Name: Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara il montaggio multistrato di embrioni di zebrafish per microscopia a foglio di luce a lungo termine. Questo metodo consente l'osservazione in vivo dello sviluppo embrionale con alta risoluzione spaziale e temporale per diversi giorni.

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Ringraziamo il Max Planck Society, il Programma Human Frontier Science (HFSP) e la Boehringer Ingelheim Fonds per il finanziamento e il sostegno.

1. Preparazione del materiale <ol><li> Preparazione dei tubi FEP <ol><li> Pulire il tubo FEP (Figura 2A), tramite iniezione di liquidi (nelle fasi sotto riportate) attraverso il tubo e l&#39;utilizzo di una siringa collegata con una estremità cannula smussa (Figura 2B) Nota 1:.. Utilizzare guanti durante l&#39;intera procedura Nota 2: Si consiglia di tagliare il tubo in pezzi di ca. 1 m di lunghezza e pulizia quelle in parallelo. <ol><li> Prima sciacquare il tubo con 1 M NaOH ripetutamente. Quindi trasferire il tubo di un tubo da centrifuga da 50 ml riempito con 0,5 M NaOH e ultrasonicate per 10 min. </li><li> Trasferire il tubo di polimeri ad un piccolo bacino con DDH 2 O. Lavare il tubo prima con DDH 2 O e poi con il 70% EtOH. </li><li> Successivamente trasferire il tubo FEP una provetta da centrifuga fresca con il 70% EtOH. Ancora una volta ultrasonicate questo tubo centrifugare per 10 min. </li></ol></li><li> Tagliare il tubo FEP pulito in pezzidi circa 3 cm (una lunghezza tipica per l&#39;uso in zebrafish montaggio e di imaging) e raddrizzarli se necessario. Conservare le provette FEP puliti in una fresca 50 ml tubo da centrifuga riempito con DDH 2 O (Figura 2C). </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione madre Tricaine <ol><li> Preparare 0,4% soluzione Tricaine magazzino sciogliendo 400 mg Tricaine (MS-222) in 97,9 ml DDH 2 O. Dopo che la polvere è completamente sciolto, regolare il pH a 7,0 con 2,1 ml 1M Tris (pH 9,0). Proteggere la soluzione dalla luce. Conservare aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del 3% metilcellulosa <ol><li> Preparare la soluzione di metilcellulosa 3% per il rivestimento interno dei tubi FEP come descritto di seguito. Riscaldare E3 11 in una bottiglia di vetro a circa 60-70 ° C e aggiungere la quantità appropriata di metilcellulosa polvere. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare a 4 ° C. Appena la soluzione è raffreddata a temperatura inferiore a 30 ° C, aggiungere la soluzione Tricaine ad un c finaleoncentration di 100 mg / L. Continuate a mescolare a 4 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Preparazione del 1,5% e 0,1% agarosio in E3 <ol><li> Sciogliere la giusta quantità di agarosio a basso punto di fusione della polvere in un volume definito di E3 in un pallone di vetro. Riscaldare la miscela in un forno a microonde e agitarla di tanto in tanto, fino a quando la soluzione di agarosio appare omogenea, senza i cristalli rimanenti. </li><li> Preparare 1 ml aliquote di soluzione di agarosio 0,1% in 1,5 ml provette di reazione. Le aliquote possono essere conservati a 4 ° C. </li><li> Utilizzare la soluzione 1,5% per rivestire un piatto di plastica Petri. Lo spessore dello strato di agarosio dovrebbe essere ca. Mm 2. Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, aggiungere E3 medio sulla parte superiore dello strato per evitare che si secchi. Il piatto rivestito può essere conservato a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione di zebrafish <ol><li> Tenere Zebrafish (Danio rerio) adulti e gli embrioni a 28,5 ° C e gestirli secondo i protocolli stabiliti 11,12. </li><li> Impostare il pesce maschio e femmina nel pomeriggio e separarli con un divisore. Rimuovere il divisore la mattina seguente in volta l&#39;accoppiamento del pesce. </li><li> Raccogliere gli embrioni in un piatto pieno di E3 ed esaminare utilizzando uno stereomicroscopio. </li><li> Al 24 hpf (o lo stadio di sviluppo di tuo interesse), selezionare l&#39;embrione di zebrafish per l&#39;espressione di fluorescenza e trasferire quelli positivi per un nuovo piatto con E3 fresca. </li><li> Dechorionate attentamente gli embrioni utilizzando due pinze taglienti (figure 2D e 2E). Utilizzare le prime pinze per afferrare e tenere premuto il corion e la seconda pinza a strappare aprirlo e tirarlo fuori Nota 1:. Eseguire questo passaggio con l&#39;aiuto di uno stereomicroscopio. </li></ol></li></ol> 2. Multistrato di montaggio <ol><li> Rivestimento del tubo FEP <ol><li> Collegare una cannula punta smussata ad una siringa. Inserire la cannula con cura per circa 3 mm nella un&#39;estremità di un pulito e tagliato pezzo di. Tubo FEP (figure 2F e 2G) Nota 1: Indossare guanti ed evitare qualsiasi o spremitura piegatura del tubo. </li><li> Immergere l&#39;estremità libera del tubo FEP in 3% di metilcellulosa e riempire il tubo con la soluzione. </li><li> Rilasciare lentamente la metilcellulosa spingendo sulla siringa. Scartare la soluzione. </li><li> Ripetere i punti 2.1.2 e 2.1.3 utilizzando E3 Nota 1:. I tubi rivestiti devono essere utilizzati per il montaggio immediatamente. </li></ol></li><li> Trasferire il pesce zebra per l&#39;agarosio <ol><li> Riscaldare un&#39;aliquota di 0,1% agarosio a 70 ° C in un blocco di calore. Vortex brevemente il tubo di reazione e trasferirlo ad un blocco di calore impostato a 38 ° C (Figura 2H). </li><li> Prendete il tubo di reazione fuori dal blocco fuoco e lasciate raffreddare brevemente. Aggiungere Tricaine ad una concentrazione finale di 133-200 mg / L e vortice nuovamente (Figura 2I). </li><li> Selezionare uno degli embrioni dechorionated zebrafish e transfe. r al tubo di reazione con l&#39;preriscaldato 0,1% agarosio utilizzando una pipetta Pasteur di vetro (Figure 2J e 2K) Nota 1: Prova di trasferire il meno supplementare E3 possibile. </li></ol></li><li> Montaggio del zebrafish <ol><li> Raccogliere l&#39;embrione con il tubo FEP siringa allegata (Figura 2L). . Il tubo deve essere riempito completamente con 0.1% agarosio, con l&#39;embrione posizionato vicino a una delle estremità del tubo e con la testa rivolta verso l&#39;apertura del tubo Nota 1: Assicurati di prendere un po &#39;di agarosio prima di prendere il pesce. Nota 2: Tirate delicatamente sulla siringa per evitare le bolle Nota 3:. Tenere il tubo in posizione orizzontale per evitare la fuoriuscita del suo contenuto (Figure 2M e 2N). </li></ol></li><li> Collegare il tubo <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Multistrato di montaggio per embrioni di zebrafish. A) L&#39;etilene propilene fluorurato (FEP) i tubi su un tamburo cavo prima della preparazione. B) una siringa con una cannula punta smussata in allegato. C) A puliti e tagliati FEP tubo. D, E) Dechorionation del 24 hpf embrioni di zebrafish. F) Fissare il tubo alla cannula punta smussata. G) ​​La siringa con cannula e il tubo attaccato. H) Un&#39;aliquota dello 0,1% agarosio all&#39;interno di un tubo di reazione durante il trasferimento ad un blocco di calore. I) vortex del fuso agarosio. J) Uptake di un embrione dechorionated utilizzando una pipetta di vetro. K) Trasferimento dell&#39;embrione in agarosio fuso. L) aspirazione dell&#39;embrione con circostanti agarosio nel tubo FEP. M, N) L&#39;embrione zebrafish all&#39;interno del tubo FEP . <strong&gt; O) Taglio del tubo tra campione e cannula. P) Inserimento del tubo mediante l&#39;uso di un piatto di agarosio rivestita. Q) L&#39;embrione all&#39;interno del tubo inserito. R) La preparazione finale del campione in un supporto metallico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo largo della cannula (Fig. 