Multi-step di preparazione tecnica per recuperare più classi di composti metabolita di approfondita analisi e Metabolomica informativo
11 luglio 2014
L'affidabilità dei risultati in esperimenti di metabolomica dipende l'efficacia e la riproducibilità della preparazione del campione. Descritto è un metodo rigoroso e approfondita che consente l'estrazione di metaboliti da fluidi biologici con possibilità di analizzare successivamente fino a migliaia di composti, o solo le classi di composti di interesse.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un mezzo efficace per frazionare i metaboliti in fluidi biologici complessi al fine di ottenere campioni semplificati per una migliore copertura del metaboloma. Ciò si ottiene aggiungendo prima a ciascun campione standard interni per monitorare la riproducibilità della preparazione del campione e le condizioni dello strumento. Il secondo passo consiste nell'aggiungere metanolo ghiacciato a ciascun campione per far precipitare le proteine che altrimenti potrebbero interferire con la successiva cromatografia e analisi mediante spettrometria di massa.
Successivamente, la fase di estrazione del liquido liquido separa i metaboliti idrofili da quelli idrofobici. La fase finale è l'estrazione in fase solida per frazionare ulteriormente i metaboliti lipidici in fosfolipidi, acidi grassi e lipidi neutri. In definitiva, questo metodo combinato a più fasi viene utilizzato per mostrare una separazione efficace, un'eccellente riproducibilità e una migliore copertura del metaboloma plasmatico.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come una semplice estrazione con metanolo, è che otteniamo una migliore copertura dei metaboliti, in particolare dei lipidi, che è importante quando si eseguono studi di profilazione metabolomica o quando i lipidi sono di particolare interesse. Prima della precipitazione delle proteine, preparare i campioni per prima cosa e scongelare i campioni a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungi i campioni con gli standard interni ISTD che sono stati preparati in precedenza.
Tutte le concentrazioni standard sono state regolate, se necessario, in base alla sensibilità della strumentazione MS e HPLC utilizzata. Per l'analisi, aggiungere a ciascun campione 10 microlitri. Ciascuna delle soluzioni standard idrofile e idrofobiche aggiunge a ciascun campione 10 microlitri di soluzione di controllo positivo uno x due x o quattro x .
Dopo che tutti i campioni sono stati addizionati con standard interni e soluzioni di controllo positive, agitare ogni campione per 10 secondi. Per iniziare la precipitazione delle proteine, aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a ciascun campione. Vortice per 10 secondi per provetta, centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte.
G, Sul fondo del tubo dovrebbe formarsi un pellet proteico. Dopo la centrifugazione, trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta di coltura di vetro e quindi asciugare sotto azoto. Questo residuo essiccato subirà successivamente l'estrazione di liquidi liquidi.
Per l'analisi della frazione di pellet proteici, aggiungere un millilitro di etere di coleottero metile o MTBE al vortice di pellet proteico bianco o biancastro per 30 secondi per provetta e centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte. Travasare lo strato di MTBE in una nuova provetta di vetro. Poiché le dimensioni del pellet variano da un campione all'altro, è importante aspirare costantemente la stessa quantità di MTBE per tutti i campioni.
Ad esempio, se è possibile decantare solo 900 microlitri per il campione con la minima quantità di surnatante, decantare 900 microlitri. Per tutti i campioni, aggiungere un altro millilitro di MTBE al vortice di pellet proteico per 30 secondi, quindi centrifugare a zero gradi Celsius o 15 minuti. Aggiungere 18.000 volte G come prima, aspirare lo strato di MTBE e aggiungere alle provette di coltura in vetro preparate in precedenza.
Essiccare i campioni mediante flusso di azoto e risospendere in 200 microlitri di metanolo cloroformio uno-a-uno. Trasferire ogni campione in una provetta da centrifuga e centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte G.Successivamente, utilizzare pipette di vetro per trasferire il surnatante nelle fiale con tappo a vite del campionatore automatico. Per iniziare questa procedura, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere tre millilitri di MTBE al residuo di metanolo essiccato preparato in precedenza e agitare per 30 secondi.
