Name: Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Impara a visualizzare cellule multiciliate in Danio rerio con un protocollo combinato di ibridazione in situ e immunofluorescenza. Questo metodo consente l'etichettatura simultanea di RNA e proteine per studiare lo sviluppo renale.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dalla concessione R01DK100237 R.A.W e il National Science Foundation Graduate ricerca Fellowship No. DGE-1313583 di Raffaele Ringraziamo anche il College di Scienze Undergraduate Research Fellowship programma estivo per supporto per M.U. Vorremmo ringraziare il centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame per la loro cura dedicato del nostro zebrafish. Vorremmo anche ringraziare il dipartimento di scienze biologiche, come pure i membri del nostro laboratorio per tutte le loro supporto e informazioni preziose.

Il seguente protocollo utilizza zebrafish adulti tenuto e curato dal centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame. Tutti i metodi per l'utilizzo di embrioni e zebrafish adulti sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale.
1. embrione fissazione
<ol><li>Raccogliere gli embrioni di zebrafish utilizzando metodi precedentemente descritti39,40. Alle 24 hpf, aggiungere 500 µ l di soluzione di miscela di proteasi aspecifiche (50 mg/mL) per l'E3 in un embrione piatto Incubare a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Una volta che gli embrioni iniziano a scoppiare di chorion, rimuovere tutto il liquido dal piatto dell'embrione.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 2 - 3 volte con E3 fresco aggiungendo circa 20 mL di E3, agitando delicatamente la E3 nel piatto, e quindi decantare il liquido in un recipiente di scarico liquido.</li>
	<li>Per eutanasia gli embrioni prima del fissaggio, aggiungere 2 mL di tricaina 0,2% per l'E3.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in un flaconcino di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta Pasteur di plastica. Rimuovere la maggior parte della soluzione tricaina/E3 con la pipetta dopo gli embrioni hanno depositato sul fondo del flaconcino.</li>
	<li>Difficoltà 24 embrioni hpf con 5 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 2-4 h a RT, senza agitazione. Attenzione: PFA è tossico e soluzioni PFA dovranno essere gestiti sotto una cappa chimica, mentre il ricercatore indossa un camice da laboratorio, guanti e occhiali di protezione. Preparazione del fissativo PFA dalla polvere granulata di PFA dovrebbe essere effettuato con cura eccezionale, come il granulato PFA tende a disperdere attraverso carica statica. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C. Preparare 4% PFA riscaldando 1x tamponato fosfato salino (PBS) ad ebollizione rimestando continuamente la soluzione per sciogliere completamente il granulato PFA. Una volta che la soluzione è raffreddata giù per RT, il 4% PFA è filtro sterilizzato facendolo passare attraverso un sistema monouso di 0,45 µm per filtrazione sotto vuoto, quindi e aliquotati in porzioni di 15 mL o 50 mL per la conservazione a-20 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il 4% PFA e gli embrioni di lavare due volte con 1 tampone fosfato X salino con 0.1% Tween-20 (PBST) a RT. lavare gli embrioni una volta con 5 mL di metanolo al 100% (MeOH) a RT. aggiungere 5 mL di fresco 100% MeOH agli embrioni e incubare a-20 ° C per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in 100% MeOH a-20 ° C fino al momento per la preparazione di embrione.</li>
</ol>2. ibridazione e preparazione embrione
<ol><li>Reidratare gli embrioni con il lavaggio una volta in 5 mL di 50% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. continua reidratazione lavando gli embrioni in 5 mL di 30% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. lavare gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST due volte per 5 minuti ciascuno, a RT.</li>
