Name: Isolamento linfociti T umani, la cultura e lanalisi delle migrazioni In Vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara l'isolamento e la coltura dei linfociti T umani per analizzare la loro migrazione in vitro su substrati di ICAM-1 e SDF-1. Questo metodo permette di studiare il ruolo delle integrine nel movimento cellulare.

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Questo progetto è stato sostenuto dal National Institutes of Health Borse HL087088 (MK) e HL18208 (MK).

1. Isolamento dei linfociti T <ol><li> Ottenere sangue umano da un donatore sano. Lasciare che il sangue a temperatura ambiente (~ 30 min) prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Delicatamente Pipettare 3 ml di sala multimediale densità Polymorph gradiente di temperatura in un ml 8 a fondo rotondo in polistirene. Delicatamente aggiungere 3 ml di sangue intero in cima ai media Polymorph. E 'importante evitare la sovrapposizione dei due reagenti. </li><li> Centrifugare le provette a 500 xg per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono ora separati da altri componenti del sangue nello strato superiore delle cellule. Lo strato PBMC appare, dall'alto verso il basso, come la prima band nuvoloso. </li><li> Rimuovere con attenzione il chiaro di colore giallo fase superiore del sangue, sopra il livello PBMC, e quindi utilizzare un P1000 micropipetta per trasferire lo strato PBMC a 15 ml o 50 ml di tubo conico. </li><li> Lavare i PBMC due volte con PBS, centrifugazione le cellule a 500 xg per 5 minuti ogni volta. Il supernatante sarà un po 'torbida dopo ogni lavaggio. </li></ol> 2. Cultura dei diritti dell'uomo e Linfociti T <ol><li> Utilizzando una pipetta, trasferire il PBMC in un pallone T-75 della cultura in 20 ml RPMI 1640 supporti contenenti il ​​10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 1 mg / ml fitoemoagglutinina (PHA). </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per almeno 1 ora, e fino a 24 ore. Questo passaggio consente monociti, che sarà aderente alla superficie del pallone, di essere separati dai linfociti che rimangono in sospensione. Se una breve incubazione (1 ora) viene utilizzata in questa fase, è accettabile utilizzare mezzi RPMI 1640 contenente il 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina senza integrazione con PHA, come specificato al punto 2.1. </li><li> Rimuovere con cura tutti i supporti dal pallone, aggiungerlo ad un tubo da 50 ml conica, e centrifugare a 500 xg per 5 minuti. </li><li> Risospendere il pellet di cellule, che ora contiene principalmente i linfociti, le cellule e il trasferimento a un nuovo T-75 beuta contenente 25 mL RPMI 1640 supporti contenenti il ​​10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 1 mg / mL di PHA. </li><li> Incubare a 37 ° C per 3 giorni (2 giorni se l'incubazione iniziale di PBMC era notte). Dopo 24 ore di crescita, può essere necessario aggiungere 15-20 ml di mezzi freschi e il trasferimento ad un T-175 più grandi pallone. </li><li> Dopo 3 giorni, utilizzare una pipetta di rimuovere il supporto e linfociti sospeso il pallone e in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti. </li><li> Risospendere il pellet cellulare e le cellule trasferire in un pallone nuovo T-75 o T-175 contenente 25 ml (T-75) o 50 ml (T-175) RPMI 1640 con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 20 ng / mL umano IL-2 o IL-15. </li><li> Crescere linfociti per 4-7 giorni. Se a partire da un T-75 fiasco, la cultura dovrà essere ampliato e trasferito in un T-175 fiasco dopo 1-2 giorni. </li></ol> 3. Test in vitro la migrazione dei linfociti <ol><li> 1 giorno prima del test di migrazione, il cappotto di un fondo di vetro piatto 0,17 mm con 20 mg / ml di proteina A o G in PBS notte a 4 ° C. </li><li> Lavare il piatto ampiamente con PBS. </li><li> Immobilizzare ICAM-1/Fc umano (10 mg / mL) e umano SDF-1 (2 mg / mL) con l'aggiunta di questi reagenti in soluzione PBS al piatto e incubazione 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Preparare i linfociti T determinando prima la densità delle cellule in coltura nel T-175 con un fiasco emocitometro. Circa 2-5 x 10 5 cellule dovrebbero essere utilizzati per piatto per ottenere una densità cellulare appropriato per l'analisi della migrazione. </li><li> Lavare i linfociti T per due volte con PBS e poi risospendere in 1 ml L-15 supporti contenenti 1 mg / ml di D-glucosio. </li><li> Lavare il piatto rivestito con ICAM-1/Fc e SDF-1 estesamente con PBS. </li><li> Trasferimento dei linfociti T in 1 media ml al piatto e mantenerli a 37 ° C. </li></ol> 4. Catturare una sequenza di immagini Utilizzando il software NIS Elements <ol><li> Aperto il software NIS Elements. </li><li> Nel menu delle impostazioni della fotocamera, scegliere "binning 2x2" come modalità per entrambe le immagini dal vivo e la cattura delle immagini. </li><li> Vai al menu Applicazioni e scegliere Definisci / Esegui esperimento. </li><li> Scegli l'intervallo di tempo tra le immagini e la lunghezza totale della sequenza di acquisizione delle immagini. </li><li> Premere il tasto "Run" per iniziare l'acquisizione di immagini. </li><li> Le celle possono essere monitorati e parametri di migrazione (velocità, lunghezza del percorso, spostamento, ecc) quantificato utilizzando uno dei pacchetti software, tra cui ImageJ, AutoQuant o Volocity (Figura 1). </li><li> Per generare un "complotto ragnatela", le coordinate XY per ogni cella e timepoint sono raccolti (Figura 2) e proiettate su un grafico con un comune punto di partenza per ogni cella all'origine (Figura 3). </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Il giorno 6 di coltura in presenza di uno di IL-2 o IL-15, i linfociti Tcostituiscono&gt; 98% delle cellule, come determinato dalla colorazione CD3 positivi e CD4 positivi e / o CD8 colorazione. Per IL-2, abbiamo trovato 83% + cellule CD4, CD8 + 15% e &lt;1% CD4 + CD8 +. Per IL-15, abbiamo trovato 88% + cellule CD4, CD8 + 11% e &lt;1% CD4 + CD8 +. Durante la migrazione dei linfociti T in ICAM-1/SDF-1 substrati, le cellule mostravano una velocità di circa 15 micron / min che può essere sostenuta per un tempo di 1 ora di tempo. La migrazione dei linfociti T sulle ICAM-1/SDF-1 dipende LFA-1-mediata adesione, come un anti-LFA-1-bloccante ligando anticorpi inibisce fortemente la migrazione. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Monitoraggio della migrazione delle cellule T linfociti. Linfociti T isolati dal sangue intero e coltivate in presenza di IL-2 o IL-15 per 6 giorni è stato permesso di aderire e migrare sul fondo di vetro piatti rivestiti con 10 mg / ml ICAM-1 e 2 mg / mL SDF-1. Immagini sono state acquisite ogni 10 secondi per 30 minuti. Le cellule sono state identificate in ogni immagine e monitorati nel tempo utilizzando un software Volocity. Questo filmato mostra la migrazione dei linfociti T casuale ad una velocità di circa 15 micron / min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Movie 1. Inseguimento cella di migrazione dei linfociti T. Linfociti T isolati dal sangue intero e coltivate in presenza di IL-2 o IL-15 per 6 giorni è stato permesso di aderire e migrare sul fondo di vetro piatti rivestiti con 10 mg / ml ICAM-1 e 2 mg / ml SDF-1 . Immagini sono state acquisite ogni 10 secondi per 30 minuti. Le cellule sono state identificate in ogni immagine e monitorati nel tempo utilizzando un software Volocity. Questo filmato mostra la migrazione dei linfociti T casuale ad una velocità di circa 15 micron / min. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posizione della cella spazio-temporale. Le coordinate XY di ogni cella sono stati ottenuti per ogni punto temporale utilizzando il software Volocity. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. "Spider complotto web." Utilizzando il XYT coordinate per ogni cella, 15 cellule sono state scelte a caso e tracciati con un punto di partenza comune all'origine. Confrontando trame ragnatela dà una rappresentazione visiva rapido delle differenze di migrazione tra diverse condizioni sperimentali. Parcelle per la migrazione dei linfociti T in condizioni di controllo (pannello di sinistra) e in presenza di un anti-LFA-1-bloccante ligando anticorpi (pannello di destra).