Successivamente, aggiungi 750 microlitri di acqua a ciascun tubo e agita per 10 secondi. Centrifugare a circa 200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, due strati distinti sono visibili Dopo la centrifugazione, aspirare con cura 2,5 millilitri dello strato superiore di MTBE senza pipettare lo strato acquoso sottostante e trasferire in una coltura di vetro pulita. Due. Aggiungere tre millilitri di MTBE alla parte d'acqua rimanente di ciascun campione.
E vorticare 10 secondi per centrifuga in provette a circa 200 volte G per 10 minuti. A temperatura ambiente, aspirare tre millilitri di MTBE senza prendere acqua e unire al precedente tubo MTBE. Questa frazione di MTBE subirà successivamente l'estrazione in fase solida.
Concentrare lo strato acquoso rimanente mediante essiccazione sotto azoto. Risospendere il residuo in 100 microlitri di uno e aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a ciascun vortice di provette, quindi trasferire in una provetta per microcentrifuga. Lasciare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per 20-30 minuti per consentire alle proteine rimanenti di precipitare nel metanolo.
Successivamente, centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte G, dovrebbe esserci un precipitato lungo il lato della provetta dopo la centrifugazione, aspirare 450 microlitri di surnatante senza aspirare il precipitato e trasferire in una provetta da microcentrifuga pulita. Asciugare completamente in un concentratore centrifugo sottovuoto a non più di 45 gradi Celsius per circa una o due ore. Risospendere il surnatante essiccato in 200 microlitri di acqua acetil nitrile al 5% e vortex.
Trasferire brevemente i campioni in auto, campionatore, fiale e congelare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per iniziare la procedura di estrazione in fase solida, essiccare la frazione MTBE ottenuta in precedenza sotto un buon flusso di azoto a 35-15 gradi Celsius per 10-15 minuti. Quando le frazioni di MTBE sono completamente asciutte, arrestare il flusso di azoto e risospendere rapidamente ogni campione in un millilitro di cloroformio utilizzando un vortice di pipette di vetro.
Lavare brevemente e condizionare due volte l'estrazione in fase solida o la cartuccia SPE con 400 microlitri di esano. Smaltire i rifiuti e sostituirli con un nuovo tubo di raccolta in vetro. Aggiungere il campione alla colonna SPE, applicare il vuoto e raccogliere il flusso.
Con una pipetta di vetro, aggiungere un millilitro di alcol isopropilico cloroformio due a uno alla colonna SPE e raccogliere il flusso nelle stesse provette di vetro. Questa è la frazione neutra. Essiccare la frazione neutra sotto azoto per 10-15 minuti.
Per ridurre al minimo l'ossidazione con una pipetta di vetro, aggiungere un millilitro di acido acetico al 5% in etere etilico alla colonna SPE e raccogliere il flusso. Questa è la frazione degli acidi grassi. Asciugare la frazione di acidi grassi sotto azoto per 10-15 minuti per ridurre al minimo l'ossidazione utilizzando punte di plastica.
Aggiungere 800 microlitri di metanolo alla cartuccia SPE e raccogliere il flusso attraverso in tubi conici di plastica da 15 millilitri, questa è la frazione fosfolipidica. Trasferire la frazione fosfolipidica in provette da centrifuga da 1,5 millilitri, asciugare i campioni con un concentratore centrifugo sottovuoto a 45 gradi Celsius per circa 1-1,5 ore. Infine, i reus sospendono ciascuno dei campioni delle tre frazioni in 200 microlitri di metanolo al 100% e trasferiscono ad auto, campionatore, fiale e conservano nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi.
