 10 minuti e alla compatibilità con flussi di lavoro di microscopia automatizzata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Fornisce un modello basato sul pesce zebra per lo studio di vie di sviluppo conservate applicabili ai meccanismi delle malattie umane.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico permettendo l'osservazione dell'organogenesi normale e supportando la validazione di biomarcatori in vivo.
- Decisioni a rischio calibrato: Facilita criteri di avanzamento/cessazione rivelando tossicità dello sviluppo o alterazioni delle vie metaboliche mediante imaging longitudinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, sostenendo cicli iterativi di progettazione-sintesi-test-analisi nella ricerca delle fasi iniziali.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sulla funzione genica e sull'attività delle vie metaboliche mediante imaging temporale ad alta risoluzione e non invasivo di embrioni in via di sviluppo.
- Screening: Fornisce output fenotipici quantitativi e con risoluzione spaziale adatti a campagne di screening ad alto contenuto che richiedono endpoint di sviluppo.
- Analisi: Genera letture temporali e morfologiche che supportano il confronto statistico tra condizioni di controllo e trattate in diversi punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica mantenendo lo sviluppo fisiologico, consentendo l'estrapolazione dei risultati a modelli di vertebrati superiori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di montaggio riutilizzabile adattabile a diverse modalità di microscopia e sistemi modello, riducendo lo sforzo di rivalidazione tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso l'osservazione diretta dei fenotipi dello sviluppo.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità tra laboratori mediante passaggi definiti di preparazione, rivestimento e inclusione in provetta.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rilevamento precoce di potenziali criticità nello sviluppo, riducendo il rischio di abbandono in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei composti aggiustata per il rischio, basata su profili longitudinali dello sviluppo in un contesto di organismo intero.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei zebrafish, nello stadio degli embrioni e nella microscopia a fluorescenza per garantire un montaggio e un orientamento corretti.
- Presuppone l'accesso a sistemi di microscopia a foglio luminoso e a strumentazioni ausiliarie per la pulizia dei tubi, la sonificazione e la preparazione delle soluzioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle concentrazioni delle soluzioni (ad esempio, metilcellulosa, agarosio, Aros) e ai protocolli di preparazione dei tubi, al fine di mantenere la coerenza delle acquisizioni microscopiche.
- Richiede considerazioni adattative nel trasferire il metodo ad altri organismi di piccole dimensioni, inclusi aggiustamenti del diametro del tubo e della viscosità della matrice di inclusione.
- È limitato dai requisiti di trasparenza ottica del tubo di montaggio e dalla necessità di evitare contaminazioni da particolato che potrebbero compromettere la qualità dell'immagine durante acquisizioni prolungate.