	<li>Permeabilize gli embrioni di incubarle in 5 mL di una soluzione di 1:1,000 proteinasi K (pK) (10 mg/mL) in 1 x PBST per 2 minuti a TA. Nota: Più vecchi embrioni possono essere incubati più di 2 min con la concentrazione di pK indicata sopra, tuttavia meno di 2 minuti di tempo di una concentrazione di 5 mg/mL e l'incubazione è suggerito per gli embrioni più giovani di 24 hpf.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di pK e lavare immediatamente in 5 mL di 1x PBST due volte a RT. Difficoltà gli embrioni in 5 mL di 4% PFA a temperatura ambiente per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere PFA e lavare due volte in 5 mL di 1 x PBST a TA.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST nelle provette microcentrifuga fondo piatto posizionato verticalmente in un rack microcentrifuga a RT per facilitare le interazioni tra ciascun embrione e la soluzione di ibridazione successive.</li>
	<li>Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di soluzione di ibridazione (IBRID +) a RT. aggiungere 1,5 mL di fresco Hyb + e incubare gli embrioni a 70 ° C in un forno di ibridazione per 4-6 h.</li>
	<li>Sostituire i 1,5 mL di ibrid + con un volume di soluzione della sonda (10 µ l RNA sonda/500 µ l Hyb +) sufficiente a coprire completamente gli embrioni. Nota: Sintetizzare antisenso sonda RNA usando precedentemente descritto metodi39.</li>
	<li>Ibridare la sonda pernottamento in forno a 70 ° C l'ibridazione con il montante di tubi singoli posizionati nel rack microcentrifuga, senza agitazione.</li>
</ol>3. caldo lavaggi e blocco
Nota: Lavaggi caldi vengono eseguite mettendo la soluzione appropriata sugli embrioni e incubando poi in forno a 70 ° C. ibridazione Per mantenere le soluzioni di lavaggio a 70 ° C, mettere le provette da 50 mL di ciascuna soluzione in forno ibridazione quando la sonda / IBRID + miscela viene aggiunto.
<ol><li>Rimuovere la sonda. Lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 50% formammide/2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) per 20-30 minuti ciascuno. Nota: La sonda può essere memorizzata nella Hyb + a-20 ° C e ri-utilizzata in un secondo momento.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta a 70 ° C in 1,5 mL di 2 x SSC per 15 min. lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 0,2 X SSC per 20-30 minuti ciascuno. Sostituisci 0.2 x SSC con 1,5 mL di reagente bloccante e incubare per una notte a 4 ° C. Nota: È possibile incubare reagente bloccante a RT per 4 h invece di pernottamento.</li>
</ol>4. anticorpo incubazione e acido maleico Buffer lavaggi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Sostituire il Reagente Bloccante con 0,2 mL di anti-DIG-POD nel Reagente Bloccante con un rapporto di 1:1,000 e incubare per 3 h in lamina o un'altra luce di blocco coperchio a TA. Nota: In alternativa, l'anticorpo può incubare overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo 3 h, lavare gli embrioni in 1,5 mL di tampone acido maleico 2 - 4 volte per 10-15 minuti ciascuno, a RT. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C in 1,5 mL di tampone fresco acido maleico. Nota: Non è necessario Incubare per una notte nel buffer di acido maleico, ma facendo così diminuisce la sonda sfondo.</li>
</ol>5. sonda di rilevamento e rimozione di perossidasi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Tampone acido maleico di rimuovere e sostituire con 1,5 mL di PBS 1X. Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di PBS 1X per 5 min a RT. Incubare embrioni in 0,2 mL di Cy3 fluorescente macchiatura soluzione per 60 minuti a TA. Nota: Il tempo di incubazione può variare per diverse sonde.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta con 1,5 mL della seguente percentuale MeOH in 1X PBS per 10 min a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubare gli embrioni con 1,5 mL di 1% H2O2 in MeOH per 30 min a RT. Wash gli embrioni una volta con 1,5 mL di MeOH seguenti soluzioni in 1X PBS per 10 min a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lavare gli embrioni due volte per 5 minuti ciascuno a RT in 1,5 mL di PBS 1X. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in PBS durante la notte a 4° C.</li>
</ol>6. immunofluorescenza
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni in 1,5 mL di acetone pre-refrigerati (conservato a-20 ° C) per 7 min a RT. lavare gli embrioni una volta in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni una volta in 1.5 mL di 1 x PBST con 1% DMSO (PBDT) per 5 minuti a TA.</li>
	<li>Incubare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 10% siero bovino fetale (FBS) su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere PBDT + FBS e sostituirli con 1,5 mL di anticorpi primari, anti-acetilato tubulina (prodotto da mouse) e anti-γ-tubulina (prodotto da coniglio), diluito insieme a 1: 400 in PBDT + 1% FBS. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C. Nota: Tempi di incubazione possono variare a seconda l'anticorpo primario. Test di diversi intervalli di tempo potrebbe essere necessario ottimizzare l'etichettatura.</li>
</ol>7. secondaria dell'anticorpo
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Per rimuovere l'eccesso anticorpo non legato da embrioni, lavare in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 1 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 5 volte in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 30 minuti ciascuno, su un rocker RT. lavare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS per 30 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C a 200 µ l di anticorpi secondari, Alexa 488 capra anti-topo IgG e Alexa 647 capra anti-coniglio IgG, diluito insieme a PBDT a 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI macchiatura
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni rapidamente a RT in 1,5 mL di PBDT due volte. Sostituire PBDT con 1,5 mL di DAPI, diluito 1:15000 in 1 X PBST e incubare per 15 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl tre volte a RT per 15-20 minuti ciascuno. Conservare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT a 4 ° C fino al momento di montare e immagine.</li>
</ol>9. montaggio e Imaging per Zebrafish Pronephros
<ol><li>Embrione laici laterale su vetrino in un piccolo volume, circa 10 µ l, di PBDT.</li>
	<li>Spremere l'embrione dietro gli occhi con una coppia di una pinzetta per rimuovere la testina e alcuni della palla tuorlo.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per raschiare delicatamente la palla di tuorlo rimanente dal corpo dell'embrione. Rimuovere il tuorlo dissociata e liquido supplementare dal vetrino con un tessuto sottile.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di montaggio supporto alla coda rimanente dell'embrione e posizionare in modo che la coda è disposto lateralmente. Porre un coprivetrino in cima alla coda per appiattire il campione, quindi inserire in una casella di scivolo coperto.</li>
	<li>Ciglia di rene a 60 ingrandimenti su un microscopio confocale utilizzando i seguenti canali di immagine: DAPI in blu (set presso 408,0 laser nm), FITC in verde (set presso 488.0 laser nm), Cy3 tingere-contrassegnati in rosso (set alle 561.0 laser nm) e Alexa 680 in bianco (set a 637.0 laser nm).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per l'etichettatura MCCs in pronephros con odf3b trascrizioni e α-tubulina in embrioni di zebrafish 24 hpf. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di utilizzare embrioni appena fissi e preparati. Gli embrioni che sono stati corretti e immagazzinati in MeOH o IBRID + a-20 ° C per più di una settimana possono essere utilizzati, ma la probabilità di sfondo indesiderati macchiatura aumenta con il tempo che gli embrioni sono conservati in deposito.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi di questa tecnica sono necessarie per adattare questo metodo per altre suite di particolari marcatori, ad es. altri riboprobes antisenso e altri anticorpi. Molti metodi per regolare i parametri delle fasi del processo intero supporto ibridazione in situ sono stati documentati in precedenza dal nostro gruppo ed altri31,34,36,38, 39. Allo stesso modo, ogni anticorpo proteina richiederà alcuni risoluzione dei problemi in termini di tempi di trattamento, e approssimative gamme di diluizioni e tempi di incubazione per ogni anticorpo primario migliori sono stimate dalla valutazione di risultati documentati28, 35. per gli embrioni di età inferiore ai 24 hpf, pK trattamento dovrebbe essere inferiore a 2 min, dove oltre 24 anni di embrioni hpf devono essere trattati con pK per più di 2 min. Inoltre, gli embrioni oltre 24 hpf dovrebbe essere sbiancato di pigmento prima del trattamento di pK.
