Name: Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri il sequenziamento single cell per rilevare alterazioni del numero di copie del DNA su scala megabase con maggiore sensibilità e specificità rispetto ai metodi citologici tradizionali.

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Ringraziamo Stuart Levine dei commenti a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant GM056800 e Kathy e Curt marmo Cancer Research Fund di Angelika Amon e in parte dalla Koch Institute sovvenzioni P30-CA14051. Angelika Amon è anche un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute e la Fondazione Glenn per la ricerca biomedica. KAK è supportato dal NIGMS formazione di Grant T32GM007753.

1. isolare le cellule singole <ol><li> Preparare il microaspirator <ol><li> Rimuovere la fine di plastica trasparente dal gruppo del tubo di aspirazione e inserire l&#39;estremità più stretta in una estremità di un 1 piede lungo tubo in PVC con &quot;diametro interno 3/16. </li><li> Inserire l&#39;uscita di un filtro a siringa da 0,2 micron nell&#39;altra estremità del 1 piede lungo tubo in PVC con &quot;diametro interno 3/6. </li><li> Inserire l&#39;ingresso del filtro a siringa da 0,2 micron in una estremità di un 6 pollici di lunghezza tubo in PVC con &quot;diametro interno 5/16. </li><li> Opzionale: Tagliare il tubo da 6 pollici a lungo PVC con &quot;diametro interno 5/16 a metà e inserire un sifone in linea tra le due metà. </li><li> Rompere una pipetta da 5 ml in plastica sierologica al 1 ml laurea e inserire l&#39;estremità rotta nell&#39;estremità aperta del tubo in PVC con &quot;diametro interno 5/16. </li><li> Inserire l&#39;uscita della pipetta sierologica 5 mL di plastica nella estremità flessibile di un gruppo del tubo aspiratore (dove l&#39;estremità di plastica trasparenteera stato rimosso). </li><li> Per la conservazione, coprire il boccaglio rosso del gruppo del tubo di aspirazione con un tubo di plastica sterile. </li><li> Disegnare un capillare di vetro ad un diametro interno di 10-30 micron portando la metà del tubo in prossimità di un becco Bunsen e applicando tensione su entrambe le estremità del tubo. Rompere il tubo trafilato in mezzo per creare due potenziali aghi aspiratore. Ripetere questa operazione con diversi tubi in quanto solo alcuni tubi finirà con un diametro interno che è appropriato per la raccolta di singole cellule. </li><li> Per lo stoccaggio, posizionare due strisce di plastilina in una capsula di Petri 15 centimetri e fissare gli aghi di aspirazione attraverso le strisce. </li></ol></li><li> raccogliere le cellule <ol><li> Preparare una sospensione singola cella come appropriato per il tipo di cella e sperimentare. Ad esempio, per preparare cellule aderenti, come le linee umani fibroblasti cellule, le cellule di raccolta di cellule tripsinizzazione e trasferirli in un tubo conico contenente adeguato supporto. </li><li> Prima, durante, oopo preparazione della sospensione singola cella (a seconda di quanto tempo ci vuole per preparare la sospensione singola cella), impostare il cappuccio per tutta l&#39;amplificazione del genoma. <ol><li> Spruzzare lungo la superficie del cofano, scatole di punta della pipetta e puntali per pipette con il 10% di candeggina e asciugare con un tovagliolo di carta. Ripetere questa operazione con il 70% di etanolo. </li><li> Aggiungere 8 ml di acqua dal kit di amplificazione del genoma intero (WGA) a singoli pozzetti di una piastra di pozzetti 96 PCR, un pozzetto per ogni cella da sequenziare. Coprire il 96 pozzetti PCR con un coperchio da una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e posto su ghiaccio. </li></ol></li><li> Aggiungere a 1000 cellule per 10 mL media o tampone fosfato (PBS) in una piastra Petri 15 cm e posizionare il piatto sul ghiaccio per impedire alle cellule di aderire al piatto. </li><li> Portare le cellule nella piastra di Petri e pozzetti 96 piastra PCR con coperchio su ghiaccio per un microscopio ottico con obiettivo 10X. </li><li> Aumentare l&#39;apertura dell&#39;ago dell&#39;aspiratore picchiettando delicatamente la fine disegnata su the aspiratore ago su una superficie dura in modo tale che la punta si interrompe. Inserire l&#39;estremità larga dell&#39;ago di aspirazione in chiaro fine del microaspirator. </li><li> Porre la capsula di Petri contenente cellule sul palco microscopio. Posizionare il boccaglio rossa dell&#39;aspiratore in bocca. Con una mano per spostare l&#39;ago aspiratore e l&#39;altra mano per spostare la piastra di Petri contenente cellule. Identificare singole cellule da sequenziato. </li><li> Usare la bocca di aspirazione, disegnare una singola cella nel ago aspiratore con ~ 1-2 ml di supporto o PBS. Trasferire la cella in 8 ml di acqua all&#39;interno di un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR. Evitare l&#39;introduzione di bolle durante il trasferimento alla cella. </li><li> Ripetere il punto 1.2.7 fino a quando è stato isolato il numero desiderato di cellule. Mantenere la piastra PCR su ghiaccio e coperto con coperchio tra cellule raccolta. Segnare i pozzi che hanno ricevuto le cellule. <ol><li> Mentre la raccolta singole cellule, scongelare il 10X singolo lisi cellulare e buffer di frammentazione da tutta gKit di amplificazione enome. Dopo aver raccolto il numero desiderato di celle, procedere immediatamente a tutto amplificazione del genoma. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Whole Genome Amplification <ol><li> Per prevenire la contaminazione durante tutto l&#39;amplificazione del genoma, aggiungere tutti i reagenti all&#39;interno di una cappa di coltura di tessuti, utilizzare puntali per pipette con filtri, e cambiare il puntale tra i pozzi. </li><li> Preparare una soluzione di lisi e la frammentazione tampone di lavoro dal kit intero genoma di amplificazione (WGA). Per ogni set di fino a 32 celle, unire 32 ml di 10x singola lisi cellulare e buffer di frammentazione e 2 ml di proteinasi K soluzione in una provetta. Agitare la provetta per mescolare le soluzioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di lisi e soluzione tampone frammentazione di lavoro per ciascun bene e pipettare su e giù per mescolare. </li><li> Coprire la piastra e sigillare tutti i pozzetti con un film plastico. centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> ciclo termico come follOWS: 50 ° C, 1 h e 99 ° C, 4 min. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Preparare una soluzione tampone di preparazione biblioteca di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 2 ml di 1x tampone preparazione singola libreria di celle e 1 ml di soluzione di stabilizzazione biblioteca in una provetta. Preparare la soluzione di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica e aggiungere 3 ml di soluzione di tampone di preparazione libreria per ogni pozzetto. Pipettare il contenuto del bene su e giù per mescolare. Sostituire la pellicola di plastica. NOTA: La pellicola di plastica può essere riutilizzata durante l&#39;intero processo genoma di amplificazione fino pozzetti iniziano a fori nella pellicola. Quando si verifica ciò, passare a un nuovo film di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto ogiva e incubare a 95 ° C per 2 min. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e brevementecentrifugare la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 1 ml enzima preparazione libreria per ogni bene, e pipetta il contenuto del bene su e giù per mescolare. Mantenere l&#39;enzima preparazione biblioteca sul ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in mini filatore piastra e ciclo termico come segue: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Preparare una miscela di amplificazione di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 48,5 acqua ml, 7.5 ml 10x amplificazione master mix, e 5 ml WGA DNA polimerasi in una provetta. Preparare la miscela di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. Mantenere il mix di lavoro sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 61 ml di lavoro mix di amplificazionead ogni bene, e il contenuto della pipetta di bene su e giù per mescolare. Tenere il mix di amplificazione a lavorare su ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto girevole e il ciclo termico seguente: 95 ° C, 3 min, 25 cicli di 94 ° C, 30 sec e 65 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 60 ml di ogni campione in una provetta separata e conservare a - 20 ° C per l&#39;uso al punto 3. </li><li> Aggiungere dye DNA loading al restante volume di ogni campione (3 ml di 6x DNA loading dye a 15 microlitri di campione) e funzionamento 5 microlitri da ogni reazione su un gel di agarosio 1%. NOTA: Le cellule che amplificati con successo apparirà come uno striscio da 250 a 1000 bp. I campioni che non presentano una sbavatura o mostrano solo una macchia debole è improbabile per produrre dati di sequenziamento utili. </li></ol> 3. Sequencing <ol><li> Purificare i campioni con perline paramagnetici. <ol><li> Thacampioni di DNA W sul ghiaccio. perline Vortex paramagnetici fino a quando la soluzione è omogenea e incubare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min. </li><li> Trasferire 20 ml di ogni campione di DNA in una provetta pulita. Il resto del campione può essere conservato a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml (1.5x) di perline paramagnetici ad ogni campione di DNA e vortex per miscelare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Lasciare la soluzione stock di perline a temperatura ambiente per l&#39;uso nel passo 3.4. </li><li> Posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per 2 minuti, o fino a quando le perle formano un pellet e il surnatante è chiaro. </li><li> Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare le perline. </li><li> Aggiungere 180 ml di 80% di etanolo alla miscela DNA-tallone. Ruotare i tubi diverse volte rispetto al magnete di &quot;lavaggio&quot; le perle attraverso la soluzione di etanolo. </li><li> Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di lavaggio etanolo come posBLE senza disturbare le perline. </li><li> Ripetere 3.1.6 e 3.1.7. </li><li> Far asciugare le perle per circa 10 minuti o fino a quando non è più l&#39;etanolo è visibile. Procedere alla fase successiva, quando le perline appaiono rotti o cadere dalla parete del tubo. </li><li> Rimuovere i campioni dalla striscia magnetica. Aggiungere 40 ml di 10 mM Tris pH 8,0 per eluire il DNA dalle perline e vortice dei campioni per risospendere le sfere. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> centrifugare brevemente i campioni per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per almeno due minuti. Trasferire il eluente in provette da microcentrifuga puliti senza disturbare le perline. </li></ol></li><li> normalizzazione del campione <ol><li> Quantificare la concentrazione di ogni campione utilizzando uno spettrofotometro. Le concentrazioni dovrebbero variare da 10 a 30 ng / mL. </li><li> Diluire ciascun campione a 0,2 ng / ml usando 10 mM Tris pH 8,0. Le seguenti operazioni richiedono un minimo input di 5 ml di questa diluizione. </li></ol></li><li> preparazione Biblioteca <ol><li> Preparare le librerie di sequenziamento seguendo le istruzioni del kit di preparazione libreria 13. </li></ol></li><li> pulizia finale <ol><li> Pulire i campioni in base al passo 3.1. Per lunghezze di lettura di 50 bp, 75 bp, o 150 punti base, utilizzare un rapporto di tallone di assaggiare volume di 1,5x, 1x, o 0.6x, rispettivamente. Eluire con 15 ml di 10 mM Tris pH 8.0. </li><li> Eseguire i campioni su un analizzatore frammento controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria 14. La distribuzione dimensionale dovrebbe essere uniformemente diffondersi da 150 al 900 bp. </li></ol></li><li> Quantificare i campioni utilizzando qPCR <ol><li> Utilizzando un kit di quantificazione biblioteca, impostare una reazione qPCR secondo le istruzioni del kit 15. Lascia un vuoto di colonna per aggiungere norme positive (norme DNA del kit) e gli standard negativi (acqua o altra soluzione vuota). </li><li> ciclo termico come Folbassi: 95 ° C, 5 min (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 35 cicli di 95 ° C, 30 sec (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 60 ° C, 45 sec (velocità di rampa di 2,5 ° C / sec). </li></ol></li><li> pooling <ol><li> Determinare come sono necessarie molte corsie sulla cella a flusso e dividere i campioni in gruppi, con un gruppo per corsia. </li><li> Per ciascun gruppo di campioni, scegliere il campione con la più bassa concentrazione sulla base dei dati qPCR dal punto 3.5.2 e normalizzare tutti i campioni in quel gruppo a detta concentrazione utilizzando 10 mM Tris pH 8,0. </li><li> Pool i campioni in ciascun gruppo insieme. </li></ol></li><li> sequencing <ol><li> Piscine di carico sulla macchina di sequenziamento di prossima generazione seguenti procedure standard 16. </li></ol></li></ol> Analisi 4. I dati NOTA: Un ambiente basato su Unix è necessario per eseguire i programmi e gli script in questa sezione. Installare il software di cui al protocollo dopo la loro in<html> guide instal-. Tutti gli script possono essere trovati a https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. <ol><li> Tagliare la legge a 40-nt utilizzando fastx_trimmer da FASTX-Toolkit versione 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq </li><li> Allineare la legge al genoma appropriata di riferimento (MM9 per il mouse, hg19 per l&#39;uomo) con BWA versione 0.6.1 con le opzioni di default 18. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq&gt; example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq&gt; example.sam </li><li> Rimuovere allineamenti di CHRM e cromosomi casuali, quindi ordinare e indicizzare il file BAM risultante utilizzando SAMTools versione 0.1.19 19. grep -v -w CHRM example.sam | grep -v casuale&gt; example.filtered.sam samtools vista example.filtered.sam -uSh | samtools sorta - example.filtered samtools indice example.filtered.bam </li><li> Eseguire HMMcopy per rilevare CNV= &quot;Xref&quot;&gt; 20 <ol><li> Utilizzare gcCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento percentuale di GC per il genoma. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 500000&quot; per specificare la dimensione della finestra. Utilizzare la stessa versione del file di riferimento FASTA utilizzato nel passaggio 4.2, ma fare in modo CHRM e cromosomi casuali vengono rimossi dal file FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa&gt; mm9_gc.wig </li><li> Utilizzare generateMap.pl in HMMcopy per generare un file di manovra per mappability. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 40&quot; per specificare leggere lunghezza. Utilizzare lo stesso file di riferimento fasta utilizzato nel passaggio 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig </li><li> Utilizzare mapCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento mappability per il genoma. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 500000&quot; per specificare la dimensione della finestra. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig&gt; mm9_map.wig </li><li> Utilizzare readCounter in HMMcopy per generare un file di manovra per ogni file BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam&gt; input.wig </li&gt; <li> Modificare i percorsi dei file di riferimento negli script R (run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), usare i file generati sopra a 4.4.1 (ad esempio, mm9_gc.wig) e 4.4.3 (per esempio, mm9_map. parrucca) per le variabili gfile e MFILE, che si riferiscono al file di riferimento percentuale di GC e riferimento mappability, rispettivamente. Quindi eseguire lo script R fornito &quot;run_hmmcopy.mm9.r&quot; o &quot;run_hmmcopy.hg19.r&quot;. R CMD LOTTO run_hmmcopy.mm9.r o R CMD LOTTO run_hmmcopy.hg19.r </li><li> Per l&#39;elaborazione in batch di un insieme di file BAM, inserire i file BAM in una singola cartella ed eseguire lo script fornito &quot;HMMpipe.pl&quot; nel pacchetto di chiamare i segmenti e calcolare i punteggi di variabilità (VS). Seguire il formato: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 </li></ol></li><li> Eseguire DNAcopy per rilevare CNV 21. <ol><li> Utilizzare SAMtools versione 0.1.19 per estrarre mappata univocamente legge da ciascun file BAM. Vista samtools -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i &quot;^ @ | XT: A: U&quot; | samtools vista -shu -&gt; example.mapped.bam </li><li> Utilizzare MarkDuplicates in Picard versione 1.94 per contrassegnare i duplicati PCR nel BAM file di 22. java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam USCITA = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true </li><li> Utilizzare coveragebed in bedtools versione 2.17.0 per contare mappato legge in ciascuna delle finestre dinamica 500kb mappabili predefiniti nel file da letto disponibile &quot;mm9.500k.dynamic.win.bed&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.bed&quot; 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sorta -k1,1 -k2,2n&gt; example.nondup.counts </li><li> Utilizzare lo script Perl fornito &quot;normalizeGC.pl&quot; per normalizzare i conteggi di lettura in base alla condizione file di riferimento contenuto GC &quot;mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt &quot;. perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts&gt; example.bam.norm.counts </li><li> Utilizzare la R script &quot;dnacopy.r&quot; fornito a chiamare i segmenti. R CMD LOTTO dnacopy.r </li></ol></li><li> identificare CNV <ol><li> Escludere le cellule per i quali il VS calcolato 4.4.6 supera 0,26. </li><li> Filtrare i segmenti chiamati da HMMcopy in 4.4.6 per includere solo quelli per i quali il rapporto mediana log 2 è maggiore di 0,4 (guadagno putativo) o meno di -0.35 (perdita putativo). </li><li> Filtrare i segmenti chiamati da DNAcopy in 4.5.5 per includere solo quelli per i quali il segmento media è maggiore di 1,32 o inferiore a 0,6. </li><li> Sovrapporre i segmenti da 4.6.2 e 4.6.3, chiamando CNV solo nelle regioni in cui sia HMMcopy e DNAcopy identificano un guadagno o una perdita putativo putativo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tradizionalmente, individuando CNVs e aneuploidie a livello delle singole cellule necessarie metodi citologici come il pesce e SKY. Ora, singola sequenza cella è emerso come un approccio alternativo per tali domande. sequenziamento singola cella ha dei vantaggi rispetto FISH e il cielo come è sia genome-wide e alta risoluzione. Inoltre, quando si applicano metodi di controllo della qualità appropriati, il sequenziamento singola cellula in grado di fornire una valutazione più affidabile di CNVs e aneuploidia in quanto non è suscettibile di ibridazione e la diffusione manufatti inerenti alla FISH e SKY. Tuttavia, molte delle recenti applicazioni di sequenziamento singola cellula non sono state dimostrate dalla valutazione approfondita della sensibilità e specificità dei metodi e delle analisi. In effetti, alcuni degli approcci analitici utilizzati da altri studi sono associati con alte frequenze (&gt; 50%) di falsi positivi CNV chiama 12. L&#39;approccio che descriviamo è stato rigorosamente testato utilizzando cellule di knproprio fardello CNV, al fine di determinare i tassi di scoperta veri e falsi e ottimizzare la sensibilità e la specificità del CNV rilevazione 12. Utilizzando il controllo di qualità e approcci analitici descritti in questo protocollo, circa il 20% dei guadagni di 5 Mb, il 75% delle perdite 5 Mb, e tutto CNV superiore a 10 Mb può essere rilevato. Sebbene determinazione del false discovery rate di singola sequenza cella è difficile, abbiamo stimato per essere inferiore al 25%. Questo protocollo può essere applicata alle cellule da una varietà di fonti, gli script possono essere modificati per regolare la risoluzione della rilevazione CNV, e il protocollo può essere adattato per identificare altri tipi di alterazioni genomiche. Ci sono una varietà di mezzi di dissociare tessuti freschi in singole cellule, e molte pubblicazioni descrivono le procedure ottimizzati per specifici tessuti, come la pelle e il cervello 24 25. Preferiamo isolare singole cellule da microaspirazione quanto permette fo<html> r valutazione visiva di ogni cella da sequenziare. Tuttavia, è anche possibile isolare singole cellule mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 26 e dispositivi microfluidici 27. Se l&#39;isolamento singola cella e tutta amplificazione del genoma viene eseguita manualmente, è ragionevole isolare e amplificare fino a quaranta celle in una sola seduta. Al fine di ottenere i dati di sequenziamento singola cellula di alta qualità, è fondamentale che l&#39;amplificazione dei genomi singola cellula è uniforme e completo. Troviamo che la qualità di singole cellule isolate, nonché l&#39;efficienza della lisi ed amplificazione ha un impatto significativo sulla qualità dei dati di sequenziamento. Come tale, le cellule dovrebbero essere raccolti dal loro ambiente nativo appena prima di isolamento e di tutta l&#39;amplificazione del genoma dovrebbe iniziare subito dopo che le cellule sono isolate. Inoltre, la fase di lisi e frammentazione dovrebbe essere seguita esattamente come descritto nella procedura 2,3-2,6. &quot;&gt; Gli algoritmi possono essere regolati per cambiare la risoluzione di rilevazione CNV, con opposti effetti sulla sensibilità e specificità 12. E &#39;inoltre possibile regolare le soglie per rilevare intero cromosoma aneuploidia nella cornice di tetraploidy 11. Tuttavia, troviamo che il nostro approccio è limitato a rilevare CNV maggiore di 5 Mb, come rumore introdotto durante tutta la amplificazione del genoma complica l&#39;individuazione di varianti minori 12. miglioramenti futuri in tutto il genoma di amplificazione approcci dovrebbero in ultima analisi, migliorare la risoluzione di rilevamento CNV utilizzando un&#39;unica sequenza cella. Sequenziamento singola cella consente per le indagini non solo le alterazioni del numero di copie, ma anche le variazioni singolo nucleotide 28, 29 e 30 variazione strutturale. Il nostro protocollo per l&#39;isolamento delle cellule singolo può essere applicato a rispondere a queste altre quesug-. Tuttavia, la scelta di tutto il metodo genoma di amplificazione dipende dall&#39;applicazione specifica. Il metodo descritto in questo protocollo, che si basa sulla reazione a catena della polimerasi, è più adatto per la rilevazione di alterazioni del numero di copie perché è associato con livelli più bassi di amplificazione pregiudizi 32. Per indagare altri tipi di alterazioni genomiche, come singoli polimorfismi nucleotidici, altri metodi di amplificazione del genoma intero sono ritenuti essere più adatto 31, 32.

Alterazioni nel numero di copie di DNA possono variare nel formato da diverse paia di basi (numero di copie varianti) (CNV) a interi cromosomi (aneuploidie). Alterazioni del numero di copie che interessano ampie regioni del genoma possono avere notevoli conseguenze fenotipiche alterando l&#39;espressione fino a migliaia di geni 1, 2. CNV che sono presenti in tutte le cellule di una popolazione può essere rilevato mediante sequenziamento rinfusa o metodi microarray basati 3, 4. Tuttavia, le popolazioni possono anche essere geneticamente eterogenea, con CNVs esistenti in un sottogruppo della popolazione o anche singole cellule. Eterogeneità genetica è comune nel cancro, guidando l&#39;evoluzione del tumore, e presenti anche in tessuti normali, con conseguenze sconosciute 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Tradizionalmente, l&#39;eterogeneità genetica è stata valutata sia da approcci citologici o sequenziamento di massa. Approcci citologici, come ibridazione in situ fluorescente (FISH), gli spread cromosomiche, e cariotipo spettrale (SKY), hanno il vantaggio di alterazioni che identificano presenti nelle singole cellule, ma hanno alti tassi di errore a causa di artefatti di ibridazione e la diffusione 11. Questi approcci sono anche limitati nella loro numero di copie risoluzione di sola rivelando cambia a abbracciano diversi megabasi. Sequencing o microarray di DNA di massa, anche se più elevato in precisione e risoluzione, è meno sensibile. Per rilevare eterogeneità genetica da approcci basati sulla popolazione, le varianti devono essere presenti in una frazione sostanziale di cellule nella popolazione. La comparsa di metodi per amplificare il DNA genomico da singole cellule ha reso possibile sequenziare il genoma di singole cellule. seque cella singolancing presenta i vantaggi di alta risoluzione, alta sensibilità, e, quando si applicano i metodi di controllo della qualità adeguati, elevata precisione 12. Qui, si descrive un metodo per la rilevazione megabase scala alterazioni del numero di copie in singole cellule. Noi isolare le cellule singole da microaspirazione, amplificare il DNA genomico usando linker-adattatore PCR, preparare librerie per il sequenziamento di nuova generazione, e rilevare il numero di copie varianti sia da modello nascosto di Markov e segmentazione binario circolare.

<table><tbody><tr><td>Tubi assemblati per aspiratore per pipette microcapillari calibrate Tubo</td><td>in PVC Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>(ID 3/16", OD 5/16", ~1 piede)</td><td>Tubo in PVC VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>(ID 5/16", OD 7/16", ~6 pollici)</td><td>Filtro per</td> siringa VWR <td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc con membrana HT Tuffryn (diametro 25 mm, dimensione dei pori 0,2 & micro; m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Qualsiasi pipetta in plastica da 5 mL dovrebbe essere sufficiente</td></tr><tr><td>Trappola d'acqua in linea per l'uso dell'ossigeno</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Provette per punto di fusione capillare (ID 0,8-1,1 mm, lunghezza 100 mm)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (diametro 150 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>La superficie deve essere non aderente per facilitare l'aspirazione di singole cellule</td></tr><tr><td>Hard-Shell&nbsp; PCR semi-gonna a 96 pozzetti a tutta altezza&nbsp; Piastre</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Qualsiasi piastra PCR a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Qualsiasi piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente</td></tr><tr><td>GenomePlex Kit di amplificazione dell'intero genoma a cellula singola</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal Film 'A'</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini spinner</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp;</td><td>Qualsiasi termociclatore dovrebbe essere sufficiente, purché possa ospitare una piastra PCR a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Qualsiasi striscia di tubo magnetico simile dovrebbe essere sufficiente</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo (ottimizzato per Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&nbsp;</td><td>Questo kit è ottimizzato per la macchina per PCR in tempo reale Roche LightCycler 480. Se si utilizza una macchina diversa, sostituirla con un kit ottimizzato per la propria macchina.</td></tr></tbody></table>

rilevamento di copy number alterazioni utilizzando sequencing single cell

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Riconoscimento di modifiche genomiche a risoluzione singola cella è importante per la caratterizzazione eterogeneità genetica ed evoluzione nei tessuti normali, i tumori, e le popolazioni microbiche. I metodi tradizionali per valutare l&#39;eterogeneità genetica sono stati limitati dalla bassa risoluzione, bassa sensibilità, e / o bassa specificità. sequenziamento cella singola è emerso come un potente strumento per la rilevazione di eterogeneità genetica ad alta risoluzione, alta sensibilità e, opportunamente analizzata, alta specificità. Qui forniamo un protocollo per l&#39;isolamento, tutta l&#39;amplificazione del genoma, sequenziamento e l&#39;analisi di singole cellule. Il nostro approccio consente l&#39;identificazione affidabile di megabase scala varianti numero di copie in singole cellule. Tuttavia, gli aspetti di questo protocollo può essere applicato anche per studiare altri tipi di alterazioni genetiche in cellule singole.

