Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

L'obiettivo generale di questa metodologia è rendere la microiniezione di larve di pesce zerbra più facile e accurata. Questo metodo aiuta i ricercatori a utilizzare sistemi di modelli di pesce zebra per immobilizzare le larve di pesce zebra in orientamenti specifici in grandi array. La tecnica consente un accesso più facile a tessuti specifici per la microiniezione e l'imaging ed è molto efficace quando è richiesto un gran numero di larve per applicazioni come l'infezione o i modelli di xenotrapianto di cancro.

Le mie strategie di fabbricazione nei modelli di zebrafish sono altamente complementari. Uno è semplice e creato dall'uomo. L'altro è vivo e complesso.

Entrambi condividono la stessa scala di dimensioni. Sono entrambi trasparenti. Ed entrambi consentono osservazioni con risoluzione di una singola cella.

Come mostri qui, possono essere facilmente combinati e potrebbero avere applicazioni per lo studio di praticamente qualsiasi malattia importante. Dopo aver preparato un blocco PDMS in una capsula di Petri ricoperta da una sottile pellicola di E-3, secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire il numero richiesto di embrioni sulla superficie del blocco PDMS. Utilizzando un anello per capelli o uno strumento simile, spingere gli embrioni nelle fessure della microstruttura, in particolare per l'orientamento dorsale e ventrale.

Quando si caricano le larve nelle buche, è importante avere abbastanza acqua che copra il blocco PDMS per consentire una facile manipolazione. È anche importante spingerli nelle fessure in modo che rimangano in posizione durante l'iniezione. Per orientare il pesce zebra su canali di microstruttura precedentemente preparati secondo il protocollo di testo, utilizzare una pipetta di trasferimento per prelevare E-3 dal blocco PDMS modellato.

Il livello di E-3 dovrebbe scendere al di sotto del bordo del blocco, ma essere ancora presente nel serbatoio e nei canali, e rimane uno strato sottile sul PDMS. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire 10 embrioni anestetizzati nel serbatoio, facendo attenzione a non traboccare dai bordi. Usando un anello per capelli, manipola ogni embrione nella testa dell'imbuto, prima all'ingresso del canale appropriato, assicurandoti che l'embrione abbia l'orientamento appropriato quando entra nel canale.

Quindi, usa un anello per capelli per far scorrere ogni embrione lungo il canale, fino a raggiungere le microcaratteristiche di orientamento nelle pareti del canale che lo tengono in posizione. Dopo la preparazione degli aghi per microiniezione e della soluzione per microiniezione, utilizzare una punta di pipetta finemente affusolata per caricare cinque microlitri di soluzione nell'ago. Montare l'ago in un micromanipolatore montato su un supporto magnetico e collegarlo a un microiniettore a pompa PICO.

Quindi, usa una pinza per rompere la punta di un ago con un angolo di 45 gradi pizzicando la punta affusolata. Regolare la dimensione del bolo di iniezione a un nanolitro regolando il tempo di iniezione sul controller della pompa PICO. Regolare l'angolo dell'ago per microiniezione sul controller di micromanipolazione, iniziando con 45 gradi con l'ago parallelo alla lunghezza dell'embrione.

Un angolo più ripido può essere utilizzato per ridurre al minimo il movimento laterale dell'embrione durante la microiniezione. Controllando la piastra di Petri con la mano sinistra e il micromanipolatore necessario con la destra, portare l'ago il più vicino possibile al sito di microiniezione previsto, come la vescicola otica. Utilizzando il controller di micromanipolazione, inserire l'ago nel tessuto bersaglio e utilizzare l'interruttore a pedale della pompa PICO per iniettare il volume preimpostato.

Se il tessuto resiste alla penetrazione, toccare delicatamente la manopola del controller di micromanipolazione. Per rilasciare gli embrioni, utilizzare una pipetta di trasferimento per far scorrere E-3 sulla superficie dall'alto verso il basso, oppure facendo roteare il piatto in modo che gli embrioni vengano rilasciati nell'E-3 circostante. Trasferire gli embrioni in una capsula di recupero di E-3 senza MS-222.

Per eseguire lo screening degli embrioni utilizzando il dispositivo PDMS nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri o una pipetta di trasferimento a punta stretta per adescare il dispositivo facendo scorrere E-3 attraverso la porta. Utilizzare E-3 e MS-222 per riempire il pozzo fino a quando il dispositivo non è coperto. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per erogare quattro embrioni precedentemente iniettati in ciascun pozzetto.

Utilizzando un anello per capelli o uno strumento simile, posizionare gli embrioni all'ingresso dei canali di imaging con l'orientamento desiderato e spingerli parzialmente nel dispositivo. Questo aiuterà ad attirarli nel dispositivo in modo uniforme. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri o una pipetta di trasferimento, aspirare E-3 attraverso il dispositivo dalla porta fino a quando gli embrioni non vengono aspirati nei canali con l'orientamento corretto per l'imaging.

Trasferire la piastra a pozzetti in un microscopio a fluorescenza invertita. Per visualizzare gli embrioni, regolare l'ingrandimento selezionando l'obiettivo appropriato, ad esempio 10x per l'imaging della migrazione del neturaohil del pesce zebra. Regola l'intensità della sorgente luminosa e il tempo di esposizione per ciascun canale, in modo che ogni segnale sia chiaro, ma non saturo.

Infine, acquisisci immagini per ogni canale fluorescente e trasmesso. Utilizzando il dispositivo a canale microstrutturato per stabilizzare gli embrioni nell'orientamento laterale, è stata testata la capacità dei neutrofili di rispondere ai chemioattrattivi standard fMLP e LTB4 microiniettati nelle vescicole otiche, di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di zebrafish. Per visualizzare il reclutamento dei neutrofili, sono state tracciate iniezioni con destroncino di rodamina ad alto peso molecolare ed eseguite in embrioni transgenici con neutrofili fluorescenti verdi.

Gli embrioni non iniettati e gli embrioni iniettati con la sola rodamina sono stati utilizzati come controlli negativi. Dopo la microiniezione, gli embrioni sono stati trasferiti nel dispositivo del canale di imaging e sottoposti a imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza EVOS a 30 minuti e cinque ore dopo l'iniezione. Come previsto, un piccolo numero di neutrofili fluorescenti è stato reclutato nella finta vescicola otica iniettata all'inizio del tempo, probabilmente a causa di un reclutamento mediato danneggiato.

È interessante notare che è stato osservato che il tracciante destrano di rodamina si accumula negli otoliti durante l'esperimento. Per entrambi i chemioattrattivi, i neutrofili sono stati reclutati in numero maggiore, in particolare in risposta a LTB4. Una volta padroneggiata, questa tecnica può migliorare notevolmente la velocità e l'accuratezza della microiniezione di zebrafish.

Lo sviluppo di questa tecnica è stato guidato da sfide specifiche nel nostro laboratorio. Abbiamo perfezionato questo approccio per adattarlo alle esigenze dei nostri progetti sulle infezioni fungine e sugli xenotrapianti tumorali in modelli di zebrafish. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare gli array di superficie microstrutturati per la microiniezione di zebrafish e per l'imaging dal vivo esteso.