Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di testare la capacità dei domini ecto proteici di mediare l'adesione omofila per ottenere questo plasmide che codifica per la fusione di un frammento di dominio ecto nella regione FC delle IgG umane vengono trasfettate in cellule HEC 2 93. Le proteine di fusione Odin FC secrete vengono catturate su perline magnetiche coniugate alla proteina G e, dopo un lavaggio, le perle rivestite possono interagire in soluzione. Le perle rivestite vengono quindi visualizzate per valutare l'entità dell'aggregazione e infine, quantificate Utilizzando una semplice analisi delle immagini, i dati risultanti rivelano se la proteina oggetto di studio è in grado di mediare l'adesione omofila.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi di aggregazione cellulare, sono che è rapida, semplice e verifica direttamente l'attività adesiva della proteina scelta. A dimostrare questa tecnica sarà la dottoressa Michelle Eman, scienziata senior del laboratorio. Iniziare questa procedura preparando le cellule in coltura per NCA qui ECFC, due o tre giorni prima della trasfezione.

Utilizzare lo 0,05% di viaggi in EDTA per staccare le cellule HEC 2 93 dalle piastre di coltura. Prepara due piatti da 100 millimetri per ogni condizione. Dividi le cellule da una a cinque e poi coltivale.

Terreno di coltura integrato. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando non sono confluenti al 60-80%. Il giorno della trasfezione, utilizzare un reagente come lipo per introdurre un plasmide che codifica per la fusione FC.

Dopo la trasfezione, rimettere le cellule nell'incubatore per 24 ore il giorno successivo alla trasfezione Prewarm, DMEM con streptococco pent e senza siero fetale bovino a 37 gradi Celsius. Sciacquare ogni piatto due volte con 10 millilitri di terreno riscaldato, quindi rimettere i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione, sciacquare i piatti di coltura ancora una volta con 10 millilitri di DMEM senza siero fetale bovino per un totale di tre lavaggi, quindi incubare le cellule sezionate a 37 gradi Celsius per altre 48 ore prima di raccogliere il terreno. Quattro giorni dopo la trasfezione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il terreno da ogni coppia di piastre di coltura e trasferirlo in una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi centrifugare il terreno a 500 Gs ogni cinque minuti per pellettare i detriti cellulari dopo la centrifuga, versare il terreno da ogni tubo conico da 50 millilitri in una siringa da 30 millilitri e filtrarlo attraverso una siringa da 0,45 micron. Filtrare in un concentratore centrifugo. Centrifugare i filtri centrifughi fino a quando il volume del terreno di coltura concentrato non è stato ridotto a circa 500 microlitri.

L'operazione dura circa 15 minuti. Ripetere questo processo fino a quando tutto il terreno di coltura è stato aggiunto e concentrato. Successivamente, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni campione a 1,5 microlitri di perle magnetiche di proteina G per un millilitro di tampone legante ghiacciato.

L'aspetto più difficile di questa procedura è l'aggregazione delle perline. Per garantire il successo, assicurati di seguire esattamente la procedura. Guarda le perline velocemente, ma non troppo duramente.

Non devono mai essere lasciati asciugare sul lato del tubo o rimanere sul magnete troppo a lungo. Posizionare la provetta su un magnete e, utilizzando una pipetta, aspirare il tampone. Quindi aggiungere immediatamente il terreno di coltura concentrato alle microsfere magnetiche di proteina G.

Ruotare i tubi a quattro gradi Celsius per due ore. Posiziona i tubi su un magnete e rimuovi rapidamente il mezzo. Lavare le perle due volte con un millilitro di tampone legante ghiacciato, quindi risospendere le perle in 300 microlitri di tampone legante.

Dividere le perle risolute in due tubi con 150 microlitri in ciascun tubo. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di cloruro di calcio o EDTA rispettivamente per le condizioni di calcio e senza calcio. Trasferire 100 microlitri da ogni condizione a una depressione.

Scivolare bene utilizzando un microscopio a luce trasmessa. Raccogli immagini da cinque campi visivi per ogni esperimento in ogni momento desiderato. Utilizzando l'immagine J o un software di analisi delle immagini comparabile.

Apri uno dei cinque set di dati dell'immagine nell'immagine J nel menu a discesa. Nella parte superiore dello schermo, seleziona file. Quindi seleziona importa, quindi sequenza di immagini.

Trova la cartella contenente i file immagine, quindi aprili come una pila di immagini. Successivamente, nella barra del menu a discesa, fai clic sull'immagine, quindi seleziona le proprietà. Per aprire la finestra delle proprietà lì.

Modificate le unità dell'immagine in pixel e impostate la larghezza e l'altezza dei pixel su 1,0. Fare nuovamente clic sull'immagine, selezionare Regola, quindi Soglia per aprire la finestra della soglia e utilizzare il cursore per regolare la soglia dell'immagine. Includi i pixel che contribuiscono alle perline ed escludono le particelle di piccole dimensioni.

Applica la soglia a tutte le immagini nella pila di immagini. Avanti nella barra del menu a discesa nella parte superiore dello schermo. Fare clic su analizza.

Quindi selezionare imposta misure per aprire la finestra di dialogo di misurazione utilizzando le caselle di controllo seleziona l'area e la posizione della pila nella parte superiore dello schermo. Fare clic su analizza, quindi selezionare analizza particelle. Questo genererà un elenco di particelle identificate che include la loro dimensione e l'immagine in cui sono state identificate.

Ripetere questo processo per ogni esperimento e ogni condizione sperimentale per determinare la capacità adesiva calcio-dipendente del pesce zebra e della caderina. Le cellule HEC 2, 9, 3 sono state trasfettate con il dominio OD della herrina NCAT fuso due fc e le successive cellule di aggregazione delle perle calcio-dipendenti sono state visualizzate e analizzate come descritto in questo video, come si può vedere in queste immagini. In assenza di calcio, le perle mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento della dimensione dell'aggregato con il tempo in presenza di calcio.

Tuttavia, i battiti rivestiti con NCAT qui e ECFC mostrano un'aggregazione robusta con la dimensione dell'aggregato che aumenta nel tempo come misura semiquantitativa dell'adesione. Le immagini a luce trasmessa da tre esperimenti sono state analizzate per determinare la dimensione media degli aggregati. Come si può vedere in questo grafico, l'aggregazione di perle rivestite di ECFC in presenza di calcio e in assenza di calcio è stata determinata a intervalli di 15 minuti.

Nel corso di un'ora, questi dati rivelano che il dominio ecto della caderina zebrafish media l'adesione omofila calcio-dipendente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare se l'adesione è una proprietà biochimica intrinseca della tua proteina di interesse.