Dopo colorazione con la soluzione colorante fluorescente, è fondamentale per rimuovere qualsiasi restante macchia, anticorpo e perossidasi eseguendo la serie di lavaggi di metanolo e perossido di idrogeno. I lavaggi di PBS immediatamente successivi sono vitali per rimuovere il metanolo in eccesso da embrioni. Importante, prima di procedere con gli anticorpi se, abbiamo trovato che l'acetone e risciacqui con acqua deionizzata rendono gli embrioni meno tendono ad aderire l'un l'altro e/o le provette da centrifuga. Nella nostra esperienza, gli anticorpi per specifici fattori di trascrizione e di altri geni, anche se potrebbero funzionare in modo efficiente macchie occidentali, non funzionano bene per se in zebrafish. Tuttavia, proteine altamente conservate e abbondanti, come α-tubulina e β-catenina, funzionano bene in zebrafish per se16,37.
Con il pesce, è possibile visualizzare trascrizioni del RNA dei geni che non hanno ancora gli anticorpi specifici in zebrafish. Combinando il pesce con se, come dimostrato dal presente protocollo, co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine può essere visto in vivo (Figura 2). La natura flessibile del protocollo consente la rapida risoluzione dei problemi per la visualizzazione dei vari trascritti di RNA e proteine in numerosi tessuti e intervalli di tempo. Quando combinato con i tratti già rispettati di embrioni di zebrafish, questo protocollo di pesce + se fornisce un altro strumento per esplorare l'espressione di geni e proteine importanti per via dello sviluppo.

Nel corso degli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un organismo il primo modello per studiare biologia inerente allo sviluppo. Gli embrioni si sviluppano di fuori della madre e sono otticamente trasparenti. Inoltre, la formazione di organi vitali come l'occhio, il rene e il proencefalo si verifica rapidamente, con strutture formate da solo 24 h post fertilizzazione (hpf). D'importanza, il genoma di zebrafish è altamente conservato con mammiferi1,2,3. Inoltre, zebrafish e organi mammiferi hanno simili anatomia e fisiologia. Il rene embrionale di zebrafish, o pronephros, dimostra il valore del sistema modello per l'esame di funzione del gene durante primi nefrogenesi e determinazione di destino delle popolazioni di cellule epiteliali conservata del nefrone vertebrati4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. allo stesso modo, l'embrione di zebrafish è diventato sempre più importante nell'esaminare l'ontogenesi di MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Come suggerisce il loro nome, MCCs sono cellule epiteliali, caratterizzate da un fascio di ciglia mobili situato sulla superficie apicale17. In zebrafish, MCCs funzionare in flusso di fluido e sono disperse in un "sale e pepe" come la moda in tutta la metà di ogni nefrone dei pronephros da 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. anche se essi sono stati notati solo in una manciata di rene umano malattia casi18,19,20,21, MCCs sono prevalenti in altri tessuti di mammiferi come il cervello e trachea22,23,24, che pone una serie di sfide per il disegno sperimentale. Elegante in vari modelli vertebrati compreso zebrafish hanno dimostrato una via conservata del destino MCC, con la tacca via di segnalazione come inibitore di MCC sviluppo12,17,25 ,26,27. Di conseguenza, i pronephros zebrafish fornisce un modello facilmente accessibile per studiare i meccanismi genetici di MCC sviluppo in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Trasparenza e facile manipolazione genetica degli embrioni di zebrafish hanno dimostrato di essere tratti inestimabile quando si studia le vie genetiche e molecolari che regolano il destino delle cellule, la crescita dei tessuti e lo sviluppo del primo embrione1,2 ,3. Come tali, tecniche tradizionali per visualizzare trascrizioni del gene e della proteina, quali ibridazione in situ e intero monte se, sono stati applicati a e ottimizzato per il Danio rerio16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando i più diffusi protocolli per pesce e se, è possibile aggiungere etichette e analizzare MCCs in vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>soluzione di miscela di proteasi non specifica</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronasi da Streptomyces griseus</td><td>Diluire in E3 <forte>senza</forte> blu di metilene per ottenere una soluzione madre da 50 mg/mL; conservare a -20 gradi Diluire</td></tr><tr><td>50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in acqua distillata) in acqua distillata; aggiungere 1 x 10-5 M blu di metilene (sigma M9140) per inibire la contaminazione</td><td></td> tricaina (etil 3-amminobenzoato metansulfonato)Fluka A5040-250G Per ottenere una soluzione madre allo 0,2%, sciogliere 1 g di polvere di tricaina in 10 mL di Tris,<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> pH 9,5 e acqua distillata fino a 500 mL</td></tr><tr><td>piastre per embrioni</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>fiale di vetro da 5 mL</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>plastica monouso Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>19210</td><td>Sciogliere il 4% di PFA in 1X PBS e portare a ebollizione sotto una cappa aspirante. Raffreddare e aliquotare, quindi conservare a -20°C. Non ricongelare una volta scongelato per l'uso.