Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic
5 agosto 2008
Questo video è una dimostrazione tecnico del protocollo di ibridazione per intero genoma piastrelle CGH array di percorso, che analizza l'intero genoma umano utilizzando solo 25-100 ng di DNA che può essere isolato da una varietà di fonti, tra cui materiale d'archivio formalina fisso.
La seguente breve presentazione è un video che mostra il protocollo di ibridazione per l'array di submegabase da 27 K. Questo array o smart array è composto da 26.946 cloni posteriori sequenziati singolarmente stampati su un singolo vetrino. Vengono individuati in duplicato per un totale di 54.000 elementi per diapositiva stampati in un'area di 18 x 54 millimetri.
I dati risultanti sono paragonabili agli array di oligo ad alta densità senza richiedere l'interpretazione dei dati da parte della bioinformatica. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di un array di inserti di grandi dimensioni, come i cloni posteriori, è che consente l'uso di un minimo di 100 nanogrammi di DNA campione senza amplificazione. Ciò consente l'analisi di una varietà di campioni, come il DNA proveniente da sangue congelato, tessuti, cellule selezionate e materiale FFPE.
Lo smart array si è dimostrato utile in ambito clinico. Presso la BC Cancer Agency, l'analisi di più campioni di pazienti è facilmente inserita nella settimana lavorativa media. Per la citogenetica.
La maggior parte dei passaggi utilizzati nell'array CGH sono simili al CGH convenzionale o al pesce. Consentendo una rapida introduzione del protocollo nei laboratori consolidati. La qualità del DNA è la singola più grande influenza sui risultati negli array.
L'ibridazione CGH, la scarsa qualità o il DNA contaminato influenzeranno negativamente l'incorporazione del PSI nel prodotto, con conseguente oscuramento delle immagini o rumore nei dati. Lo spettrofotometro NanoDrop è uno strumento eccellente per valutare la qualità del DNA prima dell'ibridazione. Per quantificare il set di DNA, il NanoDrop per misurare l'acido nucleico e la modalità per misurare il DNA 50 in bianco, il NanoDrop con 1,5 microlitri della stessa soluzione del campione risospeso.
In questo caso, si tratta di Tris d'acqua. È stato dimostrato che l'EDTA ha potenziali effetti negativi sull'incorporazione del PS D. Rimuovere la salvietta vuota con una salvietta Kim e aggiungere 1,5 microlitri del campione di misura e registrare la concentrazione del campione.
La lettura di due 60 su due 80 sul NanoDrop è un buon indicatore della qualità del DNA dove un rapporto di 1,8 è ottimale. Il metodo del doppio rapporto: due 60 su due 80 e due 60 su due 30 offre un modo ancora migliore per determinare la purezza dei campioni. Il NanoDrop visualizza una curva che rappresenta l'assorbanza relativa alla lunghezza d'onda.
Una curva liscia senza picchi è indicativa di una buona qualità della pulizia del DNA e pulire il NanoDrop con acqua e una salvietta Kim o, se il campione è limitante, pipettare il campione dal piedistallo. Questo protocollo è ottimizzato per un campione compreso tra 100 e 400 nanogrammi. 200 nanogrammi è la quantità target per un DNA di buona qualità Per etichettare il campione sono necessari i seguenti reagenti e attrezzature.
Tampone SCI, tre SCI cinque ER casuali, 10 volte DNTP, mix di riferimento, DNA, acqua sterile da 0,2 microlitri, provette sterili per PCR, blocco di calore del ghiaccio a 100 gradi Celsius, incubatore a 45 gradi Celsius. Impostare una provetta di reazione per il DNA di riferimento e una provetta di reazione. Per il DNA campione, saranno etichettati rispettivamente con sci-fi e SCI tre.
In un contesto di ricerca, preferiamo utilizzare il CY 3 per il nostro DNA campione in quanto è più resistente alla degradazione dell'ozono. Combina l'acqua del DNA e il tampone del canale al campione e ripeti l'operazione per il DNA di riferimento. Nel nostro laboratorio, combiniamo il buffer 10 volte con l'Optimus casuale.
Per creare una soluzione in cinque tempi, aggiungere acqua sterile per un volume totale di 17 microlitri. Trasferire i tubi in un blocco termico, denaturare per cinque minuti a 100 gradi Celsius. Trasferire immediatamente sul ghiaccio.
Aggiungere quattro microlitri di miscela DNTP 10 volte. Aggiungi gli occhi laterali. Aggiungere due microlitri di SCI tre DCTP marcati per campionare il DNA.