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo esperimento, forniamo i dettagli su un sistema semplice per analizzare la motilità del primario linfociti T umani. Saggi di migrazione in vitro sono stati utilizzati per sezionare i ruoli di molte molecole e le vie di segnalazione coinvolte nella locomozione dei vari tipi di cellule. Alcuni controlli critici da tenere a mente quando si progetta l&#39;esperimento proprio dal nostro protocollo sono: 1) non-adesivo o non-integrina rivestimenti substrato adesivo, come sieroalbumina bovina (BSA) o...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umana ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 umana ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Proteina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1/Fc umana ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 umano ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento linfociti t umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni in vitro</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

La migrazione dei linfociti T richiede l&#39;interazione adesiva delle integrine superficie cellulare con ligandi espressi su altre cellule o con proteine ​​della matrice extracellulare. L&#39;attivazione delle integrine preciso spazio-temporale da uno stato a bassa affinità ad uno stato ad alta affinità al bordo cellula principale è importante per la migrazione dei linfociti T<sup&gt; 1</sup&gt;. Allo stesso modo, retrazione del bordo d&#39;uscita delle cellule, o uropod, è un passo necessario a mantenere persistente integrina-dipendente motilità dei linfociti T<sup&gt; 2</sup&gt;. Molti approcci terapeutici per autoimmuni o infiammatorie integrine obiettivo malattie come mezzo per inibire l&#39;eccessiva reclutamento e la migrazione dei leucociti<sup&gt; 3</sup&gt;. Per studiare gli eventi molecolari che regolano la migrazione dei linfociti T umani, abbiamo utilizzato un<em&gt; In vitro</emSistema&gt; per analizzare la migrazione delle cellule su un substrato bidimensionale che simula l&#39;ambiente che un linfocita T incontra durante il reclutamento dal sistema vascolare. Linfociti T vengono prima isolati da donatori umani e vengono poi stimolati e in coltura per 7-10 giorni. Durante il test, i linfociti T possono aderire e migrare su un substrato rivestito con molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), un ligando per integrina LFA-1 e cellule stromali derivate fattore-1 (SDF-1). I nostri dati mostrano che i linfociti T presentano una velocità migratorio di ~ 15 micron / min. La migrazione dei linfociti T può essere inibita dal blocco delle integrine<sup&gt; 1</sup&gt; O con inibitori della macchina actomiosina cellulare che regola la migrazione delle cellule<sup&gt; 2</sup&gt;.

La migrazione dei linfociti T si verifica durante homing verso gli organi linfoidi, uscire dal sistema vascolare, e di entrare in tessuti periferici. Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per analizzare la migrazione dei linfociti T<em&gt; In vitro</em&gt;.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

La migrazione dei linfociti T comporta l'interazione adesiva delle integrine di superficie cellulare con ligandi espressi su altre cellule o con la matrice extracellulare...

