Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri
20 agosto 2014
Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la formazione di streamer batterici in un dispositivo microfluidico con micro pilastri. Ciò si ottiene fabbricando prima il chip microfluidico. Il secondo passo della procedura consiste nel coltivare i batteri testati, in questo caso la fluorescenza di pseudomonas.
I passaggi finali consistono nell'assemblare la configurazione sperimentale, iniettare i batteri nel chip microfluidico e raccogliere i dati. In definitiva, i risultati possono mostrare l'evoluzione temporale degli streamer attraverso immagini di microscopia a fluorescenza influenzale. La dimostrazione visiva di questo metallo è fondamentale in quanto i diversi passaggi sono difficili da imparare.
A causa della natura interdisciplinare dell'esperimento, questa procedura richiede wafer di silicio con incisione ionica reattiva profonda. Il fotoresist sui wafer deve essere lavato via. Iniziate con il silenzio dello stampo master.
Aggiungere due o tre gocce di tricloroetilene a una fiala e metterla in un essiccante insieme al disegno dello stampo verso l'alto accanto ad essa. In due o tre ore, lo stampo sarà siloizzato. Durante la siloizzazione, preparare la base siliconica PDMS mix sigaro 1 8 4 con un agente indurente in un rapporto di 10 a uno.
Quindi degassare il PDMS sotto vuoto per circa due ore. A questo punto trasferire un wafer siloizzato in un supporto e versarvi sopra il PDMS, assicurandosi che non si formino bolle. Lasciare indurire il PDMS sul wafer a 80 gradi Celsius per due ore.
Questo fabbrica il timbro A-P-D-M-S dallo stampo in silicone delle dimensioni. Al termine dell'indurimento, staccare il timbro PDMS con l'aiuto di un taglierino. Quindi tagliare il timbro in un chip microfluidico utilizzando il taglierino.
Ora, utilizzando un nucleo di taglio, praticare dei fori all'ingresso e nelle posizioni di sopravvivenza sul timbro. Il passo successivo consiste nell'incollare il timbro al vetro. Esporre un vetrino coprioggetto da 24 millimetri e il timbro PDMS al plasma di ossigeno per 30 secondi.
Dopo l'esposizione, attacca il vetrino coprioggetto sul lato inferiore del timbro PDMS e si formerà un legame. Mettere il gruppo in forno a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Per completare il processo di questo protocollo, preparare piastre LB realizzate con acqua ultrapura e dosate con 50 microgrammi per millilitro di tetraciclina aggiunti a 50-55 gradi Celsius.
Quando si versano i piatti, le bolle possono scoppiare fiammandole. Le piastre raffreddate e solidificate devono essere datate e conservate a quattro gradi Celsius in un involucro di carta stagnola. Hanno preparato anche il brodo LB fatto con acqua ultra pura e dosato con 50 microgrammi per millilitro di tetraciclina.
Conservare il brodo a quattro gradi Celsius e avvolgerlo nella carta stagnola. Ora le scorte di fluorescenza di pseudomonas conservate a -80 gradi Celsius sulle piastre LB, striano le piastre a zig-zag e le incubano durante la notte a 30 gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, raccogli una colonia dalla piastra e inocula una fiaschetta di S one appena preparata incubata durante la notte a 30 gradi Celsius con 150 giri/min di agitazione.
Misurare la densità ottica della coltura dopo l'incubazione. Quindi fai la soluzione S due. Aggiungere cinque millilitri di LB a un tubo di plastica, quindi aggiungere una quantità sufficiente di soluzione S one per un OD a 600 nanometri di 0,1, che è tipico per un esperimento sul biofilm.
Innanzitutto, imposta l'esperimento utilizzando una pinzetta Collega i tubi di plastica con un diametro interno di 0,20 pollici agli ingressi e alle uscite del chip preparato. I tubi devono essere flessibili e sufficientemente lunghi. Qui sono circa 20 pollici.
Quindi riempire le siringhe con la soluzione S two. Applicare aghi smussati calibro 30 e rimuovere le bolle. Impedire alle bolle d'aria di entrare nel canale è un passaggio critico, soprattutto a causa della durata della linea dell'esperimento.
Le bolle possono danneggiare le strutture morbide formate dai batteri. Quindi collegare le siringhe ai tubi di ingresso e collegare i tubi di uscita ai contenitori dei rifiuti. Ora posiziona le siringhe in una pompa a siringa e imposta la pompa sulla portata desiderata, ad esempio otto microlitri all'ora su un microscopio dotato di una camera cellulare impostata sulla temperatura di incubazione.
Usa un obiettivo 40x, ad esempio per visualizzare il chip microfluidico. Ora avvia la pompa. Quando i batteri vengono introdotti nella camera, viene avviata anche la formazione di biofilm.
Il biofilm si formerà e maturerà per ore, giorni, scatterà immagini per seguirne i progressi. Utilizzando il chip microfluidico fabbricato SEMA è stato ripreso l'immagine. L'ingresso a forcella è creato per equalizzare la testa di pressione attraverso il dispositivo.
Si può anche vedere che le pareti dei pilastri sono quasi verticali. Per esaminare la formazione di biofilm per la fluorescenza sono stati iniettati nel dispositivo a otto microlitri all'ora. La formazione del biofilm è iniziata dopo pochi minuti dall'infusione della coltura batterica diluita.