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Diluire in acqua distillata per ottenere un stock</td></tr><tr><td>Tween-20</td> 1X American <td>Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Produrre un stock Tween-20 allo 0,1% diluendo in acqua distillata.</td></tr><tr><td>1X soluzione salina tamponata con fosfato con 0,1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0,1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>metanolo (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Sciogliere in acqua distillata per ottenere un brodo da 10 mg/mL; aliquotare e conservare a -20°; C</td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga a fondo piatto</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formammide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>conservare a -20&deg; </td></tr><tr><td>Soluzione di ibridazione C (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formammide, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/mL di lievito torula RNA, 50 &mu; g/&mu; L. eparina; Negozio a -20&deg; </td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td> C <td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone citrato di sodio salino (SSC) 20X</td> American <td>Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>diluire in acqua distillata per ottenere 2X e 0,2X stock</td></tr><tr><td>di soluzione di reagente</td><td>bloccante Roche</td><td>11096176001</td><td>diluire in tampone di acido maleico per ottenere una soluzione stock al 10%; conservare a 4 gradi; Soluzione</td></tr><tr><td>tampone acido maleico</td> C <td>Sigma</td><td>M0375 e S7653</td><td>150mM acido maleico, 100mM NaCl (pH 7,5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenina-POD, Fab frammenti</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Cy3 soluzione colorante fluorescente</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, negozio di sistemi TSA Plus Cyanin3</td><td>a 4 gradi C; preparare la soluzione colorante fresca effettuando una diluizione 1:50 del reagente TSA (disciolto in 60 uL di DMSO) nel tampone del kit</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>conservare a 4&deg; </td></tr><tr><td>Acqua distillata di grado molecolare C (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>conservare un'aliquota a -20&deg; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquotare e conservare a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>clone monoclonale di tubulina anti-acetilata 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquota e conservare a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>anti-gamma;-tubulina anitbody prodotto in</td> aliquota di coniglio <td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>e conservato a -20&deg; C</td></tr><tr><td>odf3b clone di cDNA MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMMAGINE:6792478</td><td>immagazzinare lo stock di glicerolo batterico a -80&deg; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Farina Alexa 647 capra anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>negozio a 4 gradi; C; proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 capra anti-topo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>negozio a 4&deg; C; proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquotare e conservare a -20&deg; C</td></tr><tr><td>vetrino in vetro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>pinze fini</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzette Modello #55</td></tr><tr><td>supporti di montaggio</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, negozio Aqua-Poly/Mount</td><td>a 4 gradi; Microscopio</td></tr><tr><td>confocale C e software</td><td></td><td></td> associato <td>Utilizziamo un microscopio confocale Nikon C2plus con rocker software AR NIS-elements</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di cellule multiciliated in zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta monte fluorescente ibridazione in situ e immunofluorescenza

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Negli ultimi anni, l'embrione di zebrafish è emerso come un modello popolare per studiare biologia inerente allo sviluppo a causa di caratteristiche quali la ex utero lo sviluppo dell'embrione e trasparenza ottica. In particolare, l'embrione di zebrafish è diventato un organismo importante per studiare l'organogenesi renale vertebrati, nonché lo sviluppo delle cellule multiciliated (MCC). Per visualizzare MCCs nel rene embrionale zebrafish, abbiamo sviluppato un protocollo combinato di ibridazione del intero-supporto fluorescente in situ (FISH) e montare tutto immunofluorescenza (IF) che permette l'imaging ad alta risoluzione. Questo manoscritto descrive la nostra tecnica per la co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine come strumento per comprendere meglio la regolamentazione dei programmi di sviluppo attraverso l'espressione di vari fattori di lignaggio.

