Name: Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri l'array CGH per rilevare varianti del numero di copie genomiche nel DNA dei pazienti. Questa tecnica avanzata sostituisce la cariotipazione tradizionale e migliora la diagnosi delle sindromi genetiche.

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1. L&#39;etichettatura di reazione <ol><li> Prima dell&#39;uso, dUTPs pre-un&#39;aliquota cianinico 3 e 5-etichettati, nucleotidi senza etichetta e primer casuali alle concentrazioni consigliate dal produttore in lastre e negozio a 96 pozzetti a -20 C pronto per l&#39;uso. Ai fini del presente protocollo, aliquota 10,5 ml di adeguata dUTP etichettato e 10,5 ml nucleotidi senza etichetta e primer casuali in ogni pozzetto. </li><li> Scongelare il piatto pronto all&#39;uso 96 pozzetti di nucleotidi e primer a 4 ° C per circa 1 ora, al riparo dalla luce. </li><li> Una volta scongelato, equilibrare questo piatto a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, al riparo dalla luce. </li><li> Equilibrare campioni di DNA a 60 ° C per almeno 15 min. </li><li> Utilizzando un robot liquido movimentazione, erogare acqua priva di nucleasi a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. NOTA: Il volume di acqua dipenderà dalla concentrazione di ciascun campione di DNA input e dovrebbe essere sufficiente a determinare una concentrazione finale di 50 ng / ul. </li><li> Utilizzando un han liquidorobot dling, pipetta 1 mg di DNA in un pozzo della piastra a 96 pozzetti (vedi 1.5) per portare il volume totale a 20 l. NOTA: Piccole quantità di DNA possono essere utilizzati anche se la qualità dei dati risultante può essere compromessa (per i campioni preziosi, le quantità di DNA di ingresso fino a 400 ng possono essere utilizzati). </li><li> Utilizzando un robot manipolatore liquida, trasferire 20 ml di nucleotidi equilibrate e primer in ciascun pozzetto della piastra di DNA diluito. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti con tappi striscia (una tenuta stagna è fondamentale). </li><li> Denaturare il DNA a 99 ° C per 10 min in una macchina PCR con un coperchio riscaldato e quindi far scattare raffreddare su ghiaccio per 5 min a primer ricottura. </li><li> Utilizzando una gestione robot liquido, aggiungere 10 ml di Klenow DNA polimerasi Exo enzima per ogni DNA e mix pipetta accuratamente. NOTA: Il volume totale dovrebbe essere di 50 ml. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 ° C per 16 ore. NOTA: A incubazione più breve di 4 ore è sufficiente tuttavia un O / N incubation può essere più conveniente. </li><li> Utilizzando un robot liquido movimentazione, aggiungere 5 ml di tampone di arresto a ciascun pozzetto. NOTA: Una sintesi dei reagenti utilizzati per la reazione di marcatura è mostrato in Tabella 1. </li></ol> 2. Rimozione di Unincorporated nucleotidi <ol><li> Rimuovere nucleotidi non incorporati utilizzando silice membrana a base colonne di spin e un robot di spin elaborazione colonna dedicato (le colonne di rotazione possono essere trattati manualmente). Seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta 2 ml; pre-label questi con ID e di. NOTA: Questa fase può essere eseguita manualmente o, preferibilmente usando un robot di manipolazione di liquido. </li><li> Se si utilizza un trattamento robot Spin Column, quindi caricare il robot con 2 ml tubi, colonne di rotazione di purificazione del DNA e buffer associati. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di sale, di legame al DNA tampone (buffer PB) per la reazione di marcatura di legare il DNA marcato per la silicemembrana. </li><li> Rimuovere le impurità lavando membrana due volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (tampone PE). </li><li> Aggiungere 15 microlitri tampone di eluizione basso sale (tampone EB) alla membrana per recuperare il purificato, DNA marcato in un volume di ~ 12 microlitri. </li></ol></li></ol> 3. Unire Hyb Pairs <ol><li> Unire le coppie appropriate di cianinico 3 e 5 DNA marcato, COT-1 DNA, un mix di blocco fornito dal produttore e un buffer di ibridazione fornito dal produttore con un robot di liquido di movimentazione. NOTA: Queste coppie Hyb possono essere un campione e un riferimento, o un campione vs campione se CNVs condivisa non sono un problema (ad esempio, abbiamo regolarmente pair campioni fenotipo-non corrispondenti, come ad esempio una displasia paziente renale vs un paziente craniosinostosi, in quanto sono molto improbabile portare la stessa clinicamente significativa CNV). Se si utilizza un DNA di riferimento, si raccomanda una fornitura DNA commerciale, e dovrebbe essere elaborato fianco campione. <ol><li> Usando un trattamento liquido robot, aggiungere COT-1 DNA (3333 ng / ml), il fornito dal produttore di bloccaggio mix e tampone di ibridizzazione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in modo che ogni pozzetto contiene 1,1 microlitri COT-1 DNA, 4,95 ml mix di blocco e 24.75 tampone di ibridazione microlitri. </li><li> Aggiungere 9.35 ml di DNA adeguato Cyanine 3-marcato in ciascun pozzetto. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. </li><li> Aggiungere 9.35 ml di DNA Cyanine appropriata 5 marcato a ciascun bene. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti e vortex per 1 min. Spin la piastra a 96 pozzetti per raccogliere contenuti sul fondo di ciascun pozzetto. </li></ol></li></ol> 4. Ibridazione <ol><li> Preriscaldare il forno a 65 ° C e ibridazione preriscaldare una diapositiva di supporto e una camera di ibridazione per ogni diapositiva array. <ol><li> Denaturare il DNA marcato in incubazione pre-ibridazione prima di applicare agli array. Eseguire ibridazione in un forno rotante per 24 h. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 70 ° C per 30 min e poi lasciato a 37 ° C per almeno 5 minuti. </li><li> Lavorando ad una piattaforma riscaldata a 42 ° C, caricare ogni vetrino backup in una camera di ibridazione prima dell&#39;uso. Assicurarsi che la parte trasparente della slitta guarnizioni allinea con la parte &#39;finestrato&#39; della camera di ibridazione. </li><li> Dispensare 42 ml di mix ibridazione preparato in precedenza (vedi punto 3) sulla posizione appropriata sulla matrice sostegno diapositiva. Pre-bagnato ogni suggerimento per migliorare accuratezza della dispensazione. Pipettare lentamente sul centro di ciascuna posizione, assicurandosi che il liquido non tocchi il confine anello di gomma. </li><li> Una volta che tutte le posizioni sul vetrino supporto sono pieni, attenzione abbassare la diapositiva matrice su di esso e assemblare la camera di ibridazione. Assicurarsi che il lato della matrice con la scrittura su di esso si trova ad affrontare la diapositiva supporto. Assicurarsi di serrare la vite camera di ibridazione. </li><li> Ispezionare la camera di ibridazione assemblato. ENsure che non vi siano perdite di miscela di ibridazione fuori dei confini anello in gomma e ogni bolla d&#39;aria è ~ 4 mm quando la camera di ibridazione viene appoggiata sulla sua estremità verticalmente. Ruotare la camera di ibridazione e controllare che non vi siano bolle d&#39;aria che sono bloccati in posizione e non si muove. Se ci sono uno di questi, dare la camera di un forte tap in panchina. Verificare che tutte le bolle d&#39;aria si muovono. </li><li> Posizionare la camera di ibridazione in forno rotante a 65 ° C per 24 ore. Assicurarsi che il rotore del forno è equilibrato; utilizzare altre camere vuote se necessario. </li></ol></li></ol> 5. Lavaggio e la scansione di diapositive <ol><li> Lavare gli array per rimuovere l&#39;eccesso di DNA marcato e quindi eseguire la scansione per misurare la fluorescenza di ogni sonda. <ol><li> Prendere camere ibridazione di forno e smontare. Le diapositive di matrice e guarnizioni saranno incollati; immergere questi in tampone di lavaggio 1 e utilizzare un paio di plastica, pinze piatto da taglio per fare leva loro a parte. </li><li> Discard la diapositiva guarnizione e posizionare il vetrino array in un rack sommersa in tampone 1. </li><li> Lavare il vetrino array in ~ 700 ml di tampone di lavaggio fresco 1 per 5 min, agitando vigorosamente (utilizzare una pulce e un agitatore magnetico). </li><li> Trasferire il vetrino array per ~ 700 ml tampone di lavaggio 2 e lavare per 90 secondi, mescolando energicamente. Sollevare delicatamente le diapositive matrice su tampone di lavaggio 2, dovrebbero emergere a secco. </li><li> Caricare il vetrino array in un portavetrini dello scanner, utilizzando un protettore diapositiva. Caricare la diapositiva nello scanner matrice e la scansione seguendo le istruzioni del produttore della matrice. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Array CGH non rileverà riarrangiamenti bilanciati o anomalie ploidia quali triploidia. Inoltre, basso livello squilibri mosaico non possono essere rilevati. Tuttavia, CGH array ha una risoluzione più alta per il rilevamento CNV di analisi cromosomica G-banded quale essa ha sostituito in molti laboratori di citogenetica. E &#39;quindi il gold standard attuale per tutto il genoma di rilevamento CNV. Essa può essere sostituito da tecnologie di sequenziamento di prossima generazione per il futuro, ma attualmente, il loro co...

E &#39;noto da molti anni che delezioni o copie extra di segmenti cromosomici causano ritardo mentale, dismorfismi e malformazioni congentical, e in alcuni casi causare sindromi genetiche 1. Tuttavia, l&#39;unica tecnologia disponibile fino alla metà degli anni 2000 per la rilevazione genoma a livello di questi cambiamenti era G fasciato analisi cromosomica, che ha una risoluzione di circa 5-10 MB, a seconda della regione e la natura dello squilibrio, e che non può rilevare cromosomi anormali in cui il materiale è stato sostituito da una regione di un cromosoma differente con lo stesso pattern di bande. Ausiliari tecniche di citogenetica, come ibridazione fluorescente in situ e multiplex specifici legatura probe amplificazione sono stati disponibili per l&#39;interrogatorio di loci specifico, in caso di sospetto di squilibrio sindromico specifico, ma non è stato fino all&#39;introduzione della matrice ibridazione genomica comparativa (CGH array) nella routine clinica s diagnosticoervice 2-5 che il rilevamento a livello di genoma di numero di copie varianti (CNV) è diventato disponibile in forte aumento la risoluzione (in genere circa 120 KB). Lavori di manutenzione clinica accanto studi di ricerca hanno dimostrato che CNVs per alcune regioni sono molto diffuse nella popolazione normale 6-7, mentre altri CNVs, precedentemente non rilevabili, sono associati con neurodisabilities come l&#39;autismo e l&#39;epilessia 8-11. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato nel nostro UK National Health Service (NHS) laboratorio di diagnosi clinica; usiamo strategie di ibridazione nuove, prove per lotto e robotica per minimizzare i costi di questo servizio finanziati dallo Stato. Prima il protocollo descritto di seguito, il DNA di alta qualità dovrebbe essere estratto dal materiale di partenza appropriati, comunemente sangue, cellule coltivate o campioni di tessuto. Spettrofotometria può essere utilizzato per misurare la concentrazione (dovrebbe essere&gt; 50 ng / ul) e controllare 260: 280 rapporti di assorbanza (dovrebbe be 1.8-2.0). Elettroforesi gel può essere utilizzato per verificare che il DNA è di alto peso molecolare senza degradazione significativa. Questo protocollo è stato progettato per i laboratori di throughput più elevate che sono l&#39;etichettatura 96 ​​campioni per analisi utilizzando la robotica automatizzata gestione dei liquidi. Tuttavia, può essere adattato per laboratori di throughput inferiori senza automazione.