La migrazione dei linfociti T avviene durante l'omning verso organi linfoidi, l'uscita dal circolo vascolare e l'ingresso nei tessuti periferici. Questo processo implica l'interazione adesiva della superficie del linfocita T con altre cellule. Per esaminare questo fenomeno in vitro, i linfociti T umani vengono isolati, coltivati e posti su piastre per colture cellulari rivestite con la proteina adesiva.ICAM-1 e chemochina SDF-1. Possono quindi essere acquisite e analizzate immagini della migrazione dei linfociti T. Ciao, sono Craig LeFort e del laboratorio di Minsu Kim del Centro di Biologia dei Vaccini e Immunologia presso l'Università di Rochester.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e la coltura di linfociti umani da adolescenti, nonché un'analisi della loro migrazione in vitro. Utilizziamo questo saggio nel nostro laboratorio per studiare il ruolo degli integrini e della migrazione dei linfociti T. L'integrina principale nei linfociti T è l'antigene associato alla funzione linfocitaria uno, o LFA-1.I ligandi specifici per LFA-1 sono le ICAM, come ICAM-1. Inoltre, è necessario un segnale chimico per la migrazione dei linfociti T, che fornisce sia un segnale di direzionalità sia l'attivazione degli integrini. Nel nostro saggio, utilizziamo ICAM-1 umana e CXCL12 o SDF-1 come substrati per la migrazione dei linfociti T.Iniziamo. Dopo aver ottenuto sangue umano da un donatore sano, lasciare che il sangue si raffreddi a temperatura ambiente. Questo richiede circa 30 minuti.Una volta raffreddato il sangue, pipettare delicatamente tre millilitri di mezzo di gradiente di densità per polimorfi a temperatura ambiente in un tubo conico in polistirene da otto millilitri. Successivamente, aggiungere delicatamente tre millilitri di sangue intero in cima. È importante evitare qualsiasi mescolamento.Posizionare i tubi in una centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 500 G per 45 minuti. A temperatura ambiente, al termine della centrifugazione, le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC sono state separate dagli altri componenti del sangue. Lo strato di PBMC appare come la prima banda torbida partendo dall'alto.In condizioni sterili, rimuovere con attenzione e scartare la fase superiore di colore giallo chiaro. Successivamente, utilizzare una micropipetta P 1000 per trasferire lo strato di PBMC in un nuovo tubo conico. Lavare i PBMC due volte con PBS centrifugando le cellule a 500 G per cinque minuti.Ogni volta, il sopranatante sarà leggermente torbido dopo ogni lavaggio. Ripesare le cellule in 20 millilitri di terreno RPMI 1640 contenente 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina e un microgrammo per millilitro di fitoemagglutinina o PHA. L'incubazione in presenza di PHA induce l'attivazione e l'espansione dei linfociti T.Utilizzando una pipetta, trasferire i PBMC in una fiasca da coltura T 75. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per uno a 24 ore. Questo passaggio consente di separare i monociti, che aderiranno alla superficie della fiasca, dai linfociti che rimangono in sospensione.Al termine dell'incubazione, rimuovere con attenzione tutto il mezzo contenente principalmente linfociti e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare a 500 G per cinque minuti. Sospendere il pellet cellulare in RPMI 1640 e trasferire le cellule in una nuova fiasca T75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640 con FBS, penicillina, streptomicina e PHA, incubata a 37 gradi Celsius.Dopo 24 ore di crescita, potrebbe essere necessario aggiungere da 15 a 20 millilitri di mezzo fresco e trasferire in una fiala T175 più grande. Continuare l'incubazione per tre giorni o due giorni. Se l'incubazione iniziale dei PBMC è stata notturna dopo tre giorni, utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo, che conterrà linfociti in sospensione, e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri da centrifugare a 500 ×g per cinque minuti.Reese ha centrifugato il pellet cellulare e ha trasferito le cellule in un nuovo flacone T 75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640. Con FBS, penicillina, streptomicina e IL-2 umana o IL-15, posizionare le cellule nell'incubatore. Se si inizia con un flacone T 75, la coltura dovrà essere espansa e trasferita in un flacone T 175.Dopo uno o due giorni, coltivare i linfociti per un totale di quattro a sette giorni. Un giorno prima del saggio di migrazione, rivestire una piastra con fondo in vetro da 0,17 millimetri con 20 microgrammi per millilitro di proteina A o G in PBS, incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare abbondantemente la piastra con PBS, quindi aggiungere nel piatto ICAM one FC e human SD F1 in soluzione PBS.Incubare per quattro ore a temperatura ambiente per immobilizzare le molecole. Determinare la densità delle cellule coltivate utilizzando un emocitometro. Quindi lavare i linfociti due volte con PBS e risospendere in un millilitro di mezzo L 15 contenente D glucosio. Al termine dell'incubazione, lavare accuratamente la piastra rivestita con ICAM one FC e SDF one con PBS. Trasferire i linfociti T in un millilitro di mezzo nella piastra; dovrebbero essere utilizzate circa da due a cinque volte 10 alla quinta cellula per piastra, per ottenere una densità cellulare adeguata all'analisi della migrazione.Per ottenere immagini della migrazione cellulare, posizionare la piastra sul palchetto del microscopio in un ambiente controllato per la temperatura, ad esempio in una camera riscaldata a 37 gradi Celsius. Aprire il software NIS Elements nel menu delle impostazioni dell'immagine. Selezionare il modo di binning 2x2 sia per l'acquisizione in tempo reale sia per la cattura dell'immagine.Vai al menu delle applicazioni e scegli, definisci ed esegui l'esperimento. Scegli l'intervallo di tempo tra le immagini e il tempo totale. Per la sequenza di acquisizione delle immagini, premi il pulsante di esecuzione per iniziare l'acquisizione delle immagini dopo l'acquisizione.I parametri di migrazione come velocità, lunghezza del percorso e spostamento possono essere quantificati utilizzando un pacchetto software come Image J Auto Quant o veloc. Per generare un grafico a ragnatela, raccogliere le coordinate XY per ogni cellula e punto temporale e proiettarle su un grafico con un punto di partenza comune per ciascuna cellula nell'origine. I linfociti T mostrati qui sono stati coltivati su ICAM e SDF uno e immaginati ogni 10 secondi per 30 minuti.Questo filmato mostra la migrazione casuale di linfociti T a una velocità di circa 15 micron al minuto, utilizzando le coordinate XYT per ogni cellula. Sono state scelte casualmente 15 cellule e riportate su un punto iniziale comune nell'origine. Il confronto tra grafici a ragnatela fornisce una rappresentazione visiva immediata delle differenze nella migrazione tra diverse condizioni sperimentali.I grafici relativi alla migrazione dei linfociti T in condizioni di controllo sono mostrati a sinistra, mentre quelli relativi alla migrazione dei linfociti T in presenza di un anticorpo bloccante del ligando anti-LFA-1 sono mostrati a destra. Questi dati dimostrano che i linfociti T utilizzano l'integrina LFA-1 per migrare su un substrato di ICAM-1. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio di migrazione utilizzando linfociti T umani coltivati durante la procedura.È importante ricordare di aggiungere un numero appropriato di cellule alla piastra rivestita con ICAM-1 in modo da semplificare il tracciamento cellulare e l'analisi della migrazione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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