Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro

La migrazione dei linfociti T avviene durante l'homing agli organi linfoidi, l'uscita dal sistema vascolare e l'ingresso nei tessuti periferici. Questo processo comporta l'interazione adesiva della superficie delle cellule T con altre cellule. Per esaminare questo fenomeno in vitro, i linfociti T umani vengono isolati, coltivati e posizionati su piastre di coltura tissutale rivestite con la proteina adesiva.

ICAM uno e chemochine SDF uno. Le immagini della migrazione dei linfociti T possono quindi essere acquisite e analizzate. Ciao, sono Craig LeFort e sono il laboratorio di Minsu Kim presso il Center for Vaccine Biology and Immunology dell'Università di Rochester.

Oggi vi mostriamo una procedura per l'isolamento e la coltura dei linfociti adolescenti umani, un'analisi della loro migrazione in vitro. Utilizziamo questo test nel nostro laboratorio per studiare il ruolo delle integrine e della migrazione delle cellule T. L'integrina principale nelle cellule T è l'antigene uno associato alla funzione linfocitaria o LFA uno.

I ligandi specifici per quello LFA sono gli icas, come quello ICAM. Inoltre, è necessario un segnale di parentela per la migrazione delle cellule T per fornire sia un segnale di direzionalità che per attivare le integrine. Nel nostro saggio, utilizziamo ICAM one umano e CX CL 12 o SDF one come substrati per la migrazione delle cellule T.

Quindi iniziamo. Dopo aver ottenuto il sangue umano da un donatore sano, lasciare raffreddare il sangue a temperatura ambiente. Ci vogliono circa 30 minuti.

Una volta che il sangue si è raffreddato, pipettare delicatamente tre millilitri di terreno a gradiente di densità polimorfa a temperatura ambiente in una provetta di polistirene a fondo tondo da otto millilitri. Quindi aggiungere delicatamente tre millilitri di sangue intero sopra. È importante evitare qualsiasi mescolanza.

Mettere le provette in una centrifuga e farla girare 500 G per 45 minuti. A temperatura ambiente dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate del sangue periferico o P BMC sono state separate dagli altri componenti del sangue. Il livello PBMC appare come la prima banda nuvolosa dall'alto.

In condizioni sterili, rimuovere con cura e scartare la fase superiore di colore giallo chiaro. Quindi utilizzare una micropipetta P 1000 per trasferire lo strato di PBMC in una nuova provetta conica. Lavare due volte la PBMC con celle di centrifugazione PBS a 500 G per cinque minuti.

Ogni volta il surnatante sarà un po' torbido dopo ogni lavaggio. Risospendere le cellule in 20 millilitri di terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS, l'1% di penicillina streptomicina e un microgrammo per millilitro. L'incubazione della fitoemoglutinina o del PHA in presenza di PHA induce l'attivazione e l'espansione dei linfociti T.

Utilizzando una pipetta, trasferire il pbmc in un pallone di coltura T 75. Successivamente incubato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per una o 24 ore. Questo passaggio consente di separare i monociti, che aderiranno alla superficie del pallone, dai linfociti che rimangono in sospensione.

Dopo l'incubazione, rimuovere con cura tutto il terreno che contiene principalmente linfociti e trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare a 500 g per cinque minuti. Reese è stato il pellet cellulare in RPMI 1640 e ha trasferito le cellule in un nuovo flacone T 75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640 con FBS, penicillina, streptomicina e PHA incubati a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore di crescita, potrebbe essere necessario aggiungere da 15 a 20 millilitri di terreno fresco e trasferire in un pallone più grande da T 1 75. Continuare l'incubazione per tre giorni o due giorni. Se l'incubazione iniziale della PBMC è avvenuta durante la notte dopo tre giorni, utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno, che conterrà i linfociti sospesi e trasferirlo in una centrifuga in provette coniche da 50 millilitri a 500 G per cinque minuti.

Reese è stato il pellet della cella e ha trasferito le celle su un nuovo T 75 contenente 25 millilitri di RPMI 1640. Con FBS, penicillina, streptomicina e IL 2 o IL 15 umano posizionare le cellule nell'incubatore. Se si inizia un matraccio T 75, la coltura dovrà essere espansa e trasferita in un matraccio T 1 75.

Dopo uno o due giorni crescono i linfociti per un totale di quattro o sette giorni. Un giorno prima del test di migrazione, rivestire un piatto di 0,17 millimetri con fondo di vetro con 20 microgrammi per millilitro di proteina A o G in PBS, incubare per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare accuratamente il piatto con PBS, quindi aggiungere ICAM one FC e SD F1 umano in soluzione PBS al piatto.

Incubare per quattro ore a temperatura ambiente per immobilizzare le molecole. Determinare la densità delle cellule in coltura utilizzando un emocitometro. Quindi lavare i linfociti due volte con PBS e risospenderli in un millilitro di terreno L 15 contenente glucosio D dopo l'incubazione, lavare il piatto rivestito con ICAM uno FC e SDF uno ampiamente con PBS trasferire i linfociti T in un millilitro di terreno nel piatto, circa da due a cinque volte 10 alla quinta cellula dovrebbero essere utilizzati per piatto per ottenere una densità cellulare appropriata per l'analisi della migrazione.

Per ottenere immagini della migrazione cellulare, posizionare il piatto sul tavolino del microscopio in un ambiente a temperatura controllata, ad esempio una camera riscaldata a 37 gradi Celsius. Aprire il software NIS elements nel menu delle impostazioni dell'immagine. Scegli il binning due a due come modalità sia per l'imaging dal vivo che per l'acquisizione delle immagini.

Vai al menu delle applicazioni e scegli, definisci, esegui, sperimenta. Scegli l'intervallo di tempo tra le immagini e il tempo totale. Per la sequenza di acquisizione dell'immagine, premere il pulsante Esegui per avviare l'acquisizione dell'immagine dopo l'acquisizione.

I parametri di migrazione come la velocità, la lunghezza del percorso e lo spostamento possono essere quantificati utilizzando un pacchetto software come Image J Auto Quant o veloc. Per generare un grafico a ragnatela, raccogli le coordinate XY per ogni cella e punto temporale e proiettale su un grafico con un punto di partenza comune per ogni cella all'origine. I linfociti T qui mostrati sono stati coltivati, piastrati su ICAM e SDF one e sottoposti a imaging ogni 10 secondi per 30 minuti.

Questo filmato mostra la migrazione casuale dei linfociti T ad una velocità di circa 15 micron al minuto utilizzando le coordinate XYT per ogni cellula. 15 cellule sono state scelte a caso e tracciate con un punto di partenza comune all'origine. Il confronto dei grafici a ragnatela fornisce una rapida rappresentazione visiva delle differenze nella migrazione tra le diverse condizioni sperimentali.

I grafici per la migrazione dei linfociti T in condizioni di controllo sono mostrati a sinistra, mentre i grafici per la migrazione dei linfociti T in presenza di un anticorpo bloccante un ligando anti LFA sono mostrati a destra. Questi dati dimostrano che i linfociti T utilizzano l'integrina LFA uno per migrare su un substrato ICAM one. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un test di migrazione utilizzando linfociti T umani in coltura durante la procedura.

È importante ricordare di aggiungere un numero appropriato di cellule alla piastra rivestita ICAM in modo da semplificare il tracciamento delle cellule e l'analisi della migrazione. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.