L'efficacia del metodo M-T-B-E-S-P-E nell'estrazione sia degli standard lipidici che dei metaboliti endogeni è stata dimostrata nel complesso una migliore estrazione e copertura dei metaboliti rispetto ad altri metodi, come l'estrazione con metanolo o l'estrazione con solo MTBE, quando il numero di caratteristiche è stato confrontato utilizzando software qualitativo e quantitativo. A seguito dell'analisi lc MS, il confronto delle frazioni M-T-B-E-S-P-E ha mostrato una sovrapposizione minima tra le tre frazioni successive a SPE, il che dimostra l'efficienza nel separare i metaboliti idrofobici nelle rispettive classi chimiche per un'identificazione più sicura dei metaboliti. Inoltre, il recupero degli standard interni nelle frazioni utilizzando il metodo M-T-B-E-S-P-E, NR 12 ha dimostrato che gli standard interni erano allusi nella frazione relativa alla loro classe chimica.
Per valutare la riproducibilità cromatografica dei dati, la preparazione del campione è stata eseguita su tre campioni QC di plasma aggregati separati e ogni campione è stato iniettato in triplicato sullo strumento LCM MSS. La sovrapposizione coerente dimostra la riproducibilità dello strumento e della preparazione del campione. L'aumento del rumore chimico osservato per la modalità di ionizzazione negativa della frazione di acidi grassi può essere dovuto a contaminanti nei solventi LCM S.
Pertanto, sono stati analizzati solo i metaboliti che alludevano prima dei nove minuti. Non dimenticare che lavorare con cloroformio, MTBE, etere etilico e anche i reagenti più comuni utilizzati in questo metodo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi e l'esecuzione della preparazione del campione in una cappa aspirante dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo completo per l'estrazione di metaboliti da fluidi biologici, migliorando l'affidabilità e la riproducibilità degli studi di metabolomica. La tecnica consente l'analisi di un'ampia gamma di composti, con particolare attenzione ai metaboliti lipidici.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Metabolomica
- Preparazione di Campioni Biologici
- Spettrometria di Massa
Sfondo
- Il metabolomica si basa su una preparazione efficace dei campioni per ottenere risultati affidabili.
- Fluidi biologici complessi richiedono una frazionamento accurato per semplificare l'analisi.
- I metodi esistenti spesso non offrono una copertura completa dei metaboliti.
- Tecniche migliorate sono essenziali per gli studi di profilazione, specialmente per quanto riguarda i lipidi.
Scopo dello studio
- Illustrare un metodo in più passaggi per l'estrazione dei metaboliti.
- Migliorare la copertura del metaboloma plasmatico.
- Migliorare la riproducibilità negli esperimenti di metabolomica.
Metodi Utilizzati
- Aggiunta di campioni con standard interni per il monitoraggio della riproducibilità.
- Precipitazione delle proteine mediante metanolo ghiacciato.
- Estrazione liquido-liquido per separare i metaboliti idrofili e idrofobi.
- Estrazione su fase solida per una ulteriore frazionamento dei metaboliti lipidici.
Risultati principali
- Separazione efficace dei metaboliti ottenuta mediante il metodo descritto.
- Reproducibilità eccellente dimostrata tra i diversi campioni.
- Copertura migliorata dei metaboliti lipidici rispetto ai metodi tradizionali.
- Validata l'efficacia del metodo per studi di profilazione metabolomica.
Conclusioni
- Il metodo di estrazione in più fasi migliora significativamente l'analisi dei metaboliti.
- Una maggiore copertura dei lipidi è fondamentale per studi metabolomici completi.
