Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le alterazioni del numero di copie del DNA su scala megabase in singole cellule. Al fine di classificare l'eterogeneità genomica nelle popolazioni cellulari, è necessario identificare i cambiamenti genomici alla risoluzione di una singola cellula. Tradizionalmente, questo è stato ottenuto utilizzando approcci citologici, tuttavia, questi metodi erano limitati nella loro sensibilità e specificità.

Il sequenziamento di singole cellule può rilevare una varietà di cambiamenti genomici, con una maggiore sensibilità e specificità rispetto agli approcci precedenti, ma solo se eseguito con attenzione. In questo articolo, descriviamo come utilizzare il sequenziamento di singole cellule per rilevare in modo affidabile le alterazioni del numero di copie su scala megabase nelle singole cellule. Per assemblare il microaspiratore, iniziare rimuovendo l'estremità in plastica trasparente dal gruppo del tubo dell'aspiratore e inserire l'estremità stretta in un'estremità di un tubo in PVC lungo un piede con un diametro interno di 3/16 di pollice.

Inserire l'uscita di un filtro per siringa da 0,2 micrometri nell'altra estremità del tubo in PVC lungo un piede con un diametro interno di 3/16 di pollice. Quindi inserire l'ingresso del filtro per siringa da 0,2 micrometri in un'estremità di un tubo in PVC lungo sei pollici con un diametro interno di 5/16 di pollice. Rompere una pipetta sierologica di plastica da cinque millilitri alla graduazione di un millilitro e inserire l'estremità rotta nell'estremità aperta del tubo in PVC con il diametro interno di 5/16 di pollice.

Quindi, inserire l'uscita della pipetta sierologica di plastica da cinque millilitri nell'estremità flessibile di un tubo di aspirazione, quindi utilizzare un tubo di plastica sterile per coprire il boccaglio rosso del tubo per la conservazione. Estrarre un tubo capillare di vetro fino a un diametro interno di 10-30 micrometri posizionando il centro del tubo vicino a una fiamma e applicando tensione su entrambe le estremità del tubo. Rompere il tubo aspirato in due metà per creare due potenziali aghi di aspirazione.

Ripetere questo passaggio con diverse provette per assicurarsi che venga preparato un numero sufficiente di aghi con un diametro interno appropriato per il prelievo di singole cellule. Per preparare le cellule di aderenza, come le linee cellulari di fibroblasti umani, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e trasferire le cellule in una provetta conica contenente il terreno appropriato. Installare una cappa per l'amplificazione dell'intero genoma utilizzando candeggina al 10% per spruzzare sulla superficie della cappa, sulle scatole dei puntali delle pipette e sui puntali delle pipette.

Quindi usa un tovagliolo di carta per pulirli tutti prima di ripetere il lavaggio con etanolo al 70%. Aggiungi otto microlitri di acqua dal kit di amplificazione dell'intero genoma, o WGA, ai singoli pozzetti a una piastra PCR da 96 pozzetti. Quindi coprire la piastra PCR a 96 pozzetti con un coperchio di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e posizionare la piastra sul ghiaccio.

Quindi, aggiungi 1.000 cellule a 10 millilitri di terreno o PBS in una piastra di Petri da 15 centimetri e posiziona la piastra sul ghiaccio per evitare che le cellule aderiscano alla capsula. Quindi, mentre sono ancora sul ghiaccio, trasferire le cellule nella piastra di Petri e la piastra PCR a 96 pozzetti in un microscopio ottico con un obiettivo 10X. Aumentare l'apertura dell'ago dell'aspiratore picchiettando delicatamente l'estremità tirata fuori dell'ago su una superficie dura in modo che la punta si rompa.

Quindi inserire l'estremità larga dell'ago nell'estremità trasparente del microaspiratore. Quindi, posizionare la capsula di Petri contenente le cellule sul tavolino del microscopio. Inserire il bocchino rosso dell'aspiratore in bocca.

Quindi, durante l'utilizzo si doveva spostare l'ago dell'aspiratore e l'altra mano per spostare la capsula di Petri, identificare le singole cellule da sequenziare. Usando l'aspirazione a bocca, aspirare una singola cellula nell'ago dell'aspiratore insieme a circa uno o due microlitri di terreno o PBS. Trasferire la cellula negli otto microlitri d'acqua in un singolo pozzetto della piastra PCR a 96 pozzetti.

La qualità e l'utilità dei dati di sequenziamento di singole cellule dipende dallo stato di ciascuna cellula e del suo genoma, pertanto, prestare attenzione durante la preparazione delle cellule e la microaspirazione per isolare le cellule vitali e non apoptotiche. Dopo aver aspirato ciascuna cellula e averla trasferita in un pozzetto della piastra PCR, contrassegnare il pozzetto che ha ricevuto una cellula. Ripetere l'operazione per il numero di celle desiderato.