L&#39;aspiratore montato dovrebbe essere simile a quello della Figura 1A. L&#39;ago deve essere disegnato in modo che sia sufficientemente ampia per accogliere una singola cella, ma non così ampia che un grande volume è redatta con singola cella. Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10 volte (Figura 1B). Se intera amplificazione del genoma è riuscita, il campione apparirà come una macchia su un gel di agarosio (figura 2, corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7). Uno striscio debole o assente indica una reazione di amplificazione fallito e il campione non deve essere sequenziato (Figura 2, corsie 3 e 8). Dopo la preparazione biblioteca, la distribuzione delle dimensioni frammento di campioni deve essere valutata mediante elettroforesi capillare su un analizzatore frammento.Successo librerie preparati avranno piuttosto distribuzione uniforme di dimensioni frammento di 150 bp al 900 (Figura 3, A, B). Preparazione biblioteca riuscita si tradurrà in una distribuzione di dimensione del frammento distorta e tali librerie non dovrebbe essere sequenziato (Figura 3C). L&#39;elaborazione di dati di sequenziamento attraverso il modello di Markov nascosto (HMMcopy) e la segmentazione binario circolare (DNAcopy) analizzerà il genoma di ogni cella in segmenti di numero di copie stimato. Questi segmenti possono essere filtrati per identificare quelli con un numero di copie stimato coerente con guadagno o perdita in una singola cella (Tabella 1). Questi segmenti filtrati da HMMcopy e DNAcopy dovrebbero quindi essere sovrapposte per individuare alta fiducia CNV. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Figura 1. isolamento delle cellule singolo. (<html> A) assemblata microaspirator. (B) Un campo 10 volte mostra dissociato cellule (frecce) e l&#39;ago microaspirator (in basso a destra). Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Figura 2. amplificazione del genoma intero. Agarosio elettroforesi su gel di 5 ml di prodotti dell&#39;intero genoma di amplificazione. I campioni che amplificano con successo apparirà strisci come brillanti da 100 bp a 1 kb (corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7) e può essere sequenziato. I campioni che non amplificano con successo produrrà sbavature deboli o nessuna sbavatura (corsie 3 e 8) e non dovrebbe essere sequenziato.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione biblioteca. I risultati rappresentativi da un analizzatore di frammento. I grafici mostrano dimensione del frammento (in bp) sull&#39;asse X e unità di fluorescenza relativa (RFU) sull&#39;asse Y. A destra di ogni grafico è una corsia di gel simulato. (A) i risultati di un campione ideale, con una distribuzione uniforme tra 150 e 900 bp e senza picchi taglienti o pregiudizi verso un lato. Questo campione è accettabile per il sequenziamento. (B) I risultati di un campione bene, con una distribuzione delle dimensioni oblique verso dimensioni frammento più bassi. Mentre questo non è ottimale, il campione può essere ancora sequenziato. (C) i risultati da un campione fallito, con prevalenza di piccole dimensioni frammento. Questo è probabilmente causato da una prolungata incubazione durante la fase di tagmentationdi preparazione library. Questo campione non deve essere sequenziato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Campione </td><td> Segmento </td><td> Chr </td><td> Inizio </td><td> Fine </td><td> Stato </td><td> Mediano </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144.500.001 </td><td> 146.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67.000.001 </td><td> 134.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20.000.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> Chry </td><td> 1 </td><td> 59.500.000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Campione </td><td> Chrom </td><td> Inizio bin </td><td> fine bin </td><td> Inizio </td><td> Fine </td><td> Seg media </td><td> med Seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62.612.945 </td><td> 129.971.511 </td><td> 1,4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28.416.392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51.659.160 </td><td> 95.343.369 </td><td> 1,3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> Chry </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23.805.358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. L&#39;analisi dei dati. segmenti filtrati generati da HMMcopy e DNAcopy da una singola cellula. La sovrapposizione di questi due risultati rivela un guadagno sul cromosoma 10 da 67 a 130 Mb, nonché un guadagno sul cromosoma 19 da 0 a 20 Mb. Abbiamo trovato che i guadagni sulla porzione prossimale del cromosoma 19 sono un artefatto di sequenziamento singola cella 12.

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un&#39;unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare alterazioni del numero di copie del DNA su scala di megabasi in singole cellule. Per categorizzare l'eterogeneità genomica nelle popolazioni cellulari, è necessario identificare cambiamenti genomici a risoluzione di singola cellula. Tradizionalmente, questo veniva ottenuto utilizzando approcci citologici; tuttavia, questi metodi presentavano limitazioni in termini di sensibilità e specificità.Il sequenziamento a singola cellula può rilevare una varietà di alterazioni genomiche, con una sensibilità e specificità migliorate rispetto ai metodi precedenti, ma solo se eseguito con attenzione. Di seguito descriviamo come utilizzare il sequenziamento a singola cellula per rilevare in modo affidabile alterazioni del numero di copie su scala di megabasi in singole cellule. Per assemblare il microaspiratore, iniziare rimuovendo l'estremità di plastica trasparente dall'insieme del tubo dell'aspiratore e inserire l'estremità stretta in un'estremità di un tubo in PVC lungo un piede e con un diametro interno di 3/16 di pollice.Inserire l'uscita di un filtro per siringa da 0,2 micrometri nell'altra estremità di un tubo in PVC lungo un piede e con diametro interno di 3/16 di pollice. Inserire quindi l'ingresso del filtro per siringa da 0,2 micrometri in un'estremità di un tubo in PVC lungo sei pollici e con diametro interno di 5/16 di pollice. Spezzare una pipetta sierologica in plastica da cinque millilitri al segno di graduazione di un millilitro e inserire l'estremità spezzata nell'estremità libera del tubo in PVC con diametro interno di 5/16 di pollice.Successivamente, inserire l'estremità di una pipetta sierologica in plastica da cinque millilitri nell'estremità flessibile di un'assemblaggio di tubo aspiratore, quindi utilizzare un tubo sterile in plastica per coprire il bocchino rosso dell'assemblaggio del tubo durante la conservazione. Tirare una pipetta capillare in vetro fino a ottenere un diametro interno di 10-30 micrometri posizionando la parte centrale del tubo vicino a una fiamma ed esercitando una trazione su entrambe le estremità del tubo. Spezzare il tubo allungato in due metà per creare due potenziali aghi aspiratori.Ripetere questo passaggio con diverse provette per assicurarsi che vengano preparate un numero sufficiente di micropipette con un diametro interno adeguato per il prelievo di singole cellule. Per preparare cellule aderenti, come linee cellulari di fibroblasti umani, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e trasferirle in una provetta conica contenente il mezzo appropriato. Preparare la cappa per l'amplificazione del genoma intero spruzzando con una soluzione di candeggina al 10% la superficie della cappa, le scatole dei puntali per pipetta e i puntali stessi.Quindi utilizzare un tovagliolo di carta per pulirli tutti prima di ripetere il lavaggio con etanolo al 70%. Aggiungere otto microlitri di acqua dal kit di amplificazione del genoma intero, o WGA, in pozzetti singoli di una piastra PCR a 96 pozzetti. Quindi coprire la piastra PCR a 96 pozzetti con un coperchio di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti e posizionare la piastra sul ghiaccio.Successivamente, aggiungere 1.000 cellule a 10 millilitri di mezzo o PBS in una piastra di Petri da 15 centimetri e posizionare la piastra sul ghiaccio per impedire alle cellule di aderire alla piastra. Quindi, mantenendo ancora la piastra sul ghiaccio, trasferire le cellule nella piastra di Petri e la piastra PCR a 96 pozzetti su un microscopio ottico dotato di obiettivo 10X. Aumentare l'apertura dell'ago dell'aspiratore picchiettando delicatamente l'estremità allungata dell'ago su una superficie dura in modo che la punta si stacchi.Quindi inserire l'estremità larga dell'ago nell'estremità trasparente del microaspiratore. Successivamente, posizionare la piastra di Petri contenente le cellule sul palchetto del microscopio. Inserire l'ugello rosso dell'aspiratore in bocca.Quindi, utilizzando una mano per muovere l'ago dell'aspiratore e l'altra per spostare la piastra di Petri, identificare le singole cellule da sottoporre a sequenziamento. Mediante aspirazione orale, aspirare una singola cellula all'interno dell'ago dell'aspiratore insieme a circa uno-due microlitri di mezzo o PBS. Trasferire la cellula negli otto microlitri di acqua in un singolo pozzetto della piastra PCR a 96 pozzetti.La qualità e l'utilità dei dati di sequenziamento a singola cellula dipendono dallo stato di ciascuna cellula e dal suo genoma; pertanto, è necessario prestare attenzione durante la preparazione delle cellule e la microaspirazione per isolare cellule vitali e non apoptotiche. Dopo aver aspirato ciascuna cellula e trasferirla in una pozzetta della piastra per PCR, contrassegnare la pozzetta che ha ricevuto una cellula. Ripetere questa operazione per il numero desiderato di cellule.Nel frattempo, scongelare il tampone di lisi e frammentazione 10X per singola cellula dal kit di amplificazione dell'intero genoma. Per prevenire contaminazioni durante l'amplificazione dell'intero genoma, aggiungere tutti i reagenti all'interno di una cappa a flusso laminare. Utilizzare punte di pipetta con filtro e cambiare la punta della pipetta tra una pozzetta e l'altra.Per ogni serie di fino a 32 cellule, unire 32 microlitri di tampone di lisi e frammentazione 10X per singola cellula e due microlitri di soluzione di proteinasi K in una provetta da microcentrifuga, quindi vortexare la provetta per mescolare il contenuto. Aggiungere un microlitro della soluzione in ciascun pozzetto e pipettare su e giù per mescolare. Coprire la piastra e sigillare tutti i pozzetti con pellicola di plastica.Quindi centrifugare brevemente la piastra in uno spinner per piastre mini. Successivamente, eseguire il programma nel termociclatore utilizzando il seguente programma. Poi raffreddare la piastra sul ghiaccio e centrifugarla brevemente.Per preparare una soluzione tampone di lavoro per la preparazione di librerie a partire dal kit di amplificazione del genoma intero, per ogni cellula mescolare due microlitri di tampone di preparazione della libreria 1X per singola cellula e un microlitro di soluzione di stabilizzazione della libreria. Una lisi cellulare adeguata e una frammentazione completa del genoma sono fondamentali per minimizzare i bias durante l'amplificazione del genoma intero e garantire la preparazione di librerie di sequenziamento di alta qualità. Pertanto, prestare attenzione a eseguire questi passaggi esattamente come indicato.Rimuovere il film di plastica dalla piastra e aggiungere tre microlitri della soluzione in ogni pozzetto. Pipettare il contenuto del pozzetto su e giù per mescolare, quindi reinserire il film di plastica. Dopo aver centrifugato brevemente la piastra, incubare le cellule a 95 gradi Celsius per due minuti, raffreddare la piastra sul ghiaccio e quindi centrifugare nuovamente la piastra brevemente.Ora rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere un microlitro di enzima di preparazione della libreria in ogni pozzetto ed eseguire alcune aspirazioni e dispense del contenuto del pozzetto per mescolare, quindi riposizionare la pellicola di plastica. Dopo aver centrifugato brevemente la piastra, posizionarla nel termociclatore ed eseguire il seguente programma. Dopo aver raffreddato la piastra e averla centrifugata brevemente, preparare un mix di amplificazione working diluendo il kit di amplificazione del genoma intero, unendo 48,5 microlitri di acqua, 7,5 microlitri di mix master di amplificazione 10X e 5 microlitri di polimerasi WGA, per ogni cellula.Mantenere la miscela di lavoro sul ghiaccio. Rimuovere la pellicola di plastica dalla piastra. Aggiungere 61 microlitri della miscela di amplificazione di lavoro in ogni pozzetto ed aspirare e rilasciare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù con una pipetta per mescolare, quindi riposizionare la pellicola di plastica.Centrifugare brevemente la piastra e sottoporla a termociclaggio come segue. Sequenziare i campioni ed eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto nel testo. Come mostrato in questa figura, se l'amplificazione dell'intero genoma ha successo, il campione apparirà come una striscia diffusa in un gel di agarosio.Una striscia debole o assente indica una reazione di amplificazione fallita e il campione non dovrebbe essere sottoposto a sequenziamento. Come mostrato qui, l'analisi delle dimensioni dei frammenti è stata eseguita mediante elettroforesi capillare su un analizzatore di frammenti. Le librerie preparate con successo presenteranno una distribuzione piuttosto uniforme delle dimensioni dei frammenti comprese tra 150 e 900 paia di basi.Una preparazione non riuscita della libreria comporterà una distribuzione distorta delle dimensioni dei frammenti e tali librerie non devono essere sottoposte a sequenziamento. Utilizzando il modello di Markov nascosto e la segmentazione binaria circolare, il genoma di ogni cellula è stato suddiviso in segmenti con numero di copie stimato. Questa tabella mostra i risultati sovrapposti ottenuti da una singola cellula e rivela un guadagno sul cromosoma 10 da 67 a 130 megabasi e un guadagno sul cromosoma 19 da 0 a 20 megabasi.L'isolamento e l'amplificazione dell'intero genoma di singole cellule possono e devono essere eseguiti in un unico giorno. La preparazione delle librerie di sequenziamento, il sequenziamento dell'intero genoma e l'analisi dei dati possono quindi essere effettuati secondo un programma flessibile. Quando l'isolamento cellulare e l'amplificazione dell'intero genoma vengono eseguiti correttamente e l'analisi dei dati viene condotta rigorosamente come descritto, è possibile rilevare alterazioni del numero di copie superiori a cinque megabasi con elevata sensibilità e specificità.Sebbene il nostro protocollo descriva specificamente l'uso del sequenziamento a singola cellula per il rilevamento di alterazioni del numero di copie, alcuni aspetti di questo protocollo, come l'isolamento delle singole cellule e la preparazione delle librerie, possono essere applicati per rilevare altre modifiche genomiche.

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