- Questa tecnica offre un approccio affidabile per i ricercatori del settore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica di frazionamento multi-step dei metaboliti affronta un collo di bottiglia critico nella metabolomica: la preparazione incoerente dei campioni che porta a dati non affidabili. Permettendo una migliore copertura dei metaboliti lipidici e una separazione riproducibile delle classi di composti, aumenta l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro di convalida degli obiettivi e di scoperta di biomarcatori. Il metodo supporta la riduzione del rischio nelle ipotesi iniziali di scoperta attraverso un frazionamento guidato da informazioni chimiche, influenzando direttamente la priorizzazione del portafoglio in aree di malattia incentrate sui lipidi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediate dai lipidi separando acidi grassi, lipidi neutri e fosfolipidi per un'analisi mirata.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica attraverso l'arricchimento per classe chimica, favorendo un'identificazione più affidabile dei metaboliti nella chiarificazione dei percorsi metabolici.
- Valore predittivo: Migliora la riproducibilità grazie al recupero dello standard interno in tutte le frazioni, rafforzando l'affidabilità dei dati per decisioni di avanzamento o interruzione nella priorizzazione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce campioni frazionati con complessità chimica ridotta, consentendo una rilevazione più accurata e sensibile di metaboliti a bassa abbondanza nelle campagne di screening.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei campioni tra frazioni idrofile e idrofobe, migliorando la riproducibilità e la capacità analitica dei piattaforme di metabolomica.
- Valore strategico: Favorisce il riutilizzo della piattaforma generando frazioni conservabili (ad esempio, pellet proteico) per analisi retrospettive, aumentando l'efficienza nella valutazione dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta sistemi rilevanti per le malattie consentendo la frazionamento di plasma, lavaggio broncoalveolare (BALF) e liquido cerebrospinale (CSF), fluidi chiave nei modelli di malattie infiammatorie, neurodegenerative e metaboliche.
- Valore operativo: Garantisce continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a una copertura costante dei metaboliti e a un'analisi specifica per frazioni.
- Contenimento del rischio: Migliora l'affidabilità predittiva dei pannelli di biomarcatori riducendo i falsi negativi nel rilevamento dei metaboliti lipidici, grazie a un recupero migliore specifico per classe.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi all'identificazione del composto attivo, in particolare nei casi in cui il metabolismo dei lipidi è rilevante dal punto di vista meccanicistico per la malattia o la risposta al farmaco.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio biologico isolando le classi lipidiche coinvolte nella segnalazione, nell'infiammazione e nella dinamica delle membrane.
- Screening: Fornisce frazioni pronte per saggi con output quantitativi adatti al confronto degli effetti dei composti sul metabolismo lipidico.
- Analisi: Permette il confronto tra frazioni mediante normalizzazione rispetto a standard interni, fornendo letture statisticamente robuste per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'analisi specifica per frazione di biomarcatori in fluidi rilevanti per le malattie, come il liquido cerebrospinale e il plasma.
- Riutilizzo aziendale: Configura il flusso di lavoro come una capacità riutilizzabile, in cui pellet e frazioni conservati permettono analisi iterative senza necessità di nuova estrazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'identificazione dei metaboliti grazie alla separazione per classe chimica e alla riduzione della sovrapposizione spettrale.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante il monitoraggio di standard interni e una frazionatura costante tra diversi tipi di campioni.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui riducendo i falsi negativi nell'analisi delle vie lipidiche, con conseguente riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei target aggiustata per il rischio, basata su una copertura completa dei metaboliti lipidici nei modelli di malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica lipidica e tecniche di frazionamento per interpretare risultati specifici per classe.
- Presuppone l'accesso a centrifugazione, concentratori sotto vuoto e vetreria compatibile con cloroformio, MTBE ed etere etilico.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per volumi di solvente e protocolli di aspirazione, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi siti.
- Comporta considerazioni di adattamento legate a volumi di campione variabili (fino a 50 µL) e matrici fluide come plasma, lavaggio broncoalveolare (BALF) o liquido cerebrospinale (CSF).
- Presenta limitazioni pratiche, come la manipolazione di solventi pericolosi (cloroformio, MTBE, etere etilico) che richiede l'uso della cappa aspirante e di dispositivi di protezione individuale (PPE).
