Name: Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri un metodo rapido per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare utilizzando frammenti di ectodominio. Questa tecnica semplificata utilizza perline magnetiche funzionalizzate per saggi di aggregazione.

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Questo lavoro è stato supportato da un premio NSF/ARRA (IOS 0920357) e da un premio dal NIH (5R21MH098463).

1 Cella di preparazione (Giorno -2 a 0) <ol><li> Split cellule HEK293 1: 5 con 0,05% di soluzione di tripsina-EDTA e incubare in crescita media a 37 ° C con il 5% di CO 2 fino al 60 - 80% confluenti (2 - 3 giorni). Per ogni condizione, le cellule di coltura in 2 x 100 piatti mm. </li></ol> 2. cellulare trasfezione (giorno 1) <ol><li> Trasfezione le cellule HEK293 con plasmide codificante Fc-fusion che usano un reagente di trasfezione quali Lipofectamine. Metodi alternativi che si traducono in efficienza di transfezione comparabili possono anche essere utilizzati. </li><li> Ritorna cellule trasfettate per incubatore per 24 ore. </li></ol> 3. cellulare Propagazione (Day 2) <ol><li> Preriscaldare mezzi di crescita senza siero fetale bovino (-FBS) a 37 ° C. </li><li> Sciacquare piatti 2x 10 ml Crescita media -FBS, e restituiscono i piatti per la 37 ° C incubatore per 1 ora. </li><li> Sciacquare la culture piatti ancora una volta con 10 ml Crescita media -FBS, per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Incubate le cellule HEK293 trasfettate a 37 ° C per altre 48 ore senza FBS prima di raccogliere i media. </li></ol> 4. Perlina Aggregation (Giorno 4) <ol><li> Per raccogliere i supporti dalle piastre di coltura, trasferire file multimediali da ogni coppia di piatti da 50 ml provette coniche e spin a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. </li><li> Filtranti da 50 ml tubo conico in un filtro centrifugo con una siringa da 30 ml e 0,45 micron filtro a siringa. </li><li> Spin filtri centrifughi a 4.000 xg e 4 ° C fino al volume di terreno di coltura concentrato è di circa 500 microlitri (circa 15 minuti). Ripetere fino a quando è stato aggiunto tutti i media cultura e concentrato. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di proteina G sfere magnetiche a 1 ml di freddo ghiaccio Binding Buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni campione, posto su un magnete e rimuovere il tampone. Aggiungere immediatamente il terreno di coltura concentrato alla proteina G sfere magnetiche. </li><li> Ruotare i tubi a 4 ° C per 2 ore. </li><li> Pltubi asso su un magnete e rimuovere i supporti. Lavare rapidamente perle due volte con il freddo ghiaccio 1 ml di Binding Buffer, e poi risospendere perline in 300 microlitri Binding Buffer. </li><li> Split perline risospeso in 2 tubi, 150 ml in ciascun tubo, e quindi aggiungere 1,5 ml di mM CaCl 2 o 200 mM EDTA 200 per il &quot;calcio&quot; e condizioni &quot;non calcio&quot;, rispettivamente. </li><li> Trasferire 100 microlitri di ciascuna condizione di una depressione ben scorrere raccogli micrografie utilizzando un microscopio a luce trasmessa (Figura 2). Raccogliere immagini da 5 campi di visualizzazione per ogni esperimento in ogni punto desiderato. </li></ol> Analisi dei dati 5. <ol><li> Utilizzando ImageJ, o software di analisi dell&#39;immagine paragonabile, aprire uno dei cinque set di dati di immagine utilizzando l&#39;Importazione / Sequenza d&#39;immagini ... dal menu a tendina File. Questi saranno aperti come una serie di immagini. </li><li> Nella finestra di dialogo ... Immagine / Proprietà modificare l&#39;iunità mage per pixel e impostare Pixel Larghezza e Altezza pixel a 1.0. </li><li> Convertire le immagini in binario usando il / Soglia Regola ... comando nel menu a tendina immagine. Impostare la soglia per includere i pixel che contribuiscono a perline o aggregati tallone, ma che escludono background e piccole particelle. Applica a tutte le immagini nello stack. </li><li> Nella finestra di dialogo Imposta misurazioni, selezionare le caselle di area e Stack di posizione. </li><li> Eseguire Analizza particelle ... nel Analizza menu a tendina. Questo genererà un elenco di particelle identificate, compresa la loro dimensione (area) e l&#39;immagine in cui sono stati identificati. </li><li> Ripetere questo processo per il quale sperimentare e condizione sperimentale. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;adesione cellulare è una caratteristica essenziale della vita pluricellulare ed è mediata da una vasta gamma di proteine ​​di superficie cellulare. Di questi, le proprietà adesive dettagliate sono compresi solo una parte relativamente piccola. Qui, abbiamo descritto un protocollo rapido semplice per indagare la capacità adesiva homophilic di ectodomains secreti fuse a un tag epitopo conveniente. Questo approccio ha una serie di importanti vantaggi. In primo luogo, le linee cellulari stabili non sono necessari <sup...

