Multi-step di preparazione tecnica per recuperare più classi di composti metabolita di approfondita analisi e Metabolomica informativo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un mezzo efficace per frazionare i metaboliti in fluidi biologici complessi al fine di ottenere campioni semplificati per una migliore copertura del metaboloma. Ciò si ottiene aggiungendo prima a ciascun campione standard interni per monitorare la riproducibilità della preparazione del campione e le condizioni dello strumento. Il secondo passo consiste nell'aggiungere metanolo ghiacciato a ciascun campione per far precipitare le proteine che altrimenti potrebbero interferire con la successiva cromatografia e analisi mediante spettrometria di massa.

Successivamente, la fase di estrazione del liquido liquido separa i metaboliti idrofili da quelli idrofobici. La fase finale è l'estrazione in fase solida per frazionare ulteriormente i metaboliti lipidici in fosfolipidi, acidi grassi e lipidi neutri. In definitiva, questo metodo combinato a più fasi viene utilizzato per mostrare una separazione efficace, un'eccellente riproducibilità e una migliore copertura del metaboloma plasmatico.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come una semplice estrazione con metanolo, è che otteniamo una migliore copertura dei metaboliti, in particolare dei lipidi, che è importante quando si eseguono studi di profilazione metabolomica o quando i lipidi sono di particolare interesse. Prima della precipitazione delle proteine, preparare i campioni per prima cosa e scongelare i campioni a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungi i campioni con gli standard interni ISTD che sono stati preparati in precedenza.

Tutte le concentrazioni standard sono state regolate, se necessario, in base alla sensibilità della strumentazione MS e HPLC utilizzata. Per l'analisi, aggiungere a ciascun campione 10 microlitri. Ciascuna delle soluzioni standard idrofile e idrofobiche aggiunge a ciascun campione 10 microlitri di soluzione di controllo positivo uno x due x o quattro x .

Dopo che tutti i campioni sono stati addizionati con standard interni e soluzioni di controllo positive, agitare ogni campione per 10 secondi. Per iniziare la precipitazione delle proteine, aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a ciascun campione. Vortice per 10 secondi per provetta, centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte.

G, Sul fondo del tubo dovrebbe formarsi un pellet proteico. Dopo la centrifugazione, trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta di coltura di vetro e quindi asciugare sotto azoto. Questo residuo essiccato subirà successivamente l'estrazione di liquidi liquidi.

Per l'analisi della frazione di pellet proteici, aggiungere un millilitro di etere di coleottero metile o MTBE al vortice di pellet proteico bianco o biancastro per 30 secondi per provetta e centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte. Travasare lo strato di MTBE in una nuova provetta di vetro. Poiché le dimensioni del pellet variano da un campione all'altro, è importante aspirare costantemente la stessa quantità di MTBE per tutti i campioni.

Ad esempio, se è possibile decantare solo 900 microlitri per il campione con la minima quantità di surnatante, decantare 900 microlitri. Per tutti i campioni, aggiungere un altro millilitro di MTBE al vortice di pellet proteico per 30 secondi, quindi centrifugare a zero gradi Celsius o 15 minuti. Aggiungere 18.000 volte G come prima, aspirare lo strato di MTBE e aggiungere alle provette di coltura in vetro preparate in precedenza.

Essiccare i campioni mediante flusso di azoto e risospendere in 200 microlitri di metanolo cloroformio uno-a-uno. Trasferire ogni campione in una provetta da centrifuga e centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte G.Successivamente, utilizzare pipette di vetro per trasferire il surnatante nelle fiale con tappo a vite del campionatore automatico. Per iniziare questa procedura, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere tre millilitri di MTBE al residuo di metanolo essiccato preparato in precedenza e agitare per 30 secondi.

Successivamente, aggiungi 750 microlitri di acqua a ciascun tubo e agita per 10 secondi. Centrifugare a circa 200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, due strati distinti sono visibili Dopo la centrifugazione, aspirare con cura 2,5 millilitri dello strato superiore di MTBE senza pipettare lo strato acquoso sottostante e trasferire in una coltura di vetro pulita. Due. Aggiungere tre millilitri di MTBE alla parte d'acqua rimanente di ciascun campione.

E vorticare 10 secondi per centrifuga in provette a circa 200 volte G per 10 minuti. A temperatura ambiente, aspirare tre millilitri di MTBE senza prendere acqua e unire al precedente tubo MTBE. Questa frazione di MTBE subirà successivamente l'estrazione in fase solida.

