Name: Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Impara la formazione di biofilm streamer in un dispositivo microfluidico con micro-pilastri utilizzando Pseudomonas fluorescens. Questo metodo permette di visualizzare l'evoluzione temporale dei biofilm mediante microscopia a fluorescenza.

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Gli autori desiderano ringraziare il professor Howard Ceri del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università di Calgary per aver fornito ceppi batterici. A. Kumar riconosce il supporto del NSERC. T. Thundat riconosce il sostegno finanziario del programma Canada Excellence Research Chair (CERC). Gli autori desiderano anche ringraziare la signora Zahra Nikakhtari per l'aiuto con la videografia.

Eseguire i protocolli sperimentali qui nell&#39;ordine descritto di seguito. Protocolli di microfabbricazione per la creazione della piattaforma microfluidica sono discussi nel Passo 1 Passo 2 descrive il protocollo di coltura batterica (Figura 2), e punto 3 riguarda il montaggio del setup sperimentale (Figura 3). Infine, la fase sperimentale attuale è descritta al punto 4. 1 Chip Fabrication Procedura NOTA: La corretta procedure di sicurezza devono essere seguite per i processi descritti di seguito. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli. <ol><li> Progettare la maschera con un software appropriato (ad esempio, L-Edit). La progettazione canale è composto da un micro-canale di larghezza di 625 micron. La regione centrale del canale contiene una serie di micro-messaggi di 50 micron di diametro, distanziati di 25 micron a parte (vedi Supplemental Files). </li><li> Stampa questo disegno su vetro (5 &quot;x 5&quot; vetro soda lime), Che ha uno spessore di 0.09 &quot;ed è rivestito da circa 70 nm spesso strato di cromo (Cr), utilizzando mascheratura per preparare una maschera fotografico. Autore Utilizzo AZ400K per 1 min. Poi, etch strato Cr utilizzando Cr mordenzante per circa 1 min Usare acetone per togliere il resistere e pulirlo con soluzione piranha freddo. (H 2 SO 4 e H 2 O 2 in un rapporto di 3: 1). </li><li> Fotolitografia <ol><li> Pulire un wafer da 4 &quot;silicio standard chimicamente con una soluzione piranha per 20 min. </li><li> Sciacquare la cialda con acqua deionizzata e asciugare. </li><li> Riscaldare il wafer su una piastra calda (200 ° C per 15 min). </li><li> Rivestire il wafer di silicio con photoresist. Qui, il fotoresist AZ4620 positivo è stato spin-rivestito su un wafer di silicio a 2.000 rpm per 25 secondi per ottenere uno strato di spessore di 12,5 micron. </li><li> Rimuovere tutto il solvente dalla cottura morbida della fetta su una piastra calda per galleggiamento della fetta per 90 secondi in flusso di azoto a 100 ° C. Poi, tenerlo in vuoto a tegli stessa temperatura per 60 sec. </li><li> Posizionare la cialda in una scatola scura per 24 ore per disidratazione. </li><li> Esporre il wafer alla luce UV per trasferire il pattern progettato per il fotoresist. </li><li> Immergere il wafer in soluzione di sviluppo di fotoresist (AZ400K) per 240 sec. Poi, risciacquare il wafer con alcool isopropilico e asciugare mettendo in corrente di azoto. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (plasma accoppiato induttivamente - Deep Reactive Ion Etching) Processo <ol><li> Applicare DRIE incisione. Scegliere la profondità etch appropriata in base alla profondità finale richiesta per il dispositivo (50 micron in questa indagine). Photoresist agisce come uno strato di mascheratura durante questo processo. </li><li> Rimuovere il photoresist rimanente con acetone e pulire la cialda. </li></ol></li><li> PDMS (polidimetilsilossano) Casting <ol><li> Utilizzare trichloromethylsilane (TCMS) per silanizzanti stampo maestro di silicio. Versare 2 o 3 gocce di trichloromethylsilane in un flaconcino e metterlo in un essiccatore accanto alstampo maestro silicio. Consenti 2-3 ore per il processo silanizzante per completare. </li><li> In un contenitore separato, mescolare la base di silicone Sylgard 184 con induritore dal rapporto in peso di 10: 1 per preparare PDMS. Degassarla PDMS sottoponendolo a vuoto condizioni (circa 2 ore). </li><li> Mettete lo stampo maestro di silicio in un supporto. Poi, versare il PDMS sullo stampo maestro di silicio per formare il timbro PDMS. Assicurarsi che le bolle non si formano nei PDMS durante questo processo. </li><li> Curare le PDMS per 2 ore a 80 ° C. </li><li> Staccare il timbro PDMS dallo stampo master. Quindi, tagliare le PDMS bollo in microchip separati. Infine, utilizzare un nucleo di taglio per perforare fori per l&#39;ingresso (s) e di uscita (s). </li></ol></li><li> Incollaggio di PDMS al vetro <ol><li> Esporre il vetrino e PDMS bollo di plasma di ossigeno per 30 sec. Legame PDMS bollo per la polizza di copertura. </li><li> Per ottenere una corretta tenuta tra il timbro PDMS e il vetrino, temprare il dispositivo mettendolo in forno a 70 ° C per 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2 batterica Cultura NOTA: i protocolli di corretta biosicurezza deve essere seguita per i passaggi 2-4. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli. <ol><li> Preparare piastre LB Agar <ol><li> Aggiungere 20 g di Luria-Bertani (LB) agar (Miller) polveri e 500 ml di acqua ultrapura per un pallone da 1 L. Mescolare per sciogliere la polvere. </li><li> Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min. </li><li> Lasciare raffreddare il pallone fino a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d&#39;acqua nella cappa di biosicurezza. </li><li> Aggiungere l&#39;antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando. </li><li> Versare il composto in lastre. Riempire ogni piatto fino a 1/2 - 2/3 pieno. </li><li> Aria Fiamma bolle brevemente per farli scoppiare se fanno. Bolle d&#39;aria solidificati sono difficili da diffondere la cultura batterica sopra. </li><li> Lasciare le piastre a raffreddare a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Quando sono freschi,mettere lastre di nuovo nella loro manica, sigillare il sacchetto, etichetta (antibiotico e data), e conservare a 4 ° C. NOTA: Coprire lo stock di piastre con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici. </li></ol></li><li> LB Broth Preparazione <ol><li> Aggiungere 20 g Luria-Bertani (LB) brodo (Miller) polveri e 1 L di acqua ultrapura in un pallone. Mescolare per sciogliere la polvere. </li><li> Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min. </li><li> Lasciare pallone raffreddare a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d&#39;acqua nella cappa di biosicurezza. </li><li> Aggiungere l&#39;antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando. </li><li> Lasciar raffreddare, posizionare la bottiglia etichettata a 4 ° C. NOTA: Coprire la bottiglia con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici. </li></ol></li><li> Coltura dei batteri su una piastra di LB Agar (Questo protocollo utilizza Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Prendete il magazzino batterica dal congelatore (-80 °, C) e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Posizionare l&#39;° C magazzino batterica -80 e un piatto di agar LB all&#39;interno di una cappa di biosicurezza. </li><li> Streak il ceppo batterico su una piastra di agar LB a zig-zag. Coprire la piastra di agar e incubare a 30 ° C durante la notte. Infine, riporre il piatto in frigorifero a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione batterica (S1) <ol><li> Versare 50 ml di brodo LB supporto a un pallone autoclavato. Eseguire questa operazione all&#39;interno di una cappa di biosicurezza. </li><li> Trasferire una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB al pallone. Questa operazione deve essere eseguita all&#39;interno di una cappa di biosicurezza. </li><li> Mettere il pallone in un incubatore shaker a 30 ° C e 150 rpm per un tempo adeguato (4 ore). </li></ol></li><li> Preparare la soluzione batterica Diluire (S2) <ol><li> Versare 5 ml di LB supporti brodo in un tubo di plastica sterilizzata. </li><li> Diluire S1 mescolando con mezzi brodo LB. Quindi, agitare la soluzione. Diluire la soluzione raggiungere l&#39;ottica desiderataAl densità (OD misurata a 600 nm = 0,1). NOTA: esperimenti Biofilm tipicamente impiegano valori di OD in questa zona. </li></ol></li></ol> 3 Preparare il setup sperimentale <ol><li> Utilizzando le pinzette collegano tubi di plastica flessibili (0.20 &quot;ID) nella presa (s) e di uscita (s) del microchip. Gli ingressi e le uscite sono state precedentemente perforati nella porzione PDMS del microchip (fase 1.5.5). In questa indagine , il microchip è costituito da due ingressi ed una uscita. </li><li> Riempire la siringa (s) con la soluzione batterica (soluzione S2) e rimuovere tutte le bolle nella siringa (s). </li><li> Collegare punta della siringa (s) (30 G 0.5 &quot;ago smussato) in tubo di ingresso (s). Quindi, collegare il tubo di uscita (s) per i rifiuti del contenitore. </li></ol> 4 Esecuzione dell&#39;esperimento <ol><li> Collegare la siringa (s) per la punta della siringa (s). </li><li> Luogo e siringa fix (s) sulla pompa a siringa. Poi mettere il microchip sotto un microscopio ottico con lenti dell&#39;obiettivo di Desired ingrandimento (ad esempio, 40X). Coprire il microchip con un dispositivo di camera di cellule vive per mantenere un ambiente a temperatura costante per la crescita batterica (30 ° C per P. fluorescens). </li><li> Impostare la pompa al livello di portata desiderata (per esempio 10 ml / ora) ed avviare il pompaggio del fluido. </li><li> Una volta che i batteri vengono introdotti nella camera, è anche avviata la formazione di biofilm. Formazione di biofilm e maturazione si verificano in genere in un periodo di diverse ore o addirittura giorni. Osservare e prendere le immagini della crescita di biofilm attraverso il microscopio. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato un semplice dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi per lo studio dello sviluppo del biofilm in ambienti complessi. Ci sono diversi passaggi critici che determinano l&#39;esito degli esperimenti. Essi comprendono la geometria del dispositivo. Mentre la geometria del palo può variare, adeguato poro-spazio per bandierine per formare è necessario. Inoltre, Valiei et al. 1 hanno dimostrato che la formazione streamer si verifica solo in un determinato campo di portata. A por...

Recentemente, abbiamo dimostrato la dinamica di formazione di biofilm batterici in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi 1. Biofilm batterici sono essenzialmente colonie di batteri di superficie aggregati che sono racchiusi da sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 2-4. Questi film sottili di batteri possono formare in quasi ogni nicchia immaginabile che vanno da superfici lisce all&#39;habitat molto più complesso di mezzi porosi. Valiei et al. 1 usato un dispositivo microfluidico con una matrice di micro-pilastro per simulare una struttura di supporto porosa e studiato la formazione di biofilm in questo dispositivo in funzione della portata del fluido. Essi hanno scoperto che in un certo regime di flusso, biofilm filamentosi noti come stelle filanti hanno cominciato ad emergere tra i diversi pilastri. Streamers possono essere legati ad una o entrambe le estremità per superfici solide, ma il resto della struttura è sospesa in un liquido. Formazione Streamer inizia in genere dopo un primo strato di biofilm ha formato e il suo formatoione può dettare l&#39;evoluzione a lungo termine di biofilm in tali habitat complessi. Recentemente, alcuni ricercatori hanno studiato le dinamiche di formazione streamer. Yazdi et al. 5 ha mostrato che le fiamme possono formare nei flussi vorticosi provenienti da una bolla oscillante. In un altro esperimento, Rusconi et al. 6 studiato l&#39;effetto di curvatura del canale e della geometria del canale sulla formazione di stelle filanti. Essi hanno scoperto che le fiamme possono formare nelle sezioni curve di microcanali, e streamer morfologia è correlata alla motilità. Recenti ricerche hanno dimostrato che le fiamme possono avere ampie ripercussioni in vari scenari naturali e artificiali in quanto possono fungere da precursori della formazione di strutture maturi in interfacce porosi, portare a una rapida e catastrofica proliferazione di biofilm in sistemi biomedici, e anche causare notevoli flow interazioni struttura, ecc 1,7-9. Filanti Biofilm spesso formano ihabitat n complesse come mezzi porosi. Crescita biofilm intesa in ambiente mezzi porosi è rilevante per diversi processi ambientali e industriali come il trattamento biologico delle acque reflue 10, mantenendo ben-bore integrità in situazioni come la cattura di CO 2 11 e collegare dei pori nel terreno 12. Osservando la formazione di biofilm in tali habitat complessi spesso può essere difficile a causa della opacità dei mezzi porosi. In tali situazioni, le piattaforme multimediali porosi microfluidica base possono rivelarsi estremamente vantaggiosa in quanto consentono in tempo reale e monitoraggio in situ. Un altro vantaggio della microfluidica è la possibilità di costruire più bioreattori su un&#39;unica piattaforma bio-microfluidica e contemporaneamente consentire il monitoraggio e / o integrazione di sensori on-line. La flessibilità per implementare più esperimenti di laboratorio in un unico dispositivo e la capacità di raccogliere importanti dati pertinenti per l&#39;analisi statistica accurata è un adv importanteantage di sistemi microfluidici 13,14. Nel contesto della discussione di cui sopra, le dinamiche di formazione streamer comprensione in un ambiente mezzi porosi sarebbe utile per diverse applicazioni. In questo studio, sviluppiamo il protocollo per indagare la formