Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'adesione cellulare. Ciò si ottiene rivestendo prima una micropiastra a 96 pozzetti con molecole di adesione nella seconda fase. Le cellule T umane primarie vengono isolate dal sangue e marcate con CFSE.

Successivamente, le cellule T vengono stimolate con trattamenti per influenzarne l'adesività. Nella fase finale, le cellule trattate vengono aggiunte alla micropiastra e si lascia che si verifichi l'adesione. In definitiva, la quantità di fluorescenza per pozzetto può essere misurata per determinare la percentuale di cellule aderenti per condizione di trattamento.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'aggiunta di cellule T al modello e all'anterio, è che non è richiesta la co-coltura di cellule T e cellule erl. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, ad esempio in che modo farmaci specifici influenzano l'adesione dei linfociti? Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia del piede in linea, può essere applicato anche ad altre cellule di maie come i neutrofili.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi sono difficili da padroneggiare e richiedono precisione e abilità Per codificare una micropiastra con le molecole di adesione, iniziare lavando 24 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti con 50 microlitri di soluzione di lavaggio, quindi incubare ogni pozzetto tranne i pozzetti di controllo non rivestiti con 50 microlitri di soluzione di rivestimento per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare delicatamente la soluzione di rivestimento senza lasciare che la punta della pipetta tocchi il fondo dei pozzetti. Quindi, dopo aver lavato i pozzetti con altri 50 microlitri di soluzione di lavaggio, incubare la micropiastra con 50 microlitri di soluzione di adesione per pozzetto.

Di nuovo, a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora, aspirare delicatamente la soluzione di adesione e lavare nuovamente i pozzetti con 50 microlitri di soluzione di lavaggio Per isolare le cellule T, prima mescolare accuratamente 50 microlitri di cocktail di arricchimento di cellule T umane per ogni millilitro di sangue intero, quindi incubare il sangue trattato per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere sei millilitri di sangue trattato e un volume uguale di PBS privo di calcio e magnesio arricchito con glucosio all'1% D in una provetta conica da 50 millilitri a temperatura ambiente e mescolare delicatamente la soluzione.

Quindi aggiungere 15 millilitri di linfopreparazione a una nuova provetta conica da 50 millilitri e sovrapporre accuratamente il campione di sangue diluito sul terreno di isolamento dei linfociti. Separare gli strati cellulari per 20 minuti a 400 volte G e 20 gradi Celsius con la rottura. Quindi utilizzare una pipetta per pasta fresca per rimuovere lo strato superiore, lasciando indisturbato lo strato linfocitario all'interfaccia.

Trasferire lo strato di linfociti in una nuova provetta conica con una nuova pipetta di Pester. Aggiungere nove millilitri di PBS ai linfociti e poi distribuire uniformemente le cellule in tutta la sospensione aspirandole delicatamente verso l'interno e verso l'esterno. Centrifugare le celle e quindi risospendere il pellet nel terreno.

Quindi erogare le cellule in un pallone di coltura T 75. 20 millilitri di terreno di coltura per stimolare le cellule dopo il periodo di coltura appropriato. Innanzitutto, aggiungere il terreno privo di siero a 2,4 volte 10 alle sei cellule T, quindi affamare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius.

Dopo due ore, far girare le celle e risospendere il pellet. In un millilitro di PBS, etichettare le cellule con un marcatore fluorescente al buio per otto minuti a temperatura ambiente, quindi interrompere la reazione aggiungendo 10 millilitri di PBS a 37 gradi Celsius. Quindi, dopo aver fatto girare le celle, risospendere il pellet in 1,2 millilitri di soluzione di adesione preriscaldata.

Riscaldare la micropiastra rivestita a 37 gradi Celsius, quindi dividere le celle in otto aliquote da 150 microlitri in 1,5. Le provette da millilitri stimolano una provetta con PMA a 10 nanogrammi per millilitro per fungere da controllo positivo. Lasciare tre tubi non trattati per servire il controllo per la stimolazione, il controllo del carico non lavato e il controllo per ICAM un rivestimento e stimolare quattro tubi con diverse concentrazioni di anticorpi anti CD.

Quindi aliquotare immediatamente 50 microlitri di una volta per 10 fino alla quinta cellula per pozzetto delle miscele cellulari stimolate negli appositi pozzetti della micropiastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Per determinare prima la percentuale di cellule aderenti, lavare ogni pozzetto con 150 microlitri di soluzione di adesione calda. Agitare delicatamente la piastra per alcuni secondi, quindi aspirare con cura il terreno da ciascun pozzetto senza toccare il fondo dei pozzetti con i puntali della pipetta.

Ripetere il lavaggio tre volte, cambiando l'angolazione della pipetta ad ogni aspirazione. Quindi accendi il lettore di lastre e apri il software di lettura delle lastre nel menu delle attività. Fare clic su nuovo per impostare un nuovo protocollo.

Quindi, nel menu delle azioni, seleziona l'opzione di lettura. Fare clic su intensità fluorescente e fare clic su OK. Immettere la lunghezza d'onda di eccitazione come 485 e la lunghezza d'onda di emissione come 528.

Quindi, nel menu delle opzioni ottiche, selezionare la parte inferiore e fare clic su Va bene. Quindi torna al menu delle azioni e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius e fai clic su OK. Infine caricare la micropiastra e fare clic su Esegui.

Dopo aver esportato i risultati in un foglio di calcolo, utilizzare la formula per calcolare la percentuale di celle di aderenza in queste immagini. Viene mostrato un esempio di un test di adesione che utilizza cellule T primarie, stimolate con varie concentrazioni di anticorpi anti CD tre. Le cellule non stimolate fungono da controllo negativo.

Le cellule trattate con PMA fungono da controllo positivo Per i tre anticorpi anti CD, la tabella mostra le intensità di fluorescenza relative di CFSE. Cellule T primarie marcate stimolate con diverse dosi di anticorpi solubili anti CD tre e piastrate su pozzetti rivestiti IAM one. Per ogni condizione, l'intensità media dei pozzetti triplicati può essere calcolata e convertita nella percentuale relativa sul totale delle celle caricate.

In un tipico esperimento, la percentuale di cellule aderenti trattate con PMA è compresa tra il 40 e il 50%, mentre la percentuale di cellule non stimolate è compresa tra il 5 e il 10%Si noti che la percentuale di cellule aderenti aumenta all'aumentare della concentrazione di anticorpi anti CD tre utilizzati per la stimolazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di misurare la fluorescenza di un pozzetto non lavato per determinare l'input di fluorescenza.

Un valore critico nell'analisi dei dati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare l'adesione cellulare statica. Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti.