Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire la mappatura del destino e il tracciamento del lignaggio di singole cellule selezionate in embrioni di zebrafish. Ciò si ottiene coniugando chimicamente la fluoresceina in gabbia con destrano ad alto peso molecolare. Successivamente, il destrano di fluoresceina in gabbia preparato viene microiniettato in embrioni di zebrafish, che viene poi fotoattivato in cellule selezionate utilizzando l'assorbimento di due fotoni.

Dopo la fotoattivazione degli embrioni, viene eseguita l'analisi immunoistochimica per rilevare il destrano di fluoresceina non ingabbiato al fine di mappare il destino delle cellule attivate. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per determinare il contributo del lignaggio e la localizzazione tissutale delle singole cellule fotoattivate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza standard, è che può essere utilizzata per marcare in modo differenziato singole cellule per la mappatura della fede.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come le cellule precursori indifferenziate possono contribuire a diversi tipi di tessuto, la dimostrazione visiva è fondamentale poiché le fasi di montaggio dell'embrione e di fotoattivazione sono difficili da apprendere sulla base della sola descrizione del testo. Prima di iniziare, sintetizzare il destrano di fluoresceina in gabbia e conservarlo in tubi ricoperti di carta stagnola. Quindi microiniettare gli embrioni allo stadio di una o due cellule con la fluoresceina destrano sintetizzata.

Dopo che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo appropriato, ricoprili. Quindi montare gli embrioni rivestiti in aero a basso punto di fusione per la fotoattivazione. Quando il sorto si è solidificato caricare il software LSM five 10.

Posizionare un filtro giallo trasparente nel percorso del raggio di luce bianca, quindi selezionare Scansiona nuova immagine e fare clic su Avvia modalità esperto. Seleziona la scheda laser, accendi il ferro da stiro ad argon e le sorgenti laser mi tai. Imposta la lunghezza d'onda mi tai su sette 40 nanometri.

Quindi, selezionare la scheda di configurazione. Impostare le configurazioni del percorso ottico per lo ione argonne e il laser mi tai. Quindi selezionare la scheda di scansione.

Cambia l'obiettivo a 20 volte 0,8. Imposta la velocità di scansione massima facendo clic sul metodo di impostazione della modalità massima e sul numero rispettivamente sulla media della linea e uno nella scheda dei canali deseleziona tutte le sorgenti laser ad eccezione del mi tai. Quindi, posizionare un misuratore di potenza nel percorso del raggio ottico, quindi selezionare il pulsante con per attivare la scansione continua.

Regolare la percentuale di trasmissione fino a quando il misuratore di potenza non legge una potenza laser media di 47 milliwatt. Quindi interrompere la scansione selezionando il pulsante di arresto nella scheda dei canali. Deseleziona la sorgente laser mi tai e seleziona il ferro da stiro.

Quindi seleziona nuovamente il pulsante XY veloce nella scheda dei canali, regola il foro stenopeico. Rileva il guadagno, amplifica un offset e amplifica di nuovo per il laser a ferro Argonne per ottenere la migliore qualità dell'immagine. Utilizzando il controller di fase, trova e concentrati sulla cella da attivare, quindi fai clic sul pulsante di arresto Utilizzando lo strumento di ritaglio, ritaglia la cella attivata in modo che il fattore di ritaglio nella scheda della modalità venga visualizzato da 50 a 70.

Quindi interrompere la scansione selezionando il pulsante di arresto nella scheda dei canali. Deselezionare il laser agli ioni argonne e selezionare il laser My Tai nella scheda della modalità. Impostare la velocità di scansione su 31,46 secondi.

Quindi selezionare il singolo pulsante per avviare la scansione per l'attivazione a due fotoni del destrano di fluoresceina in gabbia della cella selezionata. Dopo l'attivazione, vai alla scheda dei canali e ora deseleziona il laser mi tai e riseleziona il laser agli ioni di argon. Quindi, in modalità, impostare il fattore di zoom su uno. Prossimo.

Sotto l'intestazione velocità, fare clic sul pulsante max per impostare la velocità di scansione più elevata. Per rivedere la regione attivata dalla foto, selezionare xy veloce. Quindi selezionare la scheda dei canali e regolare il foro stenopeico e rilevare di nuovo, verificare che la regione attivata dalla foto non sia ablata al laser.

Dopo aver preparato gli embrioni fotoattivati per la rilevazione immunologica del destrano di fluoresceina non in gabbia seguendo il protocollo delineato nel manoscritto allegato. Lavare gli embrioni sei volte in PBT e due volte in tampone AP. Quindi trasferire gli embrioni in piastre a nove pozzetti in tampone AP.

Quindi, aspirare il tampone AP e aggiungere N-B-T-B-C-I-P. Arrestare lo sviluppo della colorazione N-B-T-B-C-I-P aspirando la soluzione N-B-T-B-C-I-P. Quindi lavare gli embrioni in PBT.

Ora recupera gli embrioni e agitali su una piattaforma rotante per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere il lavaggio PBT altre due volte. Infine, montare gli embrioni in aros a basso punto di fusione allo 0,6% e acquisire immagini delle cellule fotoattivate utilizzando un microscopio composto verticale.

In questa figura, un'immagine in campo chiaro mostrata a sinistra e un'immagine fluorescente mostrata a destra di un embrione di pesce zebra microiniettato con filamento dex di fluoresceina in gabbia prima della fotoattivazione. Come mostrato qui, l'embrione è stato fotoattivato in uno dei somiti indicati dalla freccia nella figura in campo chiaro a sinistra con una lunghezza d'onda di sette 40 nanometri, un tempo di scansione di 31 secondi e una potenza laser media di 47 milliwatt. Nella figura a destra, dopo la fotoattivazione, si può osservare la fluorescenza del destrano di fluoresceina non ingabbiato.

La colorazione immunitaria del destrano di fluoresceina non ingabbiato è raffigurata in una piccola regione nella placca laterale, mesoderma di un 10. Quindi l'embrione allo stadio di acaro è stato fotoattivato utilizzando gli stessi parametri laser della figura precedente utilizzando la procedura di rilevamento immunologico. La regione attivata, come indicato qui dalla freccia, può essere identificata con una minima colorazione di fondo Seguendo questa procedura.

È possibile eseguire ulteriori analisi, come l'immunocolorazione, per diversi marcatori tessuto-specifici, al fine di caratterizzare meglio la posizione e il destino delle cellule marcate. Utilizzando questa tecnica, apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per studiare l'origine delle cellule progenitrici arteriose in quelle venose nello sviluppo di embrioni di zebrafish. Non dimenticare che quando si lavora con reagenti chimici come NBT e BCIP, possono essere estremamente pericolosi e i guanti devono essere sempre indossati.