Concentrare lo strato acquoso rimanente mediante essiccazione sotto azoto. Risospendere il residuo in 100 microlitri di uno e aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a ciascun vortice di provette, quindi trasferire in una provetta per microcentrifuga. Lasciare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per 20-30 minuti per consentire alle proteine rimanenti di precipitare nel metanolo.

Successivamente, centrifugare a zero gradi Celsius per 15 minuti a 18.000 volte G, dovrebbe esserci un precipitato lungo il lato della provetta dopo la centrifugazione, aspirare 450 microlitri di surnatante senza aspirare il precipitato e trasferire in una provetta da microcentrifuga pulita. Asciugare completamente in un concentratore centrifugo sottovuoto a non più di 45 gradi Celsius per circa una o due ore. Risospendere il surnatante essiccato in 200 microlitri di acqua acetil nitrile al 5% e vortex.

Trasferire brevemente i campioni in auto, campionatore, fiale e congelare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per iniziare la procedura di estrazione in fase solida, essiccare la frazione MTBE ottenuta in precedenza sotto un buon flusso di azoto a 35-15 gradi Celsius per 10-15 minuti. Quando le frazioni di MTBE sono completamente asciutte, arrestare il flusso di azoto e risospendere rapidamente ogni campione in un millilitro di cloroformio utilizzando un vortice di pipette di vetro.

Lavare brevemente e condizionare due volte l'estrazione in fase solida o la cartuccia SPE con 400 microlitri di esano. Smaltire i rifiuti e sostituirli con un nuovo tubo di raccolta in vetro. Aggiungere il campione alla colonna SPE, applicare il vuoto e raccogliere il flusso.

Con una pipetta di vetro, aggiungere un millilitro di alcol isopropilico cloroformio due a uno alla colonna SPE e raccogliere il flusso nelle stesse provette di vetro. Questa è la frazione neutra. Essiccare la frazione neutra sotto azoto per 10-15 minuti.

Per ridurre al minimo l'ossidazione con una pipetta di vetro, aggiungere un millilitro di acido acetico al 5% in etere etilico alla colonna SPE e raccogliere il flusso. Questa è la frazione degli acidi grassi. Asciugare la frazione di acidi grassi sotto azoto per 10-15 minuti per ridurre al minimo l'ossidazione utilizzando punte di plastica.

Aggiungere 800 microlitri di metanolo alla cartuccia SPE e raccogliere il flusso attraverso in tubi conici di plastica da 15 millilitri, questa è la frazione fosfolipidica. Trasferire la frazione fosfolipidica in provette da centrifuga da 1,5 millilitri, asciugare i campioni con un concentratore centrifugo sottovuoto a 45 gradi Celsius per circa 1-1,5 ore. Infine, i reus sospendono ciascuno dei campioni delle tre frazioni in 200 microlitri di metanolo al 100% e trasferiscono ad auto, campionatore, fiale e conservano nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi.

L'efficacia del metodo M-T-B-E-S-P-E nell'estrazione sia degli standard lipidici che dei metaboliti endogeni è stata dimostrata nel complesso una migliore estrazione e copertura dei metaboliti rispetto ad altri metodi, come l'estrazione con metanolo o l'estrazione con solo MTBE, quando il numero di caratteristiche è stato confrontato utilizzando software qualitativo e quantitativo. A seguito dell'analisi lc MS, il confronto delle frazioni M-T-B-E-S-P-E ha mostrato una sovrapposizione minima tra le tre frazioni successive a SPE, il che dimostra l'efficienza nel separare i metaboliti idrofobici nelle rispettive classi chimiche per un'identificazione più sicura dei metaboliti. Inoltre, il recupero degli standard interni nelle frazioni utilizzando il metodo M-T-B-E-S-P-E, NR 12 ha dimostrato che gli standard interni erano allusi nella frazione relativa alla loro classe chimica.

Per valutare la riproducibilità cromatografica dei dati, la preparazione del campione è stata eseguita su tre campioni QC di plasma aggregati separati e ogni campione è stato iniettato in triplicato sullo strumento LCM MSS. La sovrapposizione coerente dimostra la riproducibilità dello strumento e della preparazione del campione. L'aumento del rumore chimico osservato per la modalità di ionizzazione negativa della frazione di acidi grassi può essere dovuto a contaminanti nei solventi LCM S.

Pertanto, sono stati analizzati solo i metaboliti che alludevano prima dei nove minuti. Non dimenticare che lavorare con cloroformio, MTBE, etere etilico e anche i reagenti più comuni utilizzati in questo metodo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi e l'esecuzione della preparazione del campione in una cappa aspirante dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.