Adesione cellula-cellula è essenziale per lo sviluppo e l&#39;integrità degli organismi multicellulari ed è mediata da una gamma diversificata di molecole di superficie cellulare. Molte di queste molecole di adesione sono stati identificati e caratterizzati, anche se molti rimangono da scoprire. Diversi metodi sono utilizzati per studiare le proprietà delle molecole di adesione cellulare (CAM), tra cui separazione delle cellule saggi, saggi di aggregazione delle cellule 1-8 e metodi biofisici, come la microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza di superficie 9-12. La complessità di anche semplificata nei sistemi in vitro su linee cellulari rende difficile determinare le proprietà adesive di una CAM putativo. Tipicamente, una molecola è considerata una CAM se induce aggregazione cellulare quando trasfettati in una linea cellulare non adesivo. Tuttavia, è chiaro che questa non è una prova diretta dell&#39;attività adesivo. Per esempio, facilitando la consegna superficie cellulare o la stabilità di unCAM potrebbe anche tradursi in una maggiore aggregazione delle cellule 1,13. Inoltre, un vero CAM potrebbe non riuscire a mediare aggregazione cella se la linea cellulare manca di altri co-fattori necessari per la consegna superficie cellulare o stabilizzazione. Per evitare questi fattori di complicazione, le analisi più dirette possono essere impiegate che si basano sull&#39;idea che le interazioni adesive dovrebbe essere una proprietà biochimica intrinseca del dominio extracellulare. Mentre perline sono stati inizialmente utilizzati per caratterizzare Ng-CAM 2, questi test sono stati estesi al fine di indagare caderina-mediata adesione 12,14,15. Utilizzando fusione dei C-caderina ectodomain-Fc fusioni, il laboratorio Gumbiner ha mostrato che più ripetizioni caderina contribuiscono a omofiliche interazioni 14. Utilizzando comparabili metodiche di aggregazione tallone, E-caderina e N-caderina adesione sono stati anche caratterizzati 12,15, come avere un numero di protocadherins 1,15-18 e isoforme Dscam di Drosophila <em&gt; 19. Qui descriviamo un test relativamente semplice e rapida per caratterizzare l&#39;attività adesiva di secreti, ectodomains epitopi-tag di camme omofiliche putativi (Figura 1). Abbiamo usato questo test principalmente per caratterizzare i membri della superfamiglia caderina.

<table><tbody><tr><td>Plasmide pFc-N1</td><td>Addgene</td><td>Da inviare</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cellule</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Tecnologie di vita</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Tecnologie di vita</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteina G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Diapositive di depressione</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>filtro per siringa da 0,45 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella dei tamponi/soluzioni</td></tr><tr><td>Terreni di crescita</td><td>DMEM + 10% FBS + Filtro per streptococco a penna.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media di crescita &ndash; FBS</td><td>DMEM + Filtro Pen-Strep</td><td>sterilizzare e conservare a 4 °C.</td><td></td></tr><tr><td>Tampone legante</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vortex fino a dissoluzione, conservare in ghiaccio.</td><td></td></tr></tbody></table>

perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Adesione cellula-cellula è fondamentale per la vita pluricellulare ed è mediata da una gamma diversificata di proteine ​​di superficie cellulare. Tuttavia, le interazioni adesive per molte di queste proteine ​​sono poco conosciuti. Qui vi presentiamo un metodo rapido semplice per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare omofiliche putativi. HEK293 cellule coltivate vengono trasfettate con il plasmide di DNA che codifica un secreto, epitopo-tagged ectodomain di una proteina di superficie cellulare. Utilizzando perline funzionalizzati specifici per il tag epitopo, il, proteina di fusione solubile secreta viene catturato dal mezzo di coltura. Le perle rivestite possono essere utilizzati direttamente nel tallone metodiche di aggregazione o in cordone fluorescente smistamento test per verificare l&#39;adesione homophilic. Se lo si desidera, mutagenesi può quindi essere utilizzato per chiarire gli amminoacidi specifici o domini richiesti per l&#39;adesione. Questo test richiede solo piccole quantità di proteina espressa, non richiede la produzione di linee cellulari stabili, e può essere ACCOmplished in 4 giorni.

