Eterotipica tridimensionale In Vitro di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare modelli tridimensionali tipici dello sviluppo del cancro ovarico in fase iniziale. In primo luogo, generare linee cellulari immortalizzate di H turt derivate da tessuti primari, normali epiteliali ovarici e fibroblasti. Quindi, per ricreare l'architettura in vivo e le complesse interazioni cellulari presenti nella co-coltura ovarica, le linee cellulari epiteliali e stromali in modelli tridimensionali di sferoidi S procedono a fissare e colorare le colture di organoidi e ad analizzare l'espressione di specifici marcatori al fine di studiare le caratteristiche molecolari delle interazioni epiteliali stromali.

I risultati ottenuti mostrano come le alterazioni nel compartimento delle cellule stromali dei modelli 3D tipici possano influenzare il fenotipo delle cellule epiteliali co-coltivate. I modelli tridimensionali tipici possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro ovarico, come esplorare le origini di questa malattia e chiarire il ruolo del microambiente stromale nell'inizio e nello sviluppo del tumore. Le applicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi e alla terapia delle malattie rispetto ad altri metodi di coltura 3D.

Questa tecnica può essere applicata a una gamma più ampia di volumi di colture cellulari e applicazioni a valle. Ad esempio, le colture omo e tipiche 3D possono essere utilizzate per i test antidroga in vitro. Questo approccio può essere applicato anche ad altri sistemi modello, come nello studio di altri tipi di tumori solidi o nella malattia benigna.

Trasporta il tessuto ovarico fresco al laboratorio di coltura cellulare in un normale terreno di crescita dei fibroblasti ovarici immortalizzato integrato con antibiotici e buffonate extra. Lavare il campione tre volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere eventuali cellule epiteliali che rimangono attaccate al tessuto. Successivamente, trasferire il campione e il PBS in una piastra di coltura P 100 pulita Utilizzando strumenti sterili, trasferire il tessuto in una seconda piastra di coltura pulita P 100 asciutta.

Tagliare il fazzoletto in pezzi di 0,5 centimetri quadrati e trasferire ogni pezzo in un piatto separato per P 100. Continuare a tagliare il fazzoletto in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro quadrato. Quindi aggiungere 20 millilitri di terreno INOF GM e monitorare la coltura per la crescita cellulare utilizzando la microscopia di fase.

Verificare che le cellule aderiscano al piatto entro 24 ore. Monitorare la crescita cellulare utilizzando la microscopia di fase Le cellule di solito aderiscono alla piastra entro 24 ore dopo una settimana. Rimuovere il tessuto non aderente mediante aspirazione, rifornire il terreno e successivamente rialimentare le colture due volte a settimana entro una o tre settimane quando le colonie cellulari hanno una dimensione di circa 500 micron.

Isolare i cloni utilizzando trip e dischi di clonazione rivestiti. Al fine di confermare il 100% delle cellule fibroblastiche. Placcare un campione della linea cellulare su vetrini di copertura ed eseguire la colorazione immunofluorescente per un marcatore fibroblastico, un marcatore epiteliale e un marcatore di cellule endoteliali.

Un giorno prima della trasduzione retrovirale del passaggio di H Turt, la cellula dei fibroblasti ovarici normali si isola da una singola piastra di P 100 in tre piastre di P 100. Il sup natana virale preconfezionato può essere acquistato o prodotto internamente utilizzando protocolli standard per la trasfezione in culla di cellule HEC 2 9 3 T. Per preparare la soluzione di poliema, pesare 1,5 grammi di poliema e metterla in un flacone sterile.

Aggiungere 95 millilitri di biologia molecolare, di etanolo, assoluto e cinque millilitri di acqua distillata per colture cellulari. Mettere la soluzione di poli Hema a bagnomaria a 65 gradi Celsius fino a completa dissoluzione. Rivestire le piastre di coltura tissutale con una soluzione di poly Hema appena preparata.

Asciugare all'aria le piastre di coltura cellulare all'interno della cappa a flusso laminare. L'oscillazione delicata su una piattaforma a dondolo può essere utilizzata per garantire un rivestimento uniforme di piatti o fiasche di dimensioni maggiori. Se la soluzione di polio si asciuga troppo rapidamente, la superficie non sarà liscia.

Se lo si desidera, pretrattare i fibroblasti prima della coltura 3D, ad esempio, per l'induzione della senescenza, pretrattare le cellule con dosi subletali di perossido di idrogeno. Recuperare ed espandere l'INOF e le colture cellulari epiteliali in vitro per preparare un numero sufficiente di cellule per la creazione di steroidi eterotopici 3D. Dopo un lavaggio PBS di cinque minuti, aggiungere 15 millilitri di terreno alla piastra in poly hema.

Nel frattempo, aggiungere la tripsina alle cellule normali dei fibroblasti ovarici immortalizzati per staccarle dal piatto di coltura. Dopo tre-cinque minuti, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di terreno di coltura e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in un terreno da cinque millilitri e mescolare bene pipettando su e giù o agitando delicatamente.

Quindi utilizzare un campione da 10 microlitri per enumerare le cellule vitali utilizzando il trian blue. Ora aggiungete 4 milioni di cellule INOF al terreno già erogato nella piastra rivestita in poliema. Portare il volume del terreno di coltura a 20 millilitri e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.

Monitorare l'aggregazione cellulare in steroidi multicellulari mediante microscopia di fase per rialimentare le colture di sferoidi S ogni due o tre giorni. Appoggiare le piastre inclinate su una pipetta. Lasciare depositare gli sferoidi e rimuovere con cura circa 16 millilitri del terreno esausto con una pipetta da cinque millilitri.

Aggiungere 16 millilitri di terreno fresco alla coltura e tornare all'incubatrice Il settimo giorno. Creare colture eterotipiche aggiungendo cellule epiteliali ai fibroblasti phe. In primo luogo, preparare le sospensioni delle cellule epiteliali ovariche mediante tripsina come descritto in precedenza dopo aver enumerato le cellule.

Lavare una volta nel terreno INOF GM per evitare che i fattori di crescita vengano trasportati dal terreno di crescita epiteliale. Dopo aver reintegrato il terreno delle colture OID di fibroblasti, aggiungere le cellule epiteliali con un rapporto di quattro a uno fibroblasti alla coltura di cellule epiteliali. Gli OID eterotopici in INOF GM rialimentano le colture tipiche ogni due o tre giorni per altri 14 giorni.

Per l'immunoistochimica, fissare il PHE con formina tamponata neutra, pellettare il PHE e sostituire la formalina con etanolo al 70%. Procedere alla trasformazione in paraffina utilizzando i protocolli standard utilizzati per i tessuti umani. Gli steroidi inclusi in paraffina possono essere sezionati e colorati con h ed e di specifici marcatori molecolari utilizzando la chimica immunolistica.

In alternativa, lavare gli steroidi in PBS e fissarli al 4% in para formaldeide. Quindi incorporare i campioni nel terreno OCT e congelarli a scatto per il sezionamento del criostato e la colorazione immunofluorescente per l'analisi mediante citometria a flusso. Lavare gli steroidi in PBS e dissociare mediante digestione tripsina o Accutane a 37 gradi Celsius.

La dissociazione completa degli steroidi in una sospensione di una singola cellula può essere promossa pipettando la soluzione su e giù con un puntale per pipetta da un millilitro. Fare attenzione a non sovradimensionare le cellule, neutralizzare la reazione con un volume uguale di terreno di coltura e rimuovere i grumi cellulari facendo passare la sospensione attraverso un colino cellulare da 40 a 70 micron. Quindi pellettare le cellule e lavarle con PBS ed enumerare, risospendere il numero desiderato di cellule in infatti tamponare e colorare secondo le istruzioni del produttore Nel nostro laboratorio, abbiamo parzialmente trasformato le cellule epiteliali ovariche e co-coltivato queste cellule con fibroblasti ovarici normali e senescenti per imitare lo sviluppo del cancro ovarico in fase iniziale.

In un'ovaia in premenopausa La colorazione immunofluorescente dei fibroblasti ovarici normali immortalizzati mostra che sia i fibroblasti ovarici normali primari che i fibroblasti ovarici normali immortalizzati esprimono la proteina specifica dei fibroblasti, ma non esprimono citocheratina sette ed esprimono mentone. Le cellule normali dei fibroblasti ovarici coltivate da sole in forma 3D PHE mostrano una morfologia fusa e un'abbondante matrice extracellulare. Qui, i fibroblasti ovarici normali sono stati esposti al perossido di idrogeno per indurre la senescenza per sette giorni e poi coltivati con cellule epiteliali ovariche parzialmente trasformate per 14 giorni.

Per distinguere i due tipi di cellule, gli steroidi risultanti sono stati immunocolorati per mim uno come marcatore di proliferazione e pan citocheratina come marcatore epiteliale. La quantificazione dei dati suggerisce che il microambiente di invecchiamento promuove le caratteristiche neoplastiche delle cellule epiteliali parzialmente trasformate, mentre un microambiente normale inibisce la progressione neoplastica, le caratteristiche istologiche delle cellule normali e maligne che non sono rilevabili quando le cellule vengono coltivate come monostrati vengono ripristinati. Quando le cellule vengono trasformate in coltura sferoide, ad esempio, le caratteristiche istologiche dei tumori ovarici a cellule chiare possono essere rilevate in colture 3D di linee cellulari di carcinoma ovarico a cellule chiare, ma non in colture monostrato delle stesse cellule.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare colture tipiche tridimensionali con cui studiare le interazioni tra cellule epiteliali e stromali. Durante la genesi precoce del tumore. Quando si imposta una coltura 3D, è importante regolare il numero di cellule in base all'applicazione a valle, consentendo una certa perdita di materiale durante la lavorazione.

Una volta padroneggiate, le colture 3D possono essere configurate in un'ora seguendo questa procedura. Altri metodi, come la citometria a flusso, combinata con la profilazione dei microraggi di espressione genica, possono essere eseguiti per analizzare i cambiamenti globali dell'espressione genica che si verificano nelle colture tipiche 3D, ma che non vengono rilevati in condizioni di coltura monostrato. Ciò consentirà la dissezione delle vie di segnalazione bidirezionali che si verificano specificamente in una coltura di base 3D. Microambiente.