Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di etichettare e visualizzare le cellule multiciliate del pesce zebra in situ. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali fattori regolano i solfati multiciliati nel rene embrionale di zebrafish? Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia i trascritti proteici che quelli di RNA possono essere marcati contemporaneamente, il che è utile in assenza di anticorpi specifici per zebrafish.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando siamo andati a marcare le cellule multiciliate nel pronefro analizzando la presenza di ciglia dopo aver apportato modifiche all'embrione. Inizia fissando gli embrioni di zebrafish a 24 ore dopo la fecondazione in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% per due o quattro ore a temperatura ambiente senza agitazione. Successivamente, lavare gli embrioni due volte in PBS con 0,1% Tween 20 o PBST seguito da un lavaggio con cinque millilitri di metanolo al 100%.

Quindi, incubare gli embrioni in cinque millilitri di etanolo fresco al 100% per almeno 20 minuti a meno 20 gradi Celsius. Per preparare gli embrioni all'ibridazione, reidratare i neonati in cinque millilitri di metanolo al 50% e PBST per cinque minuti, seguiti da cinque minuti in cinque millilitri di metanolo al 30% e PBST. Lavare gli embrioni due volte per cinque minuti ciascuno in cinque millilitri di PBST e incubare gli embrioni in cinque millilitri di una soluzione di proteinasi K e PBST da uno a 1.000 per due minuti, seguiti immediatamente da altri due lavaggi in cinque millilitri di PBST.

Fissare gli embrioni in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% per almeno 20 minuti a temperatura ambiente seguiti da due lavaggi in cinque millilitri di PBST 20. Per facilitare le interazioni tra gli embrioni e la soluzione di ibridazione, trasferire gli embrioni in cinque millilitri di PBST in provette da microcentrifuga verticali a fondo piatto in un rack per microcentrifuga e lavare gli embrioni due volte per cinque minuti ciascuno in 1,5 millilitri di soluzione di ibridazione. Dopo il secondo lavaggio, incubare gli embrioni in 1,5 millilitri di soluzione di ibridazione fresca a 70 gradi Celsius in un forno di ibridazione per quattro-sei ore.

Quindi, sostituire la soluzione di ibridazione con 10 microlitri di sonda di RNA di interesse e 500 microlitri di soluzione di ibridazione per un'ibridazione notturna della sonda a 70 gradi Celsius. La mattina successiva, lavare gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di formammide al 50% e 2X tampone citrato di soluzione salina e sodio o SSC per 20-30 minuti per lavaggio a 70 gradi Celsius. Quindi, lavare gli embrioni una volta in 1,5 millilitri di SSC 2X da solo a 70 gradi Celsius per 15 minuti, seguiti da due lavaggi in 1,5 millilitri di SSC 0,2X a 70 gradi Celsius per 20-30 minuti per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, sostituire l'SSC 0,2X con 1,5 millilitri di reagente bloccante per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, sostituire il reagente bloccante con 0,2 millilitri di anti-digossina nella perossidasi di rafano e nel reagente bloccante in un rapporto di uno a 1.000 per un'incubazione di tre ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi, lavare gli embrioni da due a quattro volte in 1,5 millilitri di tampone di acido malico per 10-15 minuti per lavaggio, seguito da un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius in 1,5 millilitri di tampone di acido malico fresco.

La mattina successiva, sostituire il tampone di acido malico con 1,5 millilitri di PBS e lavare gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di PBS per cinque minuti per lavaggio. Incubare gli embrioni in 0,2 millilitri di soluzione esposibile fluorescente Si3 per 60 minuti, seguiti da quattro lavaggi consecutivi di 10 minuti in 1,5 millilitri di concentrazioni crescenti di metanolo. Dopo l'ultima incubazione, incubare gli embrioni a temperatura ambiente in 1,5 millilitri di perossido di idrogeno all'1% e metanolo per 30 minuti.

Quindi, lavare gli embrioni per 10 minuti per lavaggio in soluzioni discendenti di metanolo da 1,5 millilitri seguiti da due lavaggi di cinque minuti in 1,5 millilitri di PBS. Successivamente, lavare gli embrioni in 1,5 millilitri di acqua distillata doppia per cinque minuti, seguiti da un lavaggio di sette minuti in 1,5 millilitri di acetone a meno 20 gradi Celsius. Lavare gli embrioni in altri 1,5 millilitri di acqua distillata doppia per cinque minuti, seguiti da un lavaggio di cinque minuti in 1,5 millilitri di PBST con l'1% di DMSO o PBDT.

Incubare gli embrioni a temperatura ambiente in 1,5 millilitri di PBDT con il 10% di FBS su un bilanciere per due ore. Quindi, sostituire il PBDT e l'FBS con 1,5 millilitri di anticorpi primari per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, lavare gli embrioni in 1,5 millilitri di PBDT, FBS e 0,1 molari di cloruro di sodio per un minuto con dondolo seguito da cinque lavaggi a dondolo di 30 minuti in 1,5 millilitri di PBDT, FBS e cloruro di sodio.

Dopo l'ultimo lavaggio, lavare gli embrioni una volta in 1,5 millilitri di PBDT e FBS solo per 30 minuti con oscillazione seguita da un'incubazione notturna in 200 microlitri degli anticorpi secondari appropriati a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. La mattina successiva, lavare rapidamente gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di PBDT seguiti da un'incubazione di 15 minuti in 1,5 millilitri di DAPI su un bilanciere. Quindi, lavare gli embrioni tre volte in 1,5 millilitri di PBDT con FBS e cloruro di sodio per 15-20 minuti per lavaggio e conservare gli embrioni in 1,5 millilitri di PBDT a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce ambientale.

Per visualizzare i reni del pesce zebra, deporre gli embrioni lateralmente su vetrini in circa 10 microlitri di PBDT. Usando un paio di pinze sottili e un microscopio da dissezione, spremere il primo embrione dietro gli occhi per rimuovere la testa e parte della pallina vitellino. Quindi, raschiare delicatamente la pallina di vitellino rimanente dal corpo dell'embrione.

Durante la rimozione della pallina vitellino, fare attenzione a non toccare l'estensione del sacco vitellino poiché il tessuto di interesse si strappa facilmente e si trova direttamente sopra l'estensione. Utilizzare un fazzoletto sottile per rimuovere il tuorlo dissociato e il liquido in eccesso dal vetrino. Quindi, aggiungi una goccia di mezzo di montaggio alla coda rimanente e posiziona la coda lateralmente.

Appiattire la coda con un vetrino coprioggetti e posizionare il carrello in una scatola di scorrimento coperta. Quindi, utilizzare l'obiettivo 60X su un microscopio confocale per visualizzare le ciglia del rene sui canali fluorescenti appropriati. Nelle seguenti immagini rappresentative di un embrione di pesce zebra colorato come appena dimostrato, le cellule multiciliate possono essere identificate sulla base della visualizzazione della ribosonda antisenso utilizzata per riconoscere l'espressione del trascritto ODF3B, dei corpi basali marcati con tubulina gameta e delle ciglia marcate con alfa tubulina acetilata.

Infatti, a questo ingrandimento del pronefro embrionale, si può osservare una cellula multiciliata con trascritti ODF3B, più corpi basali e ciglia. La cellula monociliata adiacente può essere distinta dal suo singolo corpo basale e dal singolo fenotipo del cilio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare embrioni appena fissati e di mantenere i campioni protetti dalla luce ambientale dopo l'aggiunta del primo anticorpo.