Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti
21 febbraio 2015
Array CGH per la rilevazione di varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo G-fasciato. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizio diagnostico.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di organizzare l'ibridazione genomica comparativa per identificare gli squilibri nel genoma che possono portare a un'ampia varietà di malattie genetiche. Ciò si ottiene etichettando prima il DNA del paziente con un colorante fluorescente. Nella seconda fase, il paziente, il DNA e un DNA di riferimento diversamente marcato, vengono ibridati nell'array.
Successivamente, l'array viene scansionato per misurare la quantità di paziente e il DN di riferimento abbonda per ciascuna sonda. Nella fase finale, l'immagine scansionata viene elaborata per identificare le regioni del genoma in cui il DNA del paziente ha più o meno materiale rispetto all'array finale di DNA di riferimento. L'ibridazione genomica comparativa viene utilizzata per determinare se il paziente è portatore di una variante del numero di copie che provoca una sindrome genetica.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'assemblaggio del vetrino dell'array può essere difficile ed è facile per l'ibridazione. Mescolare la fuoriuscita dalla camera prima di iniziare la reazione di etichettatura. Scongelare la piastra a 96 pozzetti pronta all'uso di nucleotidi e primer a quattro gradi Celsius e al riparo dalla luce per circa un'ora.
Una volta scongelata, equilibrare la piastra coperta per altri 30 minuti a temperatura ambiente, equilibrare i campioni di DNA per 15 minuti a 60 gradi Celsius anche in questo momento. Mentre i campioni si riscaldano, utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per erogare abbastanza acqua priva di nucleasi in ciascun pozzetto di una nuova piastra da 96 pozzetti. Quindi, quando il DNA è pronto, trasferire un microgrammo di campione per pozzetto nella piastra d'acqua a 96 pozzetti.
Ora trasferisci 20 microlitri di nucleotidi equilibranti e primer su ciascuna delle piastre contenenti i campioni di DNA diluiti e sigilla la piastra con tappi a strisce avendo cura di sigillare ermeticamente. Successivamente, denaturare il DNA a 99 gradi Celsius in una macchina PCR con un coperchio riscaldato dopo 10 minuti e inginocchiare i primer raffreddando a scatto la piastra sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere 10 microlitri di enzima exo DNA polimerasi a ciascun campione.
Miscelare i campioni con la pipetta, quindi sigillare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo terminare la reazione con cinque microlitri di tampone di arresto per pozzetto, quindi rimuovere i nucleotidi non incorporati. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in singole provette da due millilitri pre-etichettate.
Caricare i campioni e le colonne di spin per la purificazione del DNA in un robot di elaborazione delle colonne di spin, nonché i tamponi associati appropriati. Secondo le istruzioni del produttore, il robot di elaborazione della colonna di centrifuga legherà il DNA marcato alla membrana di silice con 250 microlitri di tampone legante il DNA ad alto contenuto di sale per tubo, dopodiché le impurità verranno rimosse dalle membrane con due lavaggi da 500 microlitri di tampone di lavaggio ciascuno. Il robot aggiungerà quindi 15 microlitri di soluzione tampone a basso contenuto di sale alle membrane per recuperare i campioni di DNA purificati marcati in volumi di circa 12 microlitri per ibridare i campioni.
Quindi preriscaldare un forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e preriscaldare i vetrini di supporto e le camere di ibridazione. Per preparare la miscela di ibridazione, combinare 1,1 microlitri di culla 1D NA, 4,95 microlitri della miscela di blocco fornita dal produttore e 24,75 microlitri di tampone di ibridazione. Utilizzate il robot per la manipolazione dei liquidi per allocare questa miscela in ogni pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti, pre-bagnando ogni puntale per migliorare la precisione del trasferimento.
Pipettare successivamente 9,35 microlitri della firma appropriata, tre DNA marcato, seguiti da 9,35 microlitri della firma appropriata, cinque DNA marcato. Per ogni pozzetto sigillare la piastra, quattorsecare i campioni per un minuto e far girare rapidamente la piastra per raccogliere il contenuto sul fondo di ciascuno. Denaturare bene il DNA marcato in un incubatore di pre-ibridazione.
Prima per tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavorando su una piattaforma riscaldata a 42 gradi Celsius. Posizionare il vetrino di supporto nella camera di ibridazione, assicurandosi che la parte trasparente della guarnizione sia allineata con la parte finestrata della camera di ibridazione Utilizzando punte pre-bagnate.
Ora pipettare lentamente 42 microlitri della miscela di ibridazione al centro della posizione appropriata del vetrino di supporto dell'array. Fare attenzione che il liquido non tocchi il bordo dell'anello di gomma. Una volta che tutte le posizioni sono state riempite con cautela, abbassare il vetrino dell'array sul vetrino di supporto e assemblare la camera di ibridazione.
Facendo attenzione che il lato dell'array con la scritta sia rivolto verso il vetrino di supporto, serrare completamente la vite della camera di ibridazione e ispezionare la camera di ibridazione assemblata, confermando che non vi siano perdite di ibridazione. Mescolare al di fuori dei bordi dell'anello di gomma e che ogni bolla d'aria sia alta circa quattro millimetri. Quando la camera di ibridazione è appoggiata verticalmente sulla sua estremità, ruotare la camera di ibridazione per verificarlo.
Tutte le bolle d'aria in ogni posizione si muovono. Se una delle bolle è bloccata, dare un colpetto secco alla camera sul banco. Quindi posizionare le camere di ibridazione nel forno rotante a 65 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo immergere le camere di ibridazione in quello tampone di lavaggio e utilizzare un paio di pinze di plastica a bordo piatto per separare i vetrini. Quindi scartare i vetrini della guarnizione e posizionare i vetrini dell'array in un rack immerso in un tampone nuovo. Lavare i vetrini dell'array in circa 700 millilitri di tampone di lavaggio per uno-cinque minuti, mescolando energicamente con una pulce e una stella magnetica.
Quindi trasferire i vetrini dell'array a circa 700 millilitri di tampone di lavaggio, due per 90 secondi con un'agitazione più vigorosa alla fine del secondo lavaggio. Sollevare delicatamente le diapositive dell'array dal buffer. Dovrebbero emergere asciutti.
Quindi caricare i vetrini dell'array nei supporti dei vetrini dello scanner insieme alle protezioni per vetrini, quindi eseguire la scansione dei campioni. Secondo le istruzioni del produttore dell'array, ogni sonda su un array ibridato viene visualizzata come una miscela di fluorocromi rossi e verdi. I rapporti tra il segnale fluorescente rosso e verde per ciascuna sonda sono quantificati dallo scanner e il software associato li assegna come rapporti log due in base alla loro posizione genomica.
Le tracce di array risultanti consentono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciate. Ad esempio, in questa traccia di un bambino con sindrome di Williams, una sindrome da micro delezione ricorrente mediata da basse ripetizioni di copie nella regione prossimale del cromosoma sette, lo squilibrio genomico è stato identificato dal software con una linea rossa. Il rapporto logaritmico fluorescente dovrebbe raggrupparsi strettamente intorno allo zero, indicando un rapporto verde-rosso di uno a uno per le regioni normali del genoma.
Le tracce sparse di array, come osservato in questa scansione, possono causare un richiamo impreciso delle regioni anomale o una mancata identificazione dello squilibrio genomico e possono essere causate da una serie di fattori, tra cui la scarsa qualità del DNA, o la presenza di raggi, livelli di ozono nella sfera atmosferica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare i campioni dei pazienti per i test con A CGH e produrre dati di buona qualità per l'analisi a valle e il rilevamento della variazione del numero di copie.
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Panoramica
Questo articolo discute l'ibridizzazione genomica comparativa su array (aCGH) come metodo per rilevare le varianti del numero di copie genomiche, che ha in gran parte sostituito l'analisi tradizionale del cariotipo a bande G. La procedura mira a identificare gli squilibri genomici che possono portare a varie malattie genetiche.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Genomica
- Diagnostica genetica
- Ibridizzazione genomica comparativa
Sfondo
- L'aCGH è una tecnica moderna per analizzare le variazioni genomiche.
- Fornisce una visione più dettagliata degli squilibri genomici rispetto ai metodi tradizionali.
- La tecnologia è cruciale per la diagnosi delle sindromi genetiche.
- L'etichettatura fluorescente del DNA è un passaggio chiave nel processo.
Scopo dello studio
- Identificare le varianti del numero di copie nei genomi dei pazienti.
- Migliorare l'accuratezza diagnostica per le malattie genetiche.
- Dimostrare l'applicazione dell'aCGH in un ambiente di laboratorio clinico.
Metodi utilizzati
- Etichettatura del DNA del paziente con coloranti fluorescenti.
- Ibridazione del DNA del paziente e di riferimento a un array.
- Scansione dell'array per misurare il legame del DNA alle sonde.
- Elaborazione delle immagini scansionate per identificare le regioni genomiche con squilibri.
Risultati principali
- Identificazione di regioni genomiche con variazioni del numero di copie.
- Dimostrazione dell'efficacia dell'aCGH nella diagnosi di sindromi genetiche.
- Confronto del DNA del paziente con un riferimento per rilevare squilibri.
- Validazione dell'affidabilità del metodo in un contesto diagnostico.
Conclusioni
- L'aCGH è uno strumento potente per la diagnostica genetica.
- La tecnica migliora la comprensione delle malattie genetiche.
- Rappresenta un significativo progresso rispetto ai metodi di cariotipo tradizionali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Array CGH enables high-resolution detection of genomic copy number variants, supporting target validation in genetic disease research by providing quantitative, genome-wide imbalance data. This method enhances predictive confidence in preclinical models by identifying pathogenic variants linked to syndromes, informing mechanistic de-risking and portfolio prioritization in early discovery. Its clinical diagnostic utility translates to biomarker-aligned assay development for rare disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting pathogenic copy number variants across the genome.
- Operational Value: Provides quantitative red-to-green fluorescence ratios for precise imbalance measurement per probe.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through high-density oligonucleotide arrays targeting clinically relevant loci.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via purified, labeled DNA hybridization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled washing, scanning, and log-two ratio analysis.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by detecting genomic imbalances that may confound phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying syndromes like Williams syndrome through recurrent microdeletion detection.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent reference DNA comparison.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating genomic stability in model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, where genomic integrity assessment informs lead identification and disease model suitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying copy number alterations in disease-associated genes.
- Screening: Describes assay readiness through hybridization buffer preparation and probe-level signal quantification.
- Analytics: Highlights log-two ratio outputs that enable comparison of patient versus reference DNA across genomic positions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating genomic backgrounds in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability for batch processing of patient or model system samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence imaging.
- Needs microarray scanner, liquid handling robot, and hybridization oven infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe selection, washing protocols, and ratio threshold setting.
- Requires adaptation considerations for varying DNA input quality and sample types (blood, saliva, tissue).
- Practical limitations include sensitivity to DNA purity, ozone levels, and bubble formation during hybridization.
