Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

L'obiettivo generale di questa procedura è l'uso dell'ibridazione genomica comparativa su matrice (array comparative genomic hybridization) per identificare squilibri nel genoma che possono causare una vasta gamma di malattie genetiche. Questo viene ottenuto etichettando innanzitutto il DNA del paziente con un colorante fluorescente. Nel secondo passaggio, il DNA del paziente e un DNA di riferimento etichettato in modo diverso vengono ibridati sulla matrice.

Successivamente, l'array viene scansionato per misurare la quantità di DNA del paziente e del campione di riferimento legata a ciascuna sonda. Nell'ultima fase, l'immagine scansionata viene elaborata per identificare le regioni del genoma in cui il DNA del paziente presenta una quantità maggiore o minore di materiale rispetto al DNA di riferimento nell'array finale. L'ibridazione genomica comparativa viene utilizzata per determinare se il paziente è portatore di una variante nel numero di copie che determina un disturbo genetico.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'assemblaggio della matrice su vetrino può risultare difficoltoso e vi è il rischio che l'ibridazione fuoriesca dalla camera prima di iniziare la reazione di marcatura. Scongelare la piastra da 96 pozzetti pronta all'uso contenente nucleotidi e primer a quattro gradi Celsius e al riparo dalla luce per circa un'ora.

Dopo lo scongelamento, equilibrare la piastra coperta per altri 30 minuti a temperatura ambiente; in questo periodo, equilibrare i campioni di DNA per 15 minuti a 60 gradi Celsius. Mentre i campioni si riscaldano, utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere una quantità sufficiente di acqua priva di nucleasi in ogni pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti. Successivamente, quando il DNA è pronto, trasferire un microgrammo di campione per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti contenente acqua.

Ora trasferire 20 microlitri dei nucleotidi e degli iniziatori in equilibrio in ciascuna delle pozzette della piastra contenente i campioni di DNA diluiti e sigillare la piastra con tappi a striscia avendo cura di ottenere un sigillo ermetico. Successivamente, denaturare il DNA a 99 gradi Celsius in un termociclatore con coperchio riscaldato per 10 minuti e far annealare gli iniziatori rapidamente raffreddando la piastra sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per aggiungere 10 microlitri dell'enzima DNA polimerasi clean out exo a ciascun campione.

Mescolare i campioni mediante pipetta, quindi sigillare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, arrestare la reazione aggiungendo cinque microlitri di tampone di arresto per pozzetto. Rimuovere quindi i nucleotidi non incorporati. Trasferire il contenuto di ogni pozzetto in singole provette da due millilitri precedentemente etichettate.

Caricare i campioni e le colonne di purificazione del DNA nei robot per colonne di centrifugazione, insieme ai rispettivi tamponi appropriati. Secondo le istruzioni del produttore, il robot per colonne di centrifugazione lega il DNA marcato alla membrana in silice utilizzando 250 microlitri di tampone di legame del DNA ad alto contenuto salino per provetta; successivamente, le impurità vengono rimosse dalle membrane mediante due lavaggi con 500 microlitri di tampone di lavaggio ciascuno. Il robot aggiungerà quindi 15 microlitri di tampone a basso contenuto salino alle membrane per recuperare i campioni di DNA marcato purificato in volumi approssimativi di 12 microlitri, da utilizzare per l'ibridazione dei campioni.

Riscaldare in anticipo un fornetto di ibridazione a 65 gradi Celsius e preriscaldare le lamelle di supporto e le camere di ibridazione. Per preparare la miscela di ibridazione, unire 1,1 microlitri di cot 1D NA, 4,95 microlitri della miscela bloccante fornita dal produttore e 24,75 microlitri di tampone di ibridazione. Utilizzare il robot per la manipolazione dei liquidi per distribuire questa miscela in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti, bagnando preventivamente ogni punta per migliorare la precisione del trasferimento.

Successivamente pipettare 9,35 microlitri del corrispondente segnale, DNA etichettato con tre etichette, seguito da 9,35 microlitri del corrispondente segnale, DNA etichettato con cinque etichette. Sigillare ogni pozzetto, centrifugare i campioni per un minuto e dare una breve centrifugazione per raccogliere il contenuto sul fondo di ciascun pozzetto. Denaturare il DNA etichettato in un incubatore pre-ibridazione.

Prima per tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavorare su una piattaforma riscaldata a 42 gradi Celsius. Posizionare il vetrino di supporto nella camera di ibridazione, assicurandosi che la parte trasparente della guarnizione sia allineata con la parte finestra della camera di ibridazione, utilizzando punte pre-umidificate.

Ora pipettare lentamente 42 microlitri della miscela di ibridazione al centro della posizione appropriata della lamellina di supporto dell'array, facendo attenzione che il liquido non tocchi il bordo dell'anello di gomma. Una volta riempite tutte le posizioni, abbassare con cura la lamellina dell'array sulla lamellina di supporto e assemblare la camera di ibridazione.

Assicurarsi che il lato dell'array con la scritta sia rivolto verso la lamellina di supporto, quindi serrare completamente la vite della camera di ibridazione ed esaminare la camera assemblata, verificando che non vi sia fuoriuscita di ibrido al di fuori dei limiti dell'anello di gomma e che ogni bolla d'aria abbia un'altezza di circa quattro millimetri. Quando la camera di ibridazione è posizionata verticalmente su una delle estremità, ruotarla per effettuare il controllo.

Tutte le bolle d'aria in ogni posizione si stanno muovendo. Se alcune bolle sono bloccate, date un colpetto deciso alla camera sul banco. Quindi posizionate le camere di ibridazione nel forno rotante a 65 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo immergere le camere di ibridazione nel buffer di lavaggio uno e utilizzare una pinzetta di plastica con bordi piatti per separare i vetrini. Quindi scartare i vetrini con guarnizione e posizionare i vetrini con array in una rastrelliera, immergendoli in buffer fresco uno. Lavare i vetrini con array in circa 700 millilitri di buffer di lavaggio per uno a cinque minuti, agitando vigorosamente con un agitatore magnetico a forma di pulce.

Quindi trasferire le lamelle con l'array in circa 700 millilitri di soluzione di lavaggio, due volte per 90 secondi, con un'agitazione più vigorosa alla fine del secondo lavaggio. Sollevare delicatamente le lamelle con l'array dalla soluzione. Devono emergere asciutte.

Quindi caricare le lamelle con i microarray nei supporti per lamelle del lettore insieme ai protettori per lamelle, quindi scansionare i campioni. Secondo le istruzioni del produttore del microarray, ogni sonda su un array ibridato viene visualizzata come una miscela di fluorocromi rosso e verde. I rapporti tra segnale fluorescente rosso e verde per ciascuna sonda vengono quantificati dal lettore e il software associato li rappresenta come logaritmi in base due in funzione della loro posizione genomica.

Gli allineamenti risultanti consentono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciate. Ad esempio, in questo tracciato proveniente da un bambino affetto da sindrome di Williams, una sindrome da microdelezione ricorrente mediata da ripetizioni con basso numero di copie nella regione prossimale del cromosoma sette, lo sbilanciamento genomico è stato identificato dal software mediante una linea rossa. Il valore logaritmico del rapporto fluorescente (prop) dovrebbe raggrupparsi strettamente intorno allo zero, indicando un rapporto verde su rosso pari a uno a uno per le regioni normali del genoma.

Tracce di matrice disperse, come quelle osservate in questa scansione, possono portare a un'identificazione inaccurata delle regioni anomale o a un mancato riconoscimento dello squilibrio genomico, ed essere causate da diversi fattori, tra cui la scarsa qualità del DNA o la presenza di raggi, livelli di ozono nell'atmosfera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come processare campioni di pazienti per l'analisi mediante A CGH e produrre dati di alta qualità per l'analisi successiva e il rilevamento di variazioni del numero di copie.