Aggiungi due microlitri di DCTP marcato fantascientifico per fare riferimento al DNA. Aggiungere 2,5 microlitri di canale e mescolare. La soluzione può essere miscelata a mano o a vortice.
Far girare brevemente la soluzione fino al fondo della provetta con un impulso rapido in una centrifuga da banco. Trasferire in forno e incubare a 37 gradi per una notte. Il tempo di ibridazione notturno può essere regolato tra 14 e 24 ore senza influire negativamente sul processo di etichettatura.
Per adattare un programma di laboratorio utilizzando una colonna MicroCon YM 30, aggiungere 100 microlitri di 1D NA catturati alla colonna. Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta della pipetta bloccata. È noto che la varianza del DNA da lotto a lotto si verifica anche quando viene acquistato dai principali distributori.
Si consiglia di acquistare e testare grandi lotti prima dell'uso. Ora ci saranno due provette per ogni ibridazione del campione, una colorata di blu e una di colore rosso. Combinare le provette per ogni campione e miscelare mediante pipettaggio.
Quindi trasferire l'intera soluzione sulla membrana MicroCon. Posizionare la colonna nella provetta MicroCon in dotazione e centrifugare a 13.000 G per 10 minuti. La colonna MicroCon è una colonna di esclusione dimensionale e intrappola il DNA con i coloranti laterali incorporati e consente ai coloranti non incorporati di passare attraverso la membrana.
Per lavare eventuali nucleotidi residui non incorporati o laterali, aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sterile alla membrana. Centrifugare nuovamente a 13.000 g Per 10 minuti. Scartare la provetta e aggiungere 45 microlitri di soluzione di ibridazione alla parte superiore della colonna concentratrice MicroCon.
La soluzione di ibridazione che utilizziamo è Dig Easy di Roche Scientific che può essere aggiunta alla soluzione anche lo sperma di aringa condiviso da cinque microlitri. Tradizionalmente, questo veniva utilizzato per bloccare il legame non competitivo alla superficie dello scivolo. L'avvento di nuove sostanze leganti ha permesso l'eliminazione di questo passaggio.
Tuttavia, a volte viene aggiunto per aumentare la viscosità della soluzione di ibridazione. Capovolgere la colonna MicroCon e inserirla in una nuova provetta etichettata. Centrifugare il tubo a 3000 g per tre minuti.
La soluzione si accumulerà sul fondo del nuovo tubo. 1,5 microlitri della soluzione saranno utilizzati per la quantificazione dell'incorporazione SD. Impostare NanoDrop Su analisi microarray, vuoto.
Il NanoDrop con 1,5 microlitri di scavo. Facile ibridazione Buffer. Misura il grezzo con il NanoDrop.
La lettura deve essere zero. Rimuovi la salvietta vuota con una salvietta kim e aggiungi 1,5 microlitri della misura del campione e registra l'incorporazione del campione. Il NanoDrop ti darà una concentrazione di mole PICA per microlitro di entrambi i campioni di incorporazione di coloranti S3 e fantascientifici con incorporazioni sottostanti.
Tre ole per microlitro dovrebbero essere considerati come avere troppo pochi Fluor quattro Per continuare, il NanoDrop visualizzerà un grafico dell'assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda. Due picchi dovrebbero essere visibili, uno per ciascuno degli occhi laterali, pulire e pulire il NanoDrop con acqua e una salvietta kim. Posizionare il coperchio, infilarlo su uno scaldavetrini o preriscaldare a 45 gradi Celsius per mantenere la temperatura di ibridazione.
Posizionare 42 microlitri di soluzione della sonda sul vetrino coprioggetto da 22 millimetri per 60 millimetri. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella soluzione. Un trucco rapido per rimuovere una bolla ostinata è prendere un nuovo vetrino coprioggetti e far scoppiare la bolla con un angolo acuto.
Allineare il vetrino sul vetrino coprioggetto e sulla soluzione della sonda. Abbassare un bordo del carrello, consentendo il contatto con la soluzione di ibridazione. Continuare ad abbassare un bordo fino a quando il vetrino coprioggetto non si attacca al vetrino con tensione superficiale.
Invertire la diapositiva. Posizionare il vetrino in una cassetta di ibridazione, preriscaldare a 45 gradi Celsius e aggiungere 10 microlitri di acqua nella scanalatura inferiore per controllare l'umidità. Questo passaggio dovrebbe essere praticato poiché lo scavo facile cristallizza a temperature più basse e lascerà uno sfondo sullo scivolo.