2O). </li><li> Lentamente attaccare l&#39;estremità del tubo contenente il pesce attraverso l&#39;intero strato di 1,5% agarosio nel piatto di plastica per collegare il tubo (Figura 2P) Nota 1:. Evitare la formazione di bolle e cercare di ottenere una superficie spina diritta tenendo la . tubo esattamente perpendicolare alla superficie agarosio Nota 2: ruotare leggermente il tubo per ottenere una bella spina. </li><li> Mantenere il campione montati in un tubo di reazione da 1,5 ml con E3 per evitare l&#39;essiccamento. Il campione è now pronto per essere ripreso. Prima della rappresentazione, controllare se il pesce è seduto proprio sulla cima della spina (figure 2Q e 2R). Assicurarsi di aggiungere anche Tricaine al mezzo all&#39;interno della camera di imaging nella stessa concentrazione nel liquido di montaggio. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tecniche di microscopia avanzata come la microscopia foglio leggero ci consentono di registrare i dati di immagine con alta risoluzione temporale e spaziale nel corso di diversi giorni, ma richiedono anche tecniche di montaggio di esempio per migliorare. Vi presentiamo un protocollo dettagliato di montaggio per la microscopia foglio leggero dello sviluppo zebrafish multistrato. Il metodo è semplice da implementare e lo usiamo nel nostro laboratorio su una base quotidiana. I tubi FEP I componenti chiave della nostra strategia di montaggio sono tubi fatti di etilene propilene fluorurati polimero (FEP). Abbiamo deciso di utilizzare FEP soprattutto a causa del suo indice di rifrazione di 1,338, che è simile all&#39;acqua e quindi ideale per microscopia foglio leggero con obiettivi acqua-immersione e di campioni che richiedono mezzi acquosi. I tubi con 0,8 millimetri di diametro interno e 0,4 mm di spessore montare il pesce zebra in via di sviluppo molto bene, possono essere utilizzati con supporti tipici esempi adatti a 1,6 millimetricapillari e sono la nostra prima scelta per il metodo di montaggio presentato. Li abbiamo testato a fondo nelle nostre configurazioni in casa costruita così come nel sistema commerciale &quot;Lightsheet Z.1&quot; di Carl Zeiss Microscopy verificando che i tubi FEP offrire stabilità a lungo termine, hanno solo un impatto minimo sulle prestazioni ottiche e sono non fluorescente 10. Sono, tuttavia, non adatti per applicazioni con campioni che richiedono un indice di rifrazione diverso, ad esempio eliminato campione. Tubi e lamine in FEP sono disponibili in una varietà di diametri e spessori. Inoltre, FEP può essere fuso a 260 ° C e quindi offre possibilità pressoché infinite di supporti di montaggio del campione su misura. I tubi polimerici tendono ad essere fornito non sterile, motivo per cui il protocollo di pulizia incorpora diverse misure per garantire la migliore qualità ottica. Il rivestimento di metilcellulosa assicura che nessuna parte della crescente zebrafish si attacca al polimero. La decisione di 0,1% agarosio si fonda su ampie prove di crescita e immobilità in diverse concentrazioni di agarosio e metilcellulosa 10. Concentrazioni superiori allo 0,1% agarosio già mostrato un forte impatto sul tasso di crescita del 24 HPF zebrafish. Inoltre usiamo basse dosi del farmaco Tricaine anestetizzante. Potenziali d&#39;azione blocchi tricaine, inibisce così la trasmissione del segnale tra cervello e muscoli e sopprime contrazioni muscolari 16. Una concentrazione di 133-200 mg / L assicura sufficiente immobilizzazione di zebrafish tra 24-72 HPF. Tuttavia, Tricaine e altre droghe anestetizzante abbiamo testato spettacolo dosi effetti collaterali dipendenti come edema cardiaco. Inoltre, la dose richiesta di Tricaine varia con lo stadio di sviluppo dell&#39;embrione. Si consiglia pertanto di ridurre la concentrazione Tricaine all&#39;importo necessario per le fasi