Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di organizzare l'ibridazione genomica comparativa per identificare gli squilibri nel genoma che possono portare a un'ampia varietà di malattie genetiche. Ciò si ottiene etichettando prima il DNA del paziente con un colorante fluorescente. Nella seconda fase, il paziente, il DNA e un DNA di riferimento diversamente marcato, vengono ibridati nell'array.

Successivamente, l'array viene scansionato per misurare la quantità di paziente e il DN di riferimento abbonda per ciascuna sonda. Nella fase finale, l'immagine scansionata viene elaborata per identificare le regioni del genoma in cui il DNA del paziente ha più o meno materiale rispetto all'array finale di DNA di riferimento. L'ibridazione genomica comparativa viene utilizzata per determinare se il paziente è portatore di una variante del numero di copie che provoca una sindrome genetica.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'assemblaggio del vetrino dell'array può essere difficile ed è facile per l'ibridazione. Mescolare la fuoriuscita dalla camera prima di iniziare la reazione di etichettatura. Scongelare la piastra a 96 pozzetti pronta all'uso di nucleotidi e primer a quattro gradi Celsius e al riparo dalla luce per circa un'ora.

Una volta scongelata, equilibrare la piastra coperta per altri 30 minuti a temperatura ambiente, equilibrare i campioni di DNA per 15 minuti a 60 gradi Celsius anche in questo momento. Mentre i campioni si riscaldano, utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per erogare abbastanza acqua priva di nucleasi in ciascun pozzetto di una nuova piastra da 96 pozzetti. Quindi, quando il DNA è pronto, trasferire un microgrammo di campione per pozzetto nella piastra d'acqua a 96 pozzetti.

Ora trasferisci 20 microlitri di nucleotidi equilibranti e primer su ciascuna delle piastre contenenti i campioni di DNA diluiti e sigilla la piastra con tappi a strisce avendo cura di sigillare ermeticamente. Successivamente, denaturare il DNA a 99 gradi Celsius in una macchina PCR con un coperchio riscaldato dopo 10 minuti e inginocchiare i primer raffreddando a scatto la piastra sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere 10 microlitri di enzima exo DNA polimerasi a ciascun campione.

Miscelare i campioni con la pipetta, quindi sigillare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo terminare la reazione con cinque microlitri di tampone di arresto per pozzetto, quindi rimuovere i nucleotidi non incorporati. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in singole provette da due millilitri pre-etichettate.

Caricare i campioni e le colonne di spin per la purificazione del DNA in un robot di elaborazione delle colonne di spin, nonché i tamponi associati appropriati. Secondo le istruzioni del produttore, il robot di elaborazione della colonna di centrifuga legherà il DNA marcato alla membrana di silice con 250 microlitri di tampone legante il DNA ad alto contenuto di sale per tubo, dopodiché le impurità verranno rimosse dalle membrane con due lavaggi da 500 microlitri di tampone di lavaggio ciascuno. Il robot aggiungerà quindi 15 microlitri di soluzione tampone a basso contenuto di sale alle membrane per recuperare i campioni di DNA purificati marcati in volumi di circa 12 microlitri per ibridare i campioni.

Quindi preriscaldare un forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e preriscaldare i vetrini di supporto e le camere di ibridazione. Per preparare la miscela di ibridazione, combinare 1,1 microlitri di culla 1D NA, 4,95 microlitri della miscela di blocco fornita dal produttore e 24,75 microlitri di tampone di ibridazione. Utilizzate il robot per la manipolazione dei liquidi per allocare questa miscela in ogni pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti, pre-bagnando ogni puntale per migliorare la precisione del trasferimento.

Pipettare successivamente 9,35 microlitri della firma appropriata, tre DNA marcato, seguiti da 9,35 microlitri della firma appropriata, cinque DNA marcato. Per ogni pozzetto sigillare la piastra, quattorsecare i campioni per un minuto e far girare rapidamente la piastra per raccogliere il contenuto sul fondo di ciascuno. Denaturare bene il DNA marcato in un incubatore di pre-ibridazione.

Prima per tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavorando su una piattaforma riscaldata a 42 gradi Celsius. Posizionare il vetrino di supporto nella camera di ibridazione, assicurandosi che la parte trasparente della guarnizione sia allineata con la parte finestrata della camera di ibridazione Utilizzando punte pre-bagnate.

Ora pipettare lentamente 42 microlitri della miscela di ibridazione al centro della posizione appropriata del vetrino di supporto dell'array. Fare attenzione che il liquido non tocchi il bordo dell'anello di gomma. Una volta che tutte le posizioni sono state riempite con cautela, abbassare il vetrino dell'array sul vetrino di supporto e assemblare la camera di ibridazione.

Facendo attenzione che il lato dell'array con la scritta sia rivolto verso il vetrino di supporto, serrare completamente la vite della camera di ibridazione e ispezionare la camera di ibridazione assemblata, confermando che non vi siano perdite di ibridazione. Mescolare al di fuori dei bordi dell'anello di gomma e che ogni bolla d'aria sia alta circa quattro millimetri. Quando la camera di ibridazione è appoggiata verticalmente sulla sua estremità, ruotare la camera di ibridazione per verificarlo.

Tutte le bolle d'aria in ogni posizione si muovono. Se una delle bolle è bloccata, dare un colpetto secco alla camera sul banco. Quindi posizionare le camere di ibridazione nel forno rotante a 65 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo immergere le camere di ibridazione in quello tampone di lavaggio e utilizzare un paio di pinze di plastica a bordo piatto per separare i vetrini. Quindi scartare i vetrini della guarnizione e posizionare i vetrini dell'array in un rack immerso in un tampone nuovo. Lavare i vetrini dell'array in circa 700 millilitri di tampone di lavaggio per uno-cinque minuti, mescolando energicamente con una pulce e una stella magnetica.

Quindi trasferire i vetrini dell'array a circa 700 millilitri di tampone di lavaggio, due per 90 secondi con un'agitazione più vigorosa alla fine del secondo lavaggio. Sollevare delicatamente le diapositive dell'array dal buffer. Dovrebbero emergere asciutti.

Quindi caricare i vetrini dell'array nei supporti dei vetrini dello scanner insieme alle protezioni per vetrini, quindi eseguire la scansione dei campioni. Secondo le istruzioni del produttore dell'array, ogni sonda su un array ibridato viene visualizzata come una miscela di fluorocromi rossi e verdi. I rapporti tra il segnale fluorescente rosso e verde per ciascuna sonda sono quantificati dallo scanner e il software associato li assegna come rapporti log due in base alla loro posizione genomica.

Le tracce di array risultanti consentono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciate. Ad esempio, in questa traccia di un bambino con sindrome di Williams, una sindrome da micro delezione ricorrente mediata da basse ripetizioni di copie nella regione prossimale del cromosoma sette, lo squilibrio genomico è stato identificato dal software con una linea rossa. Il rapporto logaritmico fluorescente dovrebbe raggrupparsi strettamente intorno allo zero, indicando un rapporto verde-rosso di uno a uno per le regioni normali del genoma.

Le tracce sparse di array, come osservato in questa scansione, possono causare un richiamo impreciso delle regioni anomale o una mancata identificazione dello squilibrio genomico e possono essere causate da una serie di fattori, tra cui la scarsa qualità del DNA, o la presenza di raggi, livelli di ozono nella sfera atmosferica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare i campioni dei pazienti per i test con A CGH e produrre dati di buona qualità per l'analisi a valle e il rilevamento della variazione del numero di copie.