Tuttavia, dopo alcune ore, è stata osservata la comparsa di strutture filamentose che si estendono tra micro pilastri vicino alla sezione centrale. L'ellisse tratteggiata delimita una stella filante in formazione formata da stelle filanti legate a un'estremità alla regione polare di uno dei micro pilastri. Stelle filanti sono state viste anche lungo la diagonale tra due micro pilastri.
Lo spessore delle stelle filanti è aumentato con il tempo a causa della divisione cellulare e dell'incorporazione di batteri planctonici. Hanno anche proliferato con il tempo che gli streamer che occupano un grande volume nel dispositivo hanno portato alla formazione di biofilm maturo, che potrebbe intasare il dispositivo. Una simulazione meccanica del flusso attraverso il dispositivo mostra che le stelle filanti inizialmente si orientano lungo le linee di flusso del fluido.
Inoltre, nella fase iniziale, gli streamer hanno origine in luoghi di massima velocità di flusso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come si formano ed evolvono gli streamer di biofilm in un ambiente microfluidico. Non dimenticare che lavorare con i batteri può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i protocolli di biosicurezza.
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Panoramica
Questo articolo discute i protocolli per lo studio della formazione del biofilm utilizzando un dispositivo microfluidico progettato per imitare i mezzi porosi. L'attenzione è focalizzata sull'indagine della formazione del biofilm di Pseudomonas fluorescens all'interno di questo dispositivo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Microfluidica
- Formazione del biofilm
- Comportamento batterico
Sfondo
- I dispositivi microfluidici possono replicare ambienti complessi.
- Pseudomonas fluorescens è un organismo modello per gli studi sul biofilm.
- Comprendere la formazione del biofilm è cruciale per varie applicazioni.
- Visualizzare i flussi batterici migliora la comprensione delle dinamiche del biofilm.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare la formazione di flussi batterici in un setup microfluidico.
- Investigare il comportamento di Pseudomonas fluorescens in un ambiente controllato.
- Fornire una rappresentazione visiva dello sviluppo del biofilm.
Metodi utilizzati
- Fabbricazione di un chip microfluidico con micro pilastri.
- Coltivazione di Pseudomonas fluorescens per la sperimentazione.
- Assemblaggio del setup sperimentale per l'osservazione del biofilm.
- Iniezione di batteri nel dispositivo microfluidico e raccolta dei dati.
Risultati principali
- L'evoluzione temporale dei flussi batterici è stata catturata con successo.
- La microscopia a fluorescenza ha fornito immagini chiare della formazione del biofilm.
- I risultati hanno dimostrato le dinamiche dello sviluppo del biofilm.
- Gli ausili visivi hanno migliorato la comprensione del processo sperimentale.
Conclusioni
- Il dispositivo microfluidico imita efficacemente i mezzi porosi per gli studi sul biofilm.
- Pseudomonas fluorescens serve come modello prezioso per la ricerca sul biofilm.
- Le dimostrazioni visive sono essenziali per comprendere procedure complesse.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables the study of bacterial biofilm streamers in a microfluidic environment that mimics porous media, offering a controlled system to investigate microbial adhesion and colonization dynamics relevant to industrial fouling and environmental processes. By visualizing filamentous biofilm formation under flow, researchers can assess early-stage biofilm development mechanisms that inform anti-fouling strategies and bioprocess optimization. The approach supports mechanistic de-risking in target validation for antimicrobial or biofilm-disrupting interventions by providing quantitative, reproducible observations of streamer initiation and maturation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bacterial adhesion and extracellular matrix production under controlled flow conditions to validate targets involved in biofilm initiation.
- Operational Value: Provides a reproducible microfluidic platform for screening genetic or chemical modulators of streamer formation in Pseudomonas fluorescens.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved fluorescence microscopy readouts of streamer thickness and coverage for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes biofilm formation conditions through precise flow rate control and chip geometry, enhancing assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports evaluation of biofilm-disrupting compounds in a disease-relevant system that mimics microbial colonization in industrial or environmental niches.
- Operational Value: Enables preclinical continuity by linking microfluidic observations to macroscopic biofilm outcomes such as device clogging and flow obstruction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for programs focused on anti-infective or anti-fouling agents where biofilm formation is a key liability.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by visualizing how genetic or chemical perturbations affect streamer initiation and elongation between micro-pillars.
- Screening: Delivers standardized, quantitative imaging outputs that allow comparison of biofilm formation across experimental conditions.
- Analytics: Enables measurement of streamer thickness, orientation, and surface coverage over time to assess compound efficacy.
- Translational Research: Connects microfluidic observations to preclinical relevance by modeling biofilm development in structured environments analogous to medical or industrial surfaces.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular microfluidic platform adaptable to other bacterial strains or flow conditions for broad R&D application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in biofilm formation by isolating the effect of flow and surface topology on streamer development.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through soft-lithography fabrication and controlled bacterial inoculation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimicrobial programs by providing early predictive confidence in biofilm inhibition efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their ability to prevent streamer-mediated biofilm maturation and system fouling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, sterile bacterial handling, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to cleanroom equipment for PDMS molding and oxygen plasma bonding.
- Necessitates standardization of flow rates, bacterial inoculum, and incubation timing across users and sites.
- Adaptation to other bacterial species may require optimization of culture conditions and surface compatibility.
- Practical limitations include potential channel clogging at advanced biofilm stages, necessitating endpoint timing for imaging.