Embrioni di zebrafish di selvaggio-tipo sono stati fissati alle 24 hpf e immediatamente preparato come descritto sopra. Figura 1 illustra un flusso di lavoro sperimentale, insieme ad alcune fasi illustrate. Il flusso di lavoro descritto nei passaggi 1-8 comprende i processi di approvvigionamento campione, fissazione e la manipolazione del tessuto fisso per etichettare le trascrizioni endogene con riboprobes antisenso seguita dall'immunofluorescenza per etichetta proteina di interesse. Passaggio 9 del flusso di lavoro si riferisce specificatamente progettati per ottimizzare la visualizzazione del tronco embrionali zebrafish tecniche di imaging ed il montaggio. Nei disegni che accompagnano il passaggio 9, illustriamo il metodo di manipolazione per il posizionamento del tessuto su un vetrino. In questo passaggio, la palla di testa e tuorlo di embrione vengono rimossi, lasciando la coda per essere posizionato lateralmente tra una lastra di vetro e il vetrino coprioggetti. Rimozione della sfera di tuorlo e la testa è suggerito per la migliore immagine della popolazione residente MCC in pronephros, come la palla di tuorlo reagisce in auto e ostacola il processo di montaggio.
Immagini rappresentative ottenute utilizzando un microscopio confocale sono fornite in Figura 2, che mostra l'embrione stesso di selvaggio-tipo a 60x e uno zoom digitale allo stesso ingrandimento. I pannelli superiori forniscono immagini di ogni singolo canale, mentre i due pannelli di fondo sono la sovrapposizione composita di questi dati di imaging. La scatola bianca (nell'immagine colonna sinistra) delinea l'area che è al centro dello zoom digitale (l'immagine della colonna di destra). Evidenziata nel riquadro finale dello zoom digitale, i nuclei sono stati etichettati in DAPI e MCCs sono stati rilevati basato su un ribosonde antisenso progettato per riconoscere odf3b, dove gli anticorpi a γ-tubulina denotano i corpi basali e α-tubulina denota le ciglia. Nello zoom digitale della sovrapposizione composito, il cerchio con tratteggio giallo indica il perimetro di un MCC, che è stato identificato dovuto il possesso di odf3b trascrizioni, più corpi basali e ciglia. La cella adiacente mono-ciliated, etichettata con un cerchio giallo punteggiato, è stata identificata basata sul fenotipo di possedere un singolo corpo basale e un singolo Cilio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: schema di diagramma di flusso sperimentale. Questo diagramma di flusso Mostra un flusso di lavoro sperimentale, corredato da illustrazioni di fasi critiche in cui il fiocco di neve indica freddo incubazione, le tre linee curve rappresentano il calore e l'orologio rappresenta tempi lunghi di incubazione. Il flusso di lavoro possa essere eseguito in un minimo di 6 giorni (Vedi il numero del giorno nell'angolo superiore destro di ogni fase del processo), tuttavia alcuni passaggi possono essere eseguiti su più lunghi periodi di tempo, come indicato nel protocollo. Una rappresentazione dettagliata del processo di montaggio è tirata fuori, dimostrando la coda finale dell'embrione montato tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Una casella tratteggiata nera delinea l'area che è imaged 60 ingrandimenti. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante risultati per la visualizzazione di MCCs dei pronephros zebrafish. Proiezioni di massima dell'immagine di un embrione di zebrafish di selvaggio-tipo hpf 24 a 60 X ingrandimento, come pure uno zoom digitale sul confocale a 60 ingrandimenti dell'embrione stesso. Le caselle bianche indicano l'area incentrata su per lo zoom. Le macchie individuali di DAPI (nuclei), odf3b (MCCs), γ-tubulina (corpi basali) e α-tubulina (ciglia) sono etichettate e quindi fuse insieme nei pannelli di fondo due. Lo zoom digitale, forniamo approssimazioni delle posizioni delle cellule come segue: un MCC è delineato dal cerchio con tratteggio giallo, e il cerchio giallo punteggiato delinea una cella mono-ciliati. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è etichettare e visualizzare in situ le cellule multiciliare del pesce zebra. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali fattori regolano i multiciliati nei reni embrionali del pesce zebra? Il principale vantaggio di questa tecnica è che sia le proteine che i trascritti di RNA possono essere etichettati contemporaneamente, il che risulta utile in assenza di anticorpi specifici per il pesce zebra.L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo cercato di etichettare le cellule multiciate nel pronefro, analizzando la presenza di ciglia dopo aver apportato modifiche all'embrione. Iniziare fissando gli embrioni di pesce zebra a 24 ore post-fecondazione in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% per due-quattro ore a temperatura ambiente senza agitazione. Successivamente, lavare gli embrioni due volte in PBS con Tween 20 allo 0,1% o PBST, seguito da un lavaggio con cinque millilitri di metanolo al 100%.Quindi, incubare gli embrioni in cinque millilitri di etanolo fresco al 100% per almeno 20 minuti a meno 20 gradi Celsius. Per preparare gli embrioni per l'ibridazione, reidratare i nati in cinque millilitri di metanolo al 50% e PBST per cinque minuti, seguiti da cinque minuti in cinque millilitri di metanolo al 30% e PBST. Lavare gli embrioni due volte per cinque minuti ciascuna in cinque millilitri di PBST e incubare gli embrioni in cinque millilitri di una soluzione di proteinasi K e PBST in rapporto uno a 1.000 per due minuti, immediatamente seguiti da altri due lavaggi in cinque millilitri di PBST.Fissare gli embrioni in cinque millilitri di paraformaldeide al 4% per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi in cinque millilitri di PBST 20. Per facilitare le interazioni tra gli embrioni e la soluzione di ibridazione, trasferire gli embrioni in cinque millilitri di PBST in provette microcentrifuga con fondo piatto posizionate verticalmente su un rack per microcentrifuga e lavare gli embrioni due volte per cinque minuti ciascuno in 1,5 millilitri di soluzione di ibridazione. Dopo il secondo lavaggio, incubare gli embrioni in 1,5 millilitri di soluzione di ibridazione fresca a 70 gradi Celsius in un forno di ibridazione per quattro-sei ore.Quindi, sostituire la soluzione di ibridazione con 10 microlitri di sonda RNA di interesse e 500 microlitri di soluzione di ibridazione per un'ibridazione notturna a 70 gradi Celsius. La mattina successiva, lavare gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di formammide al 50% e tampone salino-citrato di sodio 2X o SSC per 20-30 minuti per ogni lavaggio a 70 gradi Celsius. Successivamente, lavare gli embrioni una volta in 1,5 millilitro di 2X SSC da solo a 70 gradi Celsius per 15 minuti, seguito da due lavaggi in 1,5 millilitri di 0,2X SSC a 70 gradi Celsius per 20-30 minuti per ogni lavaggio.Dopo il secondo lavaggio, sostituire l'SSC 0,2X con 1,5 millilitri di reagente bloccante per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, sostituire il reagente bloccante con 0,2 millilitri di anti-digossina in perossidasi di rafano e reagente bloccante in un rapporto di uno a 1.000 per un'incubazione di tre ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi, lavare gli embrioni da due a quattro volte in 1,5 millilitri di tampone acido malico per 10-15 minuti per ogni lavaggio, seguiti da un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius in 1,5 millilitri di tampone acido malico fresco.La mattina seguente, sostituire il tampone acido malico con 1,5 millilitri di PBS e lavare gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di PBS per cinque minuti per ogni lavaggio. Incubare gli embrioni in 0,2 millilitri di soluzione fluorescente Si3 per 60 minuti, seguita da quattro lavaggi consecutivi di 10 minuti ciascuno in 1,5 millilitri di concentrazioni crescenti di metanolo. Dopo l'ultima incubazione, incubare gli embrioni a temperatura ambiente in 1,5 millilitri di perossido di idrogeno al 1% in metanolo per 30 minuti.Quindi, lavare gli embrioni per 10 minuti per ogni lavaggio in soluzioni di metanolo discendenti da 1,5 millilitri, seguiti