di sviluppo che vengono esposte. Per garantire la migliore prestazioce e prevenire la formazione di sottoprodotti tossici, soluzione stock Tricaine preparata di fresco o scongelato deve essere usato, al riparo dalla luce e riscaldamento non superiore a 30 ° C. L&#39;embedding in tubi FEP consente inoltre di facile modifica del mezzo di montaggio per tenere conto di esigenze specifiche. Per time-lapse imaging del cuore, si consiglia di utilizzare il 3% di metilcellulosa e 100 mg / L Tricaine invece del 0,1% agarosio e 200 mg / L per il montaggio. La metilcellulosa è più viscoso 0,1% agarosio fornendo così maggiore immobilità propria e meno Tricaine deve essere utilizzato per assicurare confinamento dell&#39;embrione. Tricaine è sensibile a temperature superiori a 30 ° C e può anche essere diluito dal fluido nella camera di imaging, conseguente diminuzione delle prestazioni e possibili contrazioni dell&#39;embrione. Pertanto, assicurarsi di utilizzare Tricaine anche nel mezzo di imaging in cui il campione montato è immerso. Se i vostri esperimenti richiedono l&#39;uso di una maggioretemperature, si raccomanda di cambiare il mezzo nella camera di imaging sia costantemente utilizzando un sistema di perfusione o manualmente con un tubo e una siringa tra due punti temporali. Passaggi critici I passaggi critici durante il processo di montaggio del campione sono le aspirazione del campione nella provetta e l&#39;inserimento della spina agarosio. L&#39;assunzione definisce la posizione iniziale dell&#39;embrione, che è ingombrante cambiare dopo. I campioni multipli devono essere disponibili per montare e la qualità di montaggio devono essere monitorati con uno stereomicroscopio. Se l&#39;orientamento del campione non è soddisfacente, alterando la velocità di elaborazione del campione e di evitare successivi movimenti del pistone può aiutare in quanto spesso stravolge l&#39;embrione. La spina agarosio 1,5% è necessario per evitare perdite di agarosio 0,1%. La superficie del tappo all&#39;interno del tubo deve essere piatta per non influenzare l&#39;orientamento campione durante lo sviluppo. Per ottenere una buona navigazioneasso, differenti spessori degli strati di agarosio devono essere testati e il tubo deve essere messo in agarosio normale alla superficie. Ruotando il tubo un po &#39;e tirando il tubo rilascia cautela la spina dal piatto. La qualità del montaggio deve essere verificata con uno stereomicroscopio prima di imaging. Immagini Multiview Uno dei principali vantaggi della microscopia foglio leggero è l&#39;imaging MultiView, la possibilità di ruotare il campione, acquisire z-stack da più angolazioni e successivamente registrare e fonderli. Un metodo stabilito per registrare i z-stack in uno spazio 3D è basato bead-registrazione utilizzando perline fluorescenti che circondano il campione come marcatori fiduciari 17. Questo metodo però si basa su un mezzo di montaggio solido come 1,5% agarosio e sembra quindi incompatibile con il multistrato montaggio presentato qui. Ma diverse soluzioni alternative funzionano a seconda dell&#39;applicazione. In primo luogo, le perline fluorescenti possonoessere incorporato nella spina agarosio, che deve essere nel campo visivo durante l&#39;acquisizione. In secondo luogo, le posizioni di fase possono essere calibrati prima degli esperimenti reale utilizzando una colonna di agarosio 1,5% con perline fluorescenti. Terzo, marcatori alternativi come nuclei fluorescenti possono essere usati per identificare la posizione di Z-stack rispetto all&#39;altro. Evaporazione Tipiche configurazioni microscopia foglio leggero usa una camera del campione aperta, che inevitabilmente porta a vaporizzazione del fluido. Poiché il mezzo è essenziale per la sopravvivenza del campione, per limitare l&#39;evaporazione del mezzo di montaggio e per l&#39;indice di rifrazione corretta tra ottica e di esempio, si consiglia di prendere una o più delle seguenti misure per prevenire l&#39;evaporazione. In primo luogo, il mezzo nella camera può essere costantemente scambiato da un sistema di perfusione. In secondo luogo, il mezzo può essere riempito manualmente. Terzo, la camera può essere coperto con un coperchio o una lamina flessibile. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; fornitura di ossigeno Il FEP polimero è stato sviluppato per resistere ad una grande varietà di prodotti chimici ed è quindi robusto, chimicamente inerte e nonpermeable a gas. Nel caso di montaggio multistrato ossigeno può penetrare solo attraverso la spina agarosio e l&#39;interfaccia agarosio-aria, ma resta da dimostrare se l&#39;apporto di ossigeno nel montaggio multistrato è notevolmente inferiore rispetto al montaggio in 1,5% agarosio senza tubo portante polimerica. Tuttavia, come il montaggio in 1,5% agarosio può essere utilizzato solo per circa due ore prima della morfologia zebrafish è influenzato montaggio multistrato sembra essere la soluzione complessiva superiore per l&#39;imaging a lungo termine. Imaging precedenti fasi di sviluppo Multistrato di montaggio è ormai diventata la nostra tecnica incasso standard per la microscopia di zebrafish di età superiore a 24 hpf foglio leggero time-lapse. Oltre a questo, usiamo anche i tubi polimerici per l&#39;imaging dei primi embrioni stadio. L&#39;indirizzo embryos rimangono nelle loro chorions e sono montati in un tubo FEP con diametro interno di 1 mm e riempiti con E3. Il pesce zebra in grado di svilupparsi liberamente all&#39;interno del corion e può ancora essere ripreso anche utilizzando la microscopia foglio leggero. Prospettiva Il montaggio del campione multistrato presentato scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo con zebrafish. Può essere facilmente adottata per altre tecniche di microscopia come la tomografia ottica di proiezione (OPT) e di altri organismi. Noi crediamo che i tubi FEP dimensioni standard sono solo i primi passi verso tecniche di montaggio del campione su misura per esigenze specifiche.

Per capire gli eventi complessi e interazioni durante l&#39;embriogenesi, la ricerca in biologia dello sviluppo è sempre più passando da microscopia di singole cellule e organi di immagini in vivo di interi organismi. Tradizionali tecniche di microscopia tipicamente non riescono ad offrire la risoluzione spaziale e temporale per seguire eventi rapidi per un lungo periodo di tempo e sono spesso causa di sbiancamento o effetti fototossiche nel campione 1. Noi e altri abbiamo trovato microscopia ottica foglio (Figura 1) sia la tecnica ideale per l&#39;imaging in vivo di zebrafish 2-4. L&#39;illuminazione del campione con un sottile foglio di luce laser, ortogonale all&#39;asse di rilevamento, offre sezionamento ottico veloce con alta risoluzione spaziale e minimizzato fototossicità 5. Allo stesso tempo, a causa di questa disposizione ottica unica, tecniche di montaggio tradizionale campione utilizzando piastre Petri o camere di coltura non sono adatti. In una luce tipicamicroscopio foglio tre motori traslazionali e un motore di rotazione tengono il campione, in modo da poter essere posizionato precisamente, trasformate e visualizzati da qualsiasi direzione. Negli ultimi campioni per la microscopia foglio leggero sono stati spesso incorporato nel 1-2% agarosio all&#39;interno di un capillare di vetro 6,7. In questo caso il cilindro agarosio solidificato con il campione incorporate viene estruso dal capillare di vetro nell&#39;apposita camera occupato dal mezzo acquosa per l&#39;imaging. Agarosio ha un indice di rifrazione vicino all&#39;acqua ed è quindi perfettamente adatto per microscopia foglio leggero in vivo che facilita