Un esperimento di esempio è presentato in figura 2, che mostra tallone aggregazione calcio-dipendente dal ectodomain di N-caderina fuso a Fc (NcadEC-Fc). In assenza di calcio, perline mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento delle dimensioni aggregata con il tempo (Figura 1A, C). In presenza di calcio, perline rivestite con NcadEC-Fc mostra robusta aggregazione, con granulometria crescente nel tempo (Figura 1B, C). Questo esperimento è sta...

Qui presentiamo un metodo semplice e rapido per caratterizzare le proprietà adesive intrinseche delle molecole di adesione cellulare putative. L'ectodominio secreto, marcato con epitopo, di una molecola di adesione cellulare viene catturato dal terreno di coltura su piccole perle funzionalizzate uniformi. Queste perle possono quindi essere utilizzate immediatamente in semplici saggi di aggregazione delle microsfere.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di testare la capacità dei domini ecto proteici di mediare l'adesione omofila per ottenere questo plasmide che codifica per la fusione di un frammento di dominio ecto nella regione FC delle IgG umane vengono trasfettate in cellule HEC 2 93. Le proteine di fusione Odin FC secrete vengono catturate su perline magnetiche coniugate alla proteina G e, dopo un lavaggio, le perle rivestite possono interagire in soluzione. Le perle rivestite vengono quindi visualizzate per valutare l'entità dell'aggregazione e infine, quantificate Utilizzando una semplice analisi delle immagini, i dati risultanti rivelano se la proteina oggetto di studio è in grado di mediare l'adesione omofila.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi di aggregazione cellulare, sono che è rapida, semplice e verifica direttamente l'attività adesiva della proteina scelta. A dimostrare questa tecnica sarà la dottoressa Michelle Eman, scienziata senior del laboratorio. Iniziare questa procedura preparando le cellule in coltura per NCA qui ECFC, due o tre giorni prima della trasfezione.Utilizzare lo 0,05% di viaggi in EDTA per staccare le cellule HEC 2 93 dalle piastre di coltura. Prepara due piatti da 100 millimetri per ogni condizione. Dividi le cellule da una a cinque e poi coltivale.Terreno di coltura integrato. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando non sono confluenti al 60-80%. Il giorno della trasfezione, utilizzare un reagente come lipo per introdurre un plasmide che codifica per la fusione FC.Dopo la trasfezione, rimettere le cellule nell'incubatore per 24 ore il giorno successivo alla trasfezione Prewarm, DMEM con streptococco pent e senza siero fetale bovino a 37 gradi Celsius. Sciacquare ogni piatto due volte con 10 millilitri di terreno riscaldato, quindi rimettere i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione, sciacquare i piatti di coltura ancora una volta con 10 millilitri di DMEM senza siero fetale bovino per un totale di tre lavaggi, quindi incubare le cellule sezionate a 37 gradi Celsius per altre 48 ore prima di raccogliere il terreno. Quattro giorni dopo la trasfezione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il terreno da ogni coppia di piastre di coltura e trasferirlo in una provetta conica da 50 millilitri.Quindi centrifugare il terreno a 500 Gs ogni cinque minuti per pellettare i detriti cellulari dopo la centrifuga, versare il terreno da ogni tubo conico da 50 millilitri in una siringa da 30 millilitri e filtrarlo attraverso una siringa da 0,45 micron. Filtrare in un concentratore centrifugo. Centrifugare i filtri centrifughi fino a quando il volume del terreno di coltura concentrato non è stato ridotto a circa 500 microlitri.L'operazione dura circa 15 minuti. Ripetere questo processo fino a quando tutto il terreno di coltura è stato aggiunto e concentrato. Successivamente, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni campione a 1,5 microlitri di perle magnetiche di proteina G per un millilitro di tampone legante ghiacciato.L'aspetto più difficile di questa procedura è l'aggregazione delle perline. Per garantire il successo, assicurati di seguire esattamente la procedura. Guarda le perline velocemente, ma non troppo duramente.Non devono mai essere lasciati asciugare sul lato del tubo o rimanere sul magnete troppo a lungo. Posizionare la provetta su un magnete e, utilizzando una pipetta, aspirare il tampone. Quindi aggiungere immediatamente il terreno di coltura concentrato alle microsfere magnetiche di proteina G.Ruotare i tubi a quattro gradi Celsius per due ore. Posiziona i tubi su un magnete e rimuovi rapidamente il mezzo. Lavare le perle due volte con un millilitro di tampone legante ghiacciato, quindi risospendere le perle in 300 microlitri di tampone legante.Dividere le perle risolute in due tubi con 150 microlitri in ciascun tubo. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di cloruro di calcio o EDTA rispettivamente per le condizioni di calcio e senza calcio. Trasferire 100 microlitri da ogni condizione a una depressione.Scivolare bene utilizzando un microscopio a luce trasmessa. Raccogli immagini da cinque campi visivi per ogni esperimento in ogni momento desiderato. Utilizzando l'immagine J o un software di analisi delle immagini comparabile.Apri uno dei cinque set di dati dell'immagine nell'immagine J nel menu a discesa. Nella parte superiore dello schermo, seleziona file. Quindi seleziona importa, quindi sequenza di immagini.Trova la cartella contenente i file immagine, quindi aprili come una pila di immagini. Successivamente, nella barra del menu a discesa, fai clic sull'immagine, quindi seleziona le proprietà. Per aprire la finestra delle proprietà lì.Modificate le unità dell'immagine in pixel e impostate la larghezza e l'altezza dei pixel su 1,0. Fare nuovamente clic sull'immagine, selezionare Regola, quindi Soglia per aprire la finestra della soglia e utilizzare il cursore per regolare la soglia dell'immagine. Includi i pixel che contribuiscono alle perline ed escludono le particelle di piccole dimensioni.Applica la soglia a tutte le immagini nella pila di immagini. Avanti nella barra del menu a discesa nella parte superiore dello schermo. Fare clic su analizza.Quindi selezionare imposta misure per aprire la finestra di dialogo di misurazione utilizzando le caselle di controllo seleziona l'area e la posizione della pila nella parte superiore dello schermo. Fare clic su analizza, quindi selezionare analizza particelle. Questo genererà un elenco di particelle identificate che include la loro dimensione e l'immagine in cui sono state identificate.Ripetere questo processo per ogni esperimento e ogni condizione sperimentale per determinare la capacità adesiva calcio-dipendente del pesce zebra e della caderina. Le cellule HEC 2, 9, 3 sono state trasfettate con il dominio OD della herrina NCAT fuso due fc e le successive cellule di aggregazione delle perle calcio-dipendenti sono state visualizzate e analizzate come descritto in questo video, come si può vedere in queste immagini. In assenza di calcio, le perle mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento della dimensione dell'aggregato con il tempo in presenza di calcio.Tuttavia, i battiti rivestiti con NCAT qui e ECFC mostrano un'aggregazione robusta con la dimensione dell'aggregato che aumenta nel tempo come misura semiquantitativa dell'adesione. Le immagini a luce trasmessa da tre esperimenti sono state analizzate per determinare la dimensione media degli aggregati. Come si può vedere in questo grafico, l'aggregazione di perle rivestite di ECFC in presenza di calcio e in assenza di calcio è stata determinata a intervalli di 15 minuti.Nel corso di un'ora, questi dati rivelano che il dominio ecto della caderina zebrafish media l'adesione omofila calcio-dipendente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare se l'adesione è una proprietà biochimica intrinseca della tua proteina di interesse.