Ciò è particolarmente importante quando la soluzione si trova sul vetrino in quanto si tratta di uno strato molto sottile di liquido. A questo punto, sigillare la cassetta e incubare per 36-40 ore a 45 gradi Celsius. La rimozione del vetrino dalla cassetta di ibridazione è fondamentale.
Scavare, cristallizza facilmente a temperatura ambiente. Il vetrino deve essere immediatamente immerso e il vetrino coprioggetti deve essere rimosso nella soluzione di lavaggio. Tutte le soluzioni di lavaggio devono essere preconfezionate e avere un pH di sette, il pH non neutro può degradare gli occhi laterali.
Preriscaldare la soluzione di lavaggio a 45 gradi Celsius. Aggiungere circa 60 millilitri di soluzione di lavaggio in un barattolo di Copeland prima di aprire la camera di ibridazione. Aprire la camera.
Rimuovere il vetrino con una pinzetta e aggiungere il vetrino alla soluzione di lavaggio. Con il vetrino coprioggetto ancora attaccato, attendere da 10 a 20 secondi e recuperare il vetrino coprioggetto con una pinzetta. Avrebbe dovuto cadere dallo scivolo.
Si tratta di un passaggio importante in quanto impedisce la cristallizzazione del tampone facile da scavo e riduce qualsiasi potenziale graffio del carrello mediante la rimozione meccanica del vetrino coprioggetti. Lavare il vetrino tre volte in soluzione di lavaggio. Un minuto ciascuno con agitazione.
Sciacquare il vetrino tre volte. Non dovrebbero esserci bolle residue della SDS nella soluzione di lavaggio visibili dopo l'ultimo lavaggio. Lasciare il vetrino nella soluzione di lavaggio fino al momento della centrifugazione.
Centrifugare in una provetta Falcon da 50 millilitri a 700 g per un minuto. Assicurarsi che il tubo Falcon sia asciutto prima dell'uso. Scansionare immediatamente il vetrino poiché l'intensità del segnale diminuirà nel tempo.
A seconda dei livelli di ozono ambientale, ogni scanner è diverso, ma ci sono alcune linee guida comuni da seguire. Per l'imaging di vetrini. I livelli di ozono ambientale sono fondamentali durante il processo di scansione.
Il die fantascientifico è sensibile all'ozono e si degrada rapidamente durante un lungo tempo di scansione. È stato dimostrato che cinque parti per miliardo di ozono influenzano l'S 5. Ciò equivale all'inquinamento da traffico leggero in una giornata limpida.
Si consiglia di utilizzare i misuratori di ozono per registrare i livelli di ozono ambientale. Viene creata un'immagine separata per ogni canale S3 e SCI cinque. I canali possono essere bilanciati modificando l'esposizione, il tempo, l'eccitazione, l'input o la sensibilità di acquisizione dello scanner.
Queste immagini sono ora pronte per l'analisi.
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Panoramica
Questo video dimostra il protocollo di ibridizzazione per un array CGH di tiling path del genoma completo, consentendo la scansione dell'intero genoma umano con un input di DNA minimo. Il metodo permette l'analisi di vari tipi di campioni, inclusi materiali di archivio.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Genomica
- Analisi del DNA
- Tecniche di ibridizzazione
Sfondo
- L'array è composto da 26.946 cloni di ritorno sequenziati individualmente.
- Ogni diapositiva contiene un totale di 54.000 elementi.
- I dati ottenuti sono paragonabili agli array oligo ad alta densità.
- L'interpretazione bioinformatica non è necessaria per l'analisi dei dati.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un protocollo di ibridizzazione per la scansione del genoma.
- Utilizzare campioni di DNA minimi per un'analisi genomica completa.
- Facilitare l'uso di diversi tipi di campioni negli studi genomici.
Metodi utilizzati
- Protocollo di ibridizzazione per array CGH di tiling path del genoma completo.
- Utilizzo di 25-100 ng di DNA da varie fonti.
- Applicazione di cloni di ritorno applicati in duplicato sulle diapositive.
- Analisi dei campioni senza amplificazione.
Risultati principali
- Scansione riuscita del genoma umano con basso input di DNA.
- Capacità di analizzare DNA da sangue, tessuti congelati e materiale FFPE.
- Qualità dei dati paragonabile agli array a più alta densità.
- Analisi facilitata senza estesi requisiti bioinformatici.
Conclusioni
- Il protocollo di ibridizzazione è efficace per l'analisi su larga scala del genoma.
- I requisiti minimi di DNA ampliano la gamma di tipi di campioni.
- Questo metodo migliora l'accessibilità alla ricerca genomica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
