Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

L'obiettivo generale di questo protocollo di ibridazione genomica comparativa basato su array è quello di identificare rapidamente le variazioni del numero di copie nei mutanti indotti dal bombardamento di neutroni veloci della pianta leguminosa Medicago truncatula. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle leguminose. Ad esempio, facilitando l'identificazione di empatogeni in basso sito coinvolti nella regolazione dello sviluppo dei noduli nelle leguminose.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è di altissima reputazione e sensibile nel rilevare variazioni del numero di copie come le mutazioni di delezione nei mutanti di bombardamento di neutroni della pianta leguminosa Medicago truncatula. A dimostrare questa procedura saremo io e Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows del Laboratorio Genetico. Congelare rapidamente un grammo di tessuto fogliare giovane raccolto da singole piante in azoto liquido.

Quindi, usa un mortaio e un pestello e macina il tessuto fogliare congelato in polvere fine all'interno dell'azoto liquido. Estrarre i campioni di DNA genomico wild type e mutante dalla polvere fine utilizzando un kit di isolamento del DNA. Utilizzare provette da centrifuga da 500 microlitri per diluire un microgrammo di ogni DNA genomico selvatico e mutante con acqua distillata doppia fino a un volume finale di 20 microlitri.

Quindi, aggiungere cinque microlitri di primer casuale alle provette da centrifuga. Agitare rapidamente le provette e, dopo una rapida centrifuga, metterle in un termociclatore per 10 minuti per denaturare i campioni di DNA a 98 gradi Celsius. Dopo 10 minuti rimuovere i tubi dal termociclatore e metterli immediatamente in acqua ghiacciata per cinque minuti.

Quindi, preparare due miscele di marcatura e aggiungere 25 microlitri di miscela di marcatura come uno e due rispettivamente alle provette di DNA wild type e mutante. Pipettare il DNA e la miscela di marcatura tre volte, quindi centrifugare brevemente le provette. Dopo la centrifuga, incubare le provette nel termociclatore a 37 gradi Celsius per due ore, e poi a 65 gradi Celsius per 20 minuti per inattivare l'enzima exo Klenow.

Quindi, aggiungere 430 microlitri di One X TE Buffer e mescolare il contenuto in ciascuna provetta. Quindi, centrifugare brevemente le provette e trasferire la soluzione nelle provette nelle colonne di purificazione con provette di raccolta da due millilitri. Centrifugare le colonne di purificazione a 14.000 volte G per 10 minuti ed eliminare il flusso.

Aggiungere 480 microlitri di One X TE Buffer a ciascuna colonna e centrifugare nuovamente a 14.000 volte G per 10 minuti. Scartare il flusso attraverso. Trasferire ciascuno dei DNA marcati con wild type e mutanti dal fondo della colonna a nuove provette da centrifuga.

Dopo aver misurato il volume di ciascuno dei DNA marcati con la pipetta, regolare il volume finale a 80 microlitri con One X TE Buffer, quindi misurare la concentrazione dei DNA marcati in uno spettrofotometro. Successivamente, mescolare volumi equivalenti di DNA mutante e wild type per ibridare le sonde su un chip micro array per l'ibridazione comparativa. Porta il volume finale a 160 microlitri con One X TE Buffer.

Successivamente, preparare la soluzione di ibridazione e pipettarla tre volte per mescolare bene tre agenti con DNA misto. Dopo aver girato brevemente le provette, incubarle in un termociclatore a 98 gradi Celsius per 10 minuti e a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Ricordarsi di impostare la temperatura a 67 gradi Celsius per preriscaldare il forno di ibridazione quattro ore prima dell'ibridazione.

Quindi, posizionare un vetrino di guarnizione sulla base della camera di ibridazione e caricare su di esso 490 microlitri della soluzione di ibridazione dopo 20 minuti di incubazione a 37 gradi Celsius nel termociclatore. Per formare la camera di ibridazione, coprire la guarnizione scorrevole con il chip micro array del genoma della truncatula Medicago, quindi coprire la camera di ibridazione e serrarla saldamente con i morsetti. Incubare la camera di ibridazione assemblata nel forno di ibridazione a 67 gradi Celsius per 40-48 ore.