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Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

In questo video, dimostriamo la tecnica per misurare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche attraverso il saggio di aggregazione cellulare HEK. In questo saggio, un numero uguale di cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e una proteina fluorescente vengono mescolate con cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare post-sinaptica e un'altra proteina fluorescente. L'interazione tra le...

Saggio di aggregazione cellulare per rilevare le interazioni trans tra le molecole di adesione cellulare

Riportiamo un metodo in vitro che permette la quantificazione del numero effettivo di cellule adesive all'interno di un monostrato di cellule endoteliali.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

L'attaccamento batterico alle cellule ospiti è un passaggio fondamentale durante la colonizzazione e l'infezione dell'ospite. Questo protocollo descrive la generazione di adesine ricombinanti accoppiate a polimeri come materiali biomimetici che consentono l'analisi del contributo delle singole adesine a questi processi, indipendentemente da altri fattori batterici.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Questo studio dimostra l'utilità e la facilità di misurazione estensione quantitativa della membrana cellulare e la sua correlazione alla capacità adesiva delle cellule. Come un esempio rappresentativo, indichiamo qui quella proteina correlata Dickkopf 3 (DKK3) promuove la formazione aumentata lobopodia e adesività delle cellule nel carcinoma corticosurrenale cellule in vitro.

Caratterizzazione delle estensioni della membrana cellulare e studiando i loro ruoli nella dinamica di adesione delle cellule cancro

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.

Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Scopri un metodo rapido per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare utilizzando frammenti di ectodominio. Questa tecnica semplificata utilizza perline magnetiche funzionalizzate per saggi di aggregazione.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

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