corretta acqua-illuminazione e rilevazione ottica. Il campione viene confinato nella agarosio rigido e può essere ripreso bene per un breve periodo di tempo, ma cambiamenti morfogenetici e crescita dell&#39;embrione sono fortemente compromessa quando l&#39;imaging per diverse ore 7,8. Sebbene siano state sviluppate soluzioni per altre applicazioni 9, la non invasiva a lungo termine time-lapse zebrafish<html> potenziale di imaging della microscopia foglio leggero non può essere sfruttata utilizzando il tradizionale 1,5% agarosio incorporamento. Abbiamo quindi sviluppato una nuova strategia per il montaggio in vivo microscopia ottica di embrioni di zebrafish 10 fogli. Il campione è montato in 0,1% di agarosio con 200 mg / L Tricaine dentro un tubo del otticamente trasparente polimero fluorurato etilene-propilene (FEP). L&#39;embrione incorporato sviluppa normalmente a causa della bassa viscosità del mezzo. Allo stesso tempo, il tubo FEP limita il mezzo e il campione per la durata dell&#39;esperimento. Qui forniamo un protocollo dettagliato della nuova tecnica di montaggio e dati presenti riflettente suoi vantaggi rispetto al protocollo convenzionale. Abbiamo dimostrato che con il nostro sviluppo zebrafish metodo può essere continuamente ripreso con elevata risoluzione spaziale e temporale in un periodo di più di due giorni. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Il principio di microscopia foglio leggero. A zebrafish montato in un tubo in etilene propilene fluorurato (FEP) può essere tradotto e ruotato il piano focale dell&#39;obiettivo rilevamento. Un foglio sottile di luce laser (foglio leggero) è proiettata dall&#39;obiettivo illuminazione nel piano focale dell&#39;obiettivo rilevamento e illumina solo una sezione ottica sottile del campione. Il segnale di fluorescenza emessa viene raccolta dall&#39;obiettivo rilevamento e registrato su un chip fotocamera.

<table><tbody><tr><td>Provette in etilene propilene fluorurato (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm di diametro interno/esterno, altre misure disponibili</td></tr><tr><td>Siringa Omnifix-F Solo da 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Cannula monouso Sterican, smussata</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, altre misure disponibili, il diametro esterno della cannula deve adattarsi al diametro interno del tubo</td></tr> <tr><td>FEPProvetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>fornito in polvere</td></tr><tr><td>Terreno E3 (per embrioni di zebrafish)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo di reazione</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>fornito in polvere</td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>di PetriGreiner</td><td>633180</td><td>plastica, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>sinonimi:&nbsp; Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato, MS-222, TS 222, tricaina metanosolfonato&nbsp;</td></tr><tr><td>Obiettivo per microscopio 10X/0,3 W Leica</td><td></td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Fotocamera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero microscopia di zebrafish

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Foglio di microscopia ottica è la tecnica di imaging ideale per studiare lo sviluppo embrionale zebrafish. Grazie alla minima foto-tossicità e sbiancamento, è particolarmente adatto per il lungo termine time-lapse imaging per molte ore fino a diversi giorni. Tuttavia, è necessaria una strategia di montaggio campione adeguato che offre sia il parto e lo sviluppo normale del campione. Multistrato di montaggio, una nuova tecnica di incorporamento con bassa concentrazione di agarosio in tubi otticamente chiaro, ora supera questa limitazione e scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo.

Imaging multiday di Zebrafish Vasculature Sviluppo Usiamo 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebrafish per dimostrare i vantaggi della strategia di montaggio multistrato a lungo termine microscopio foglio leggero. L&#39;obiettivo è quello di immagine lo sviluppo del sistema vascolare in tutta zebrafish su un percorso di 2 giorni. L&#39;embrione zebrafish è stato montato in 0,1% agarosio all&#39;interno di un tubo polimerico rivestito metilcellulosa. Qui, il pesce zebra non è limitata dal mezzo di montaggio e può svilupparsi normalmente. La testa alza, la coda si estende e germinazione vascolare appare senza ostacoli (Figura 3). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini Multiday dello sviluppo vascolare zebrafish. Vascolarizzazione di un multilayer montato 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebrafish sviluppa senza ostacoli in un microscopio foglio leggero nel corso di due giorni. Un foglio di luce laser 488 nm eccitato la fluorescenza e il segnale è stato rilevato utilizzando 10X/0.3 W oggettiva e una fotocamera EMCCD. Z-stack sono stati acquisiti su quattro posizioni adiacenti ogni 10 min e successivamente cuciti con le Figi 15. Sono mostrate proiezioni di massima intensità di un sottoinsieme di punti temporali. Barra della scala:. 500 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Imaging of Early Zebrafish Embriogenesi Qui, dimostriamo la capacità di tubi FEP come supporto di montaggio per la microscopia leggero foglio di embriogenesi precoce zebrafish durante il primo giorno dopo la fecondazione. L&#39;8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 zebrafish è stato montato con il suo corion intatto all&#39;interno di un tubo E3-riempita con idiametro nner di 1 mm. Che si traduce in un leggero bloccaggio del corion. Tutti i processi di sviluppo durante l&#39;embriogenesi non sono influenzati dal montaggio e possono essere visualizzati in modo ottimale utilizzando la microscopia foglio leggero. In questo esempio, abbiamo ripreso il campione su un percorso di 12 ore (Figura 4). Cambiamenti di forma tipici durante l&#39;embriogenesi iniziale, come la maggiore allungamento del tuorlo e ispessimento del tessuto lungo la linea mediana, sarebbero oppressi quando si utilizza il montaggio tradizionale senza corion in 1,5% agarosio. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figura 4 Imaging di embriogenesi precoce zebrafish Un Tg (H2A: GFP) 14. Zebrafish passa attraverso embriogenesi precoce. È stato rilevato un foglio leggero laser 488 nm GFP eccitato e il segnale di fluorescenzacon una W obiettivo 10X/0.3 e una fotocamera EMCCD. Z-stack da due angoli sono stati acquisiti ogni 3 minuti per un corso di 12 ore. Sono mostrati normalizzati proiezioni di massima intensità di un sottoinsieme del time-lapse. Visibile sfuocatura di movimento a 19 risultati HPF dalla contrazione embrione durante l&#39;acquisizione, in quanto sono stati utilizzati senza anestesia. Barra della scala:. 150 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di montare un embrione di pesce zebra per microscopie a foglio luminoso in vivo a lungo termine. Questo viene ottenuto innanzitutto pulendo un tubo in polipropilene etilene fluorurato o FEP e rivestendolo con metilcellulosa. Successivamente, un embrione di pesce zebra di interesse viene rivestito.Quindi l'embrione viene trasferito prima in agarosio fuso, e successivamente nel tubo FEP rivestito. Infine, il fondo del tubo viene chiuso con un tappo di aros e l'orientamento dell'embrione montato viene controllato con attenzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano lo sviluppo non perturbato di embrioni di pesce zebra per diversi giorni, con elevata risoluzione spaziale e temporale, mediante microscopia a foglio luminoso in vivo.Beh, il principale vantaggio rispetto alle tecniche esistenti è che ora possiamo osservare gli embrioni di pesce super per diversi giorni e non solo per poche ore. Questo metodo può fornire informazioni preziose sullo sviluppo embrionale a lungo termine del pesce zebra mediante microscopia a foglio luminoso. Può inoltre essere applicato ad altri organismi piccoli, come piccoli organismi marini.È inoltre possibile utilizzarlo con altre tecniche di microscopia come la tomografia a proiezione ottica, la microscopia in campo chiaro o la microscopia confocale. Le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché il protocollo comprende alcuni passaggi critici nel tempo e la valutazione della posizione finale dell'embrione richiede una certa esperienza. Per preparare un tubo in FEP, innanzitutto pulirlo facendovi passare ripetutamente una soluzione di idrossido di sodio uno molare. Successivamente trasferire il tubo in un tubo da centrifuga da 50 millilitri riempito con idrossido di sodio 0,5 molare e sottoporlo a ultrasuoni per 10 minuti.Trasferire il tubo polimerico in un piccolo contenitore con acqua deionizzata distillata e sciacquarlo. Successivamente, eseguire uno sciacquo con etanolo al 70% prima di trasferirlo in un nuovo tubo da centrifuga. Con etanolo ultras.Sonicare il tubo per 10 minuti prima di trasferirlo in un piccolo contenitore con acqua distillata deionizzata e sciacquarlo nuovamente. Tagliare il tubo FEB pulito in pezzi lunghi tre centimetri e raddrizzarli se necessario. Conservare i tubi puliti in un nuovo tubo da 50 millilitri riempito con acqua distillata deionizzata.Preparare la soluzione madre di Trica. 3% di metilcellulosa e sia 1,5% che 0,1% di Aros secondo il protocollo descritto nel testo. Sciogliere l'agarro allo 1,5% e versarlo in una piastra di Petri per formare uno strato di spessore pari a circa due millimetri.Prelevare embrioni di pesce zebra allo stadio desiderato che esprimono positivamente il gene fluorescente scelto e trasferirli in una nuova piastra con E tre sotto uno stereomicroscopio. Utilizzando due pinzette appuntite, rivestire con attenzione gli embrioni usando una pinzetta per trattenere la coriona e la seconda pinzetta per aprirla strappandola via, al fine di eseguire il montaggio multistrato. Con le mani guantate, fissare un cannulo a estremità ottusa su una siringa.Inserire con attenzione la cannula di circa tre millimetri in un'estremità di un pezzo di tubo FEP pulito. Successivamente, immergere l'estremità libera del tubo FEP in una soluzione di metilcellulosa al 3% e riempire il tubo con la soluzione. Poi spingere lentamente sulla siringa per rilasciare la metilcellulosa utilizzando il mezzo E tre, ripetere i passaggi di immersione ed espulsione.Nel frattempo, in un blocco riscaldante, riscaldare un'aliquote di aros allo 0,1% a 70 gradi Celsius. Vortexare brevemente il tubo di reazione prima di trasferirlo in un blocco riscaldante impostato a 38 gradi Celsius. Dopo il riscaldamento, lasciare raffreddare brevemente il tubo e aggiungere trica fino a una concentrazione finale di 133-200 milligrammi per litro e vortexare.Di nuovo, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, trasferire un embrione rivestito nel tubo della reazione con l'aROS, trasferendo il minor quantitativo possibile di E3. Con il tubo FEP e la siringa collegata, aspirare delicatamente una piccola quantità di aROS prima di prelevare l'embrione e riempire completamente il tubo con aROS.L'embrione deve essere posizionato a un'estremità del tubo con la testa rivolta verso l'apertura. Per evitare fuoriuscite del contenuto, mantenere il tubo in posizione orizzontale per tapparlo. Utilizzare una lametta per tagliarlo dalla cannula.Quindi, tenendo il tubo perpendicolare, inserire lentamente l'estremità attraverso l'intero strato di agarosio al 1,5% e ruotarlo leggermente. Per evitare l'essiccazione, mantenere il campione montato in un tubo da reazione da 1,5 millilitri riempito con mezzo E three prima dell'acquisizione delle immagini. Verificare che il pesce all'interno del tubo FEP sia posizionato in posizione verticale e che la sua testa sia esattamente sopra il tappo per l'acquisizione delle immagini.Aggiungere trica al mezzo all'interno della camera di imaging. Qui mostrato è un embrione di pesce zebra transgenico a un giorno dalla fecondazione K-G-R-L-G-F-P, immaginato nell'arco di due giorni per osservare lo sviluppo della vascolarizzazione.Il pesce zebra non è vincolato dal mezzo di montaggio e può svilupparsi normalmente. Ad esempio, solleva la testa. La coda si estende e la formazione di nuovi vasi sanguigni avviene senza ostacoli.Questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se effettuata correttamente e se tutti i materiali sono prontamente disponibili. Ricordarsi di eseguire tutti i passaggi principali senza alcun ritardo. Mantenere tutte le soluzioni pulite, poiché lo sporco può compromettere la qualità dell'immagine finale.

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