Nel frattempo, preparare due piatti di lavaggio a vetrino con 250 millilitri di Washing Buffer One tenuti a temperatura ambiente. Quindi, prepara un piatto di lavaggio a vetrino con il tampone di lavaggio due mantenuto a 37 gradi Celsius. Quindi, preparare una barchetta per il lavaggio dei vetrini con 70 millilitri di acetonitrile e un'altra barchetta per il lavaggio dei vetrini con 70 millilitri di soluzione di stabilizzazione e trafilatura.

Posizionare entrambe le giarre di lavaggio dei vetrini in una cappa aspirante a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere la camera di ibridazione dal forno di ibridazione e allentare i morsetti della camera per aprire il coperchio. Quindi, rimuovere il chip micro array nella slitta della guarnizione e posizionarlo sulla piastra di lavaggio della diapositiva con Wash Buffer One.

Isolare il chip micro array dal vetrino del coperchio. Quindi, trasferire il chip del micro array sul secondo piatto di lavaggio del vetrino con il Wash Buffer One. Utilizzando un'ancoretta di agitazione, mescolare delicatamente la soluzione su una piastra di agitazione magnetica a temperatura ambiente per cinque minuti.

Posizionare il chip micro array sulla piastra di lavaggio del vetrino con il tampone di lavaggio due preriscaldato, quindi mescolare con la barra di agitazione per lavare la soluzione a 37 gradi Celsius per un minuto. Rimuovere il chip del micro array e metterlo nel barattolo di lavaggio a vetrino contenente acetonitrile in una cappa aspirante per lavare per 30 secondi. Trasferire il chip del micro array nella caraffa di lavaggio dei vetrini con la soluzione di stabilizzazione e asciugatura e lavare nuovamente per 30 secondi.

Rimuovere con cautela il truciolo e asciugarlo per un minuto all'interno della cappa. Scansiona il chip micro array utilizzando uno scanner con risoluzioni di due micrometri. Un software di mappatura dei segnali è stato utilizzato come interfaccia per analizzare la distribuzione dei rapporti log-due normalizzati dei segnali mutanti rispetto a quelli di tipo selvatico su otto cromosomi.

Per le delezioni putative si considera il valore di log due, un rapporto uguale o inferiore a meno due virgola cinque della deviazione standard. L'analisi di segmentazione del software dimostra una regione di delezione stimata di 22 kilobasi sul cromosoma quattro mostrato nel grafico. L'analisi dei bordi di delezione affiancati dalle sonde micro array mostra un rapporto logaritmico medio normalizzato ridotto.

Il grafico mostra anche altri sei geni annotati, incluso il gene figlio che comprende la regione eliminata. Il gene del figlio è responsabile del controllo della nodulazione nella troncatola di Metecago. Successivamente, l'amplificazione PCR eseguita per confermare i bordi di delezione mostra un prodotto di una virgola cinque kilobasi amplificato dal mutante FN6191, ma non nel tipo selvatico.

Il sequenziamento del DNA è stato eseguito per mostrare la giunzione di delezione nel mutante FN6191 mostrato nella freccia nera. È stata eseguita anche una sequenza che ha confermato la posizione dei bordi di eliminazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 72 ore se eseguita correttamente.

Per ottenere dati di alta qualità, ricordarsi di mantenere bassa la concentrazione di ozono nella stanza in cui si esegue la procedura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come le reazioni a catena della polimerasi di tutto il sequenziamento del genoma per rispondere a ulteriori domande come le dimensioni e le variazioni del numero di copie nel genoma. L'evento e la convalida di questa tecnica hanno spianato la strada ai ricercatori per esplorare la variazione del numero di copie che inducono ai mutanti e le varianti naturali nelle specie vegetali che non sono suscettibili di mutagenesi inserzionale come Garden P.Non dimenticare che lavorare con acetonitrile, soluzione di stabilizzazione ed essiccazione può essere estremamente pericoloso.

Precauzioni, come indossare protezioni per gli occhi, evitare il contatto diretto con gli agenti e lavorare con attenzione è assolutamente essenziale.