<table><tbody><tr><td>Microarray CGH 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Buffer di lavaggio Array CGH</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Buffer di ibridazione Array CGH</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione Minelute</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Kit di etichettatura Array CGH</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (cgh array) per il rilevamento di genomic copy number varianti

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH per il rilevamento delle varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo in banda G. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizi di diagnostica clinica. Il DNA estratto dal campione di un paziente (sangue, saliva o altri tipi di tessuto) è marcato con un fluorocromo (cianina 5 o cianina 3). Un campione di DNA di riferimento viene etichettato con il fluorocromo opposto. Segue una fase di pulizia per rimuovere i nucleotidi non incorporati prima che i DNA marcati vengano mescolati e risospesi in un tampone di ibridazione e applicati a un array comprendente ~60.000 sonde oligonucleotidiche da loci in tutto il genoma, con un'elevata densità di sonde in aree clinicamente importanti. Dopo l'ibridazione, gli array vengono lavati, quindi scansionati e le immagini risultanti vengono analizzate per misurare la fluorescenza rossa e verde per ciascuna sonda. Il software viene utilizzato per valutare la qualità di ogni misurazione della sonda, calcolare il rapporto tra fluorescenza rossa e verde e rilevare potenziali variazioni del numero di copie.

Ogni sonda su una matrice ibrida è visualizzato come una miscela di fluorocromi rosso e verde (vedi Figura 1). Il rapporto di rosso al segnale verde fluorescente per ciascuna sonda viene quantificato dallo scanner e il relativo software traccia questi come rapporti log2 base alla loro posizione genomica, e identifica le regioni di confine preimpostati fuori. L&#39;array tracce risultanti permettono l&#39;interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciato. Per esempio, la traccia d...

Array CGH per la rilevazione di varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l&#39;analisi del cariotipo G-fasciato. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizio diagnostico.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