Nel frattempo, scongelare il tampone di frammentazione per lisi a cellula singola 10X dal kit di amplificazione dell'intero genoma. Per evitare la contaminazione durante l'amplificazione dell'intero genoma, aggiungere tutti i reagenti all'interno di una cappa di coltura tissutale. Utilizzare i puntali delle pipette con i filtri e sostituire il puntale della pipetta tra i pozzetti.

Per ogni set di un massimo di 32 cellule, combinare 32 microlitri di tampone di lisi e frammentazione a cellula singola 10X e due microlitri di soluzione di proteinasi K in una provetta da microcentrifuga, quindi agitare la provetta per mescolare il contenuto. Aggiungere un microlitro di soluzione a ciascun pozzetto e pipettare su e giù per mescolare. Coprire la piastra e utilizzare una pellicola di plastica per sigillare tutti i pozzetti.

Quindi centrifugare brevemente la piastra in una mini centrifuga. Quindi, far passare la piastra attraverso il termociclatore utilizzando il seguente programma. Quindi raffreddare il piatto con ghiaccio e centrifugarlo brevemente.

Per preparare una soluzione tampone funzionante per la preparazione della libreria dal kit di amplificazione dell'intero genoma, per ogni cellula, combinare due microlitri di tampone per la preparazione della libreria a cellula singola 1X e un microlitro di soluzione di stabilizzazione della libreria. Un'adeguata lisi cellulare e la completa frammentazione del genoma sono fondamentali per ridurre al minimo le distorsioni durante l'amplificazione dell'intero genoma e garantire la preparazione di librerie di sequenziamento di alta qualità. Pertanto, fai attenzione a eseguire questi passaggi esattamente come scritto.

Togliete la pellicola di plastica dal piatto e aggiungete tre microlitri di soluzione a ciascun pozzetto. Pipettare il contenuto del pozzetto su e giù per mescolare, quindi sostituire la pellicola di plastica. Dopo aver fatto girare brevemente la piastra, incubare le cellule a 95 gradi Celsius per due minuti, quindi raffreddare la piastra con ghiaccio e centrifugare nuovamente brevemente la piastra.

Ora, rimuovi la pellicola di plastica, aggiungi un microlitro di enzima per la preparazione della libreria a ciascun pozzetto e pipetta il contenuto del pozzetto su e giù per mescolare, quindi sostituisci la pellicola di plastica. Dopo aver girato brevemente la piastra, inserirla nel termociclatore ed eseguire il seguente programma. Dopo aver raffreddato la piastra e aver fatto una breve centrifuga, preparare una miscela di amplificazione funzionante dal kit di amplificazione dell'intero genoma combinando 48,5 microlitri di acqua, 7,5 microlitri di master mix di amplificazione 10X e 5 microlitri di DNA polimerasi WGA, per ogni cellula.

Mantenere il composto di lavoro sul ghiaccio. Rimuovere la pellicola di plastica dalla piastra. Aggiungere 61 microlitri della miscela di amplificazione di lavoro a ciascun pozzetto e pipettare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù per mescolare, quindi sostituire la pellicola di plastica.

Centrifugare brevemente la piastra e termociclare come segue. Sequenziare i campioni ed eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo. Come dimostrato in questa figura, se l'amplificazione dell'intero genoma ha successo, il campione apparirà come uno striscio su un gel di agarosio.

Uno striscio debole o assente indica una reazione di amplificazione fallita e il campione non deve essere sequenziato. Come mostrato qui, l'analisi delle dimensioni dei frammenti è stata effettuata utilizzando l'elettroforesi capillare su un analizzatore di frammenti. Le librerie preparate con successo avranno una distribuzione piuttosto uniforme delle dimensioni dei frammenti da 150 a 900 coppie di basi.

La preparazione della libreria non riuscita comporterà una distribuzione delle dimensioni del frammento distorta e tali librerie non devono essere sequenziate. Utilizzando il modello di Markov nascosto e la segmentazione binaria circolare, il genoma di ciascuna cellula è stato analizzato in segmenti del numero di copie stimato. Questa tabella mostra i risultati sovrapposti da una singola cellula e rivela un guadagno sul cromosoma 10 da 67 a 130 megabasi e un guadagno sul cromosoma 19 da 0 a 20 megabasi.

L'isolamento e l'amplificazione dell'intero genoma di singole cellule possono e devono essere eseguiti in un solo giorno. La preparazione delle librerie di sequenziamento, il sequenziamento dell'intero genoma e l'analisi dei dati possono quindi essere eseguiti in base a un programma flessibile. Quando l'isolamento cellulare e l'amplificazione dell'intero genoma vengono eseguiti correttamente e l'analisi dei dati viene eseguita rigorosamente come descritto, le alterazioni del numero di copie superiori a cinque megabasi possono essere rilevate con elevata sensibilità e specificità.

Sebbene il nostro protocollo descriva specificamente l'uso del sequenziamento di singole cellule per il rilevamento di alterazioni del numero di copie, aspetti di questo protocollo, come l'isolamento di singole cellule e la preparazione della libreria, possono essere applicati per rilevare altri cambiamenti genomici.