da due lavaggi di cinque minuti ciascuno in 1,5 millilitri di PBS. Successivamente, lavare gli embrioni in 1,5 millilitri di acqua bidistillata per cinque minuti, seguito da un lavaggio di sette minuti in 1,5 millilitri di acetone a meno 20 gradi Celsius. Lavare gli embrioni in altri 1,5 millilitri di acqua bidistillata per cinque minuti, seguiti da un lavaggio di cinque minuti in 1,5 millilitri di PBST con 1% DMSO o PBDT.Incubare gli embrioni a temperatura ambiente in 1,5 millilitri di PBDT con FBS al 10% su un agitatore per due ore. Successivamente, sostituire il PBDT e l'FBS con 1,5 millilitri degli anticorpi primari per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare gli embrioni in 1,5 millilitri di PBDT, FBS e cloruro di sodio 0,1 molare per un minuto con agitazione, seguito da cinque lavaggi di 30 minuti ciascuno con agitazione in 1,5 millilitri di PBDT, FBS e cloruro di sodio.Dopo l'ultimo lavaggio, lavare gli embrioni una volta in 1,5 millilitri di PBDT con FBS soltanto, per 30 minuti con movimento oscillatorio, seguito da un'incubazione notturna in 200 microlitri degli opportuni anticorpi secondari a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. La mattina successiva, lavare rapidamente gli embrioni due volte in 1,5 millilitri di PBDT, seguiti da un'incubazione di 15 minuti in 1,5 millilitri di DAPI su un agitatore rotante. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte in 1,5 millilitri di PBDT con FBS e cloruro di sodio, per 15-20 minuti per ogni lavaggio, e conservare gli embrioni in 1,5 millilitri di PBDT a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce ambiente.Per ottenere un'immagine dei reni del pesce zebra, posizionare i blastocisti lateralmente su vetrini in circa 10 microlitri di PBDT. Utilizzando un paio di pinzette fini e un microscopio stereoscopico, schiacciare delicatamente il primo blastocisti dietro gli occhi per rimuovere la testa e parte della sfera del tuorlo. Successivamente, rimuovere con delicatezza la restante sfera del tuorlo dal corpo del blastocisti.Quando si rimuove la sfera del tuorlo, fare attenzione a non toccare l'estensione del sacco vitellino poiché il tessuto di interesse si lacera facilmente ed è situato direttamente al di sopra dell'estensione. Utilizzare un tessuto sottile per rimuovere il tuorlo dissociato e il liquido in eccesso dal vetrino. Successivamente, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alla coda rimanente e posizionare la coda in posizione laterale.Appiattire la coda con un coprioggetto e posizionare il vetrino in una scatola per vetrini coperta. Successivamente, utilizzare l'obiettivo 60X su un microscopio confocale per acquisire immagini delle ciglia renali sui canali fluorescenti appropriati. Nelle seguenti immagini rappresentative di un embrione di pesce zebra colorato come appena descritto, le cellule multiciliari possono essere identificate in base alla visualizzazione della sonda riboprobe antisenso utilizzata per riconoscere l'espressione del trascritto ODF3B, ai corpi basali marcati con tubulina gametica e alle ciglia marcate con tubulina alfa acetilata.In effetti, a questo ingrandimento del pronefro embrionale, è possibile osservare una cellula multici liata con trascritti di ODF3B, numerosi corpi basali e ciglia. La cellula monociliata adiacente può essere distinta per il suo singolo corpo basale e il fenotipo con un'unica ciglio. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare embrioni appena fissati e di proteggere i campioni dalla luce ambiente a partire dall'aggiunta del primo anticorpo.

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In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

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Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

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Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

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Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

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