L'obiettivo generale di questa procedura è l'uso dell'ibridazione genomica comparativa su matrice (array comparative genomic hybridization) per identificare squilibri nel genoma che possono causare una vasta gamma di malattie genetiche. Questo viene ottenuto etichettando innanzitutto il DNA del paziente con un colorante fluorescente. Nel secondo passaggio, il DNA del paziente e un DNA di riferimento etichettato in modo diverso vengono ibridati sulla matrice.Successivamente, l'array viene scansionato per misurare la quantità di DNA del paziente e del campione di riferimento legata a ciascuna sonda. Nell'ultima fase, l'immagine scansionata viene elaborata per identificare le regioni del genoma in cui il DNA del paziente presenta una quantità maggiore o minore di materiale rispetto al DNA di riferimento nell'array finale. L'ibridazione genomica comparativa viene utilizzata per determinare se il paziente è portatore di una variante nel numero di copie che determina un disturbo genetico.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'assemblaggio della matrice su vetrino può risultare difficoltoso e vi è il rischio che l'ibridazione fuoriesca dalla camera prima di iniziare la reazione di marcatura. Scongelare la piastra da 96 pozzetti pronta all'uso contenente nucleotidi e primer a quattro gradi Celsius e al riparo dalla luce per circa un'ora.Dopo lo scongelamento, equilibrare la piastra coperta per altri 30 minuti a temperatura ambiente; in questo periodo, equilibrare i campioni di DNA per 15 minuti a 60 gradi Celsius. Mentre i campioni si riscaldano, utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere una quantità sufficiente di acqua priva di nucleasi in ogni pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti. Successivamente, quando il DNA è pronto, trasferire un microgrammo di campione per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti contenente acqua.Ora trasferire 20 microlitri dei nucleotidi e degli iniziatori in equilibrio in ciascuna delle pozzette della piastra contenente i campioni di DNA diluiti e sigillare la piastra con tappi a striscia avendo cura di ottenere un sigillo ermetico. Successivamente, denaturare il DNA a 99 gradi Celsius in un termociclatore con coperchio riscaldato per 10 minuti e far annealare gli iniziatori rapidamente raffreddando la piastra sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere 10 microlitri dell'enzima DNA polimerasi clean out exo a ciascun campione.Mescolare i campioni mediante pipetta, quindi sigillare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, arrestare la reazione aggiungendo cinque microlitri di tampone di arresto per pozzetto. Rimuovere quindi i nucleotidi non incorporati. Trasferire il contenuto di ogni pozzetto in singole provette da due millilitri precedentemente etichettate.Caricare i campioni e le colonne di purificazione del DNA nei robot per colonne di centrifugazione, insieme ai rispettivi tamponi appropriati. Secondo le istruzioni del produttore, il robot per colonne di centrifugazione lega il DNA marcato alla membrana in silice utilizzando 250 microlitri di tampone di legame del DNA ad alto contenuto salino per provetta; successivamente, le impurità vengono rimosse dalle membrane mediante due lavaggi con 500 microlitri di tampone di lavaggio ciascuno. Il robot aggiungerà quindi 15 microlitri di tampone a basso contenuto salino alle membrane per recuperare i campioni di DNA marcato purificato in volumi approssimativi di 12 microlitri, da utilizzare per l'ibridazione dei campioni.Riscaldare in anticipo un fornetto di ibridazione a 65 gradi Celsius e preriscaldare le lamelle di supporto e le camere di ibridazione. Per preparare la miscela di ibridazione, unire 1,1 microlitri di cot 1D NA, 4,95 microlitri della miscela bloccante fornita dal produttore e 24,75 microlitri di tampone di ibridazione. Utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per distribuire questa miscela in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti, bagnando preventivamente ogni punta per migliorare la precisione del trasferimento.Successivamente pipettare 9,35 microlitri del corrispondente segnale, DNA etichettato con tre etichette, seguito da 9,35 microlitri del corrispondente segnale, DNA etichettato con cinque etichette. Sigillare ogni pozzetto, centrifugare i campioni per un minuto e dare una breve centrifugazione per raccogliere il contenuto sul fondo di ciascun pozzetto. Denaturare il DNA etichettato in un incubatore pre-ibridazione.Prima per tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavorare su una piattaforma riscaldata a 42 gradi Celsius. Posizionare il vetrino di supporto nella camera di ibridazione, assicurandosi che la parte trasparente della guarnizione sia allineata con la parte finestra della camera di ibridazione, utilizzando punte pre-umidificate.Ora pipettare lentamente 42 microlitri della miscela di ibridazione al centro della posizione appropriata della lamellina di supporto dell'array, facendo attenzione che il liquido non tocchi il bordo dell'anello di gomma. Una volta riempite tutte le posizioni, abbassare con cura la lamellina dell'array sulla lamellina di supporto e assemblare la camera di ibridazione.Assicurarsi che il lato dell'array con la scritta sia rivolto verso la lamellina di supporto, quindi serrare completamente la vite della camera di ibridazione ed esaminare la camera assemblata, verificando che non vi sia fuoriuscita di ibrido al di fuori dei limiti dell'anello di gomma e che ogni bolla d'aria abbia un'altezza di circa quattro millimetri. Quando la camera di ibridazione è posizionata verticalmente su una delle estremità, ruotarla per effettuare il controllo.Tutte le bolle d'aria in ogni posizione si stanno muovendo. Se alcune bolle sono bloccate, date un colpetto deciso alla camera sul banco. Quindi posizionate le camere di ibridazione nel forno rotante a 65 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo immergere le camere di ibridazione nel buffer di lavaggio uno e utilizzare una pinzetta di plastica con bordi piatti per separare i vetrini. Quindi scartare i vetrini con guarnizione e posizionare i vetrini con array in una rastrelliera, immergendoli in buffer fresco uno. Lavare i vetrini con array in circa 700 millilitri di buffer di lavaggio per uno a cinque minuti, agitando vigorosamente con un agitatore magnetico a forma di pulce.Quindi trasferire le lamelle con l'array in circa 700 millilitri di soluzione di lavaggio, due volte per 90 secondi, con un'agitazione più vigorosa alla fine del secondo lavaggio. Sollevare delicatamente le lamelle con l'array dalla soluzione. Devono emergere asciutte.Quindi caricare le lamelle con i microarray nei supporti per lamelle del lettore insieme ai protettori per lamelle, quindi scansionare i campioni. Secondo le istruzioni del produttore del microarray, ogni sonda su un array ibridato viene visualizzata come una miscela di fluorocromi rosso e verde. I rapporti tra segnale fluorescente rosso e verde per ciascuna sonda vengono quantificati dal lettore e il software associato li rappresenta come logaritmi in base due in funzione della loro posizione genomica.Gli allineamenti risultanti consentono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciate. Ad esempio, in questo tracciato proveniente da un bambino affetto da sindrome di Williams, una sindrome da microdelezione ricorrente mediata da ripetizioni con basso numero di copie nella regione prossimale del cromosoma sette, lo sbilanciamento genomico è stato identificato dal software mediante una linea rossa. Il valore logaritmico del rapporto fluorescente (prop) dovrebbe raggrupparsi strettamente intorno allo zero, indicando un rapporto verde su rosso pari a uno a uno per le regioni normali del genoma.Tracce di matrice disperse, come quelle osservate in questa scansione, possono portare a un'identificazione inaccurata delle regioni anomale o a un mancato riconoscimento dello squilibrio genomico, ed essere causate da diversi fattori, tra cui la scarsa qualità del DNA o la presenza di raggi, livelli di ozono nell'atmosfera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come processare campioni di pazienti per l'analisi mediante A CGH e produrre dati di alta qualità per l'analisi successiva e il rilevamento di variazioni del numero di copie.

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Questo video è una dimostrazione tecnico del protocollo di ibridazione per intero genoma piastrelle CGH array di percorso, che analizza l'intero genoma umano utilizzando solo 25-100 ng di DNA che può essere isolato da una varietà di fonti, tra cui materiale d'archivio formalina fisso.

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Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un'unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Questo protocollo fornisce la procedura sperimentale e informazioni su reagenti, attrezzature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di variazioni del numeri di copie in piante.

Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Questo manoscritto descrive l'analisi di variazione numero copia eseguita nel siero o plasma del DNA usando metodo PCR in tempo reale. Questo metodo è adatto per la stima della resistenza ai farmaci nei pazienti con cancro della prostata resistente alla castrazione, ma potrebbe essere istruttivo anche per altre malattie.

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Il manoscritto descrive un chip digitale test PCR per rilevare una variante rara di trascrizione CDH1 (CDH1a) nel normale fresco-congelato e tessuti del tumore ottenuti da pazienti con cancro gastrico.

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

Qui descriviamo una procedura per l'analisi a livello genomico della metilazione del DNA nei tumori gastrointestinali. La procedura è rilevante per studi che studiano le relazioni tra i modelli di metilazione dei geni e i fattori che contribuiscono alla carcinogenesi nei tumori gastrointestinali.

Analisi a livello genomico della metilazione del DNA nel cancro gastrointestinale

Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento di nuova generazione automatizzato e accreditato ISO15189 per rilevare alterazioni genomiche mirabili in tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina per carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).

Rilevamento di alterazioni mirabili nel carcinoma polmonare non a piccole cellule utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

Scopri l'array CGH per rilevare varianti del numero di copie genomiche nel DNA dei pazienti. Questa tecnica avanzata sostituisce la cariotipazione tradizionale e migliora la diagnosi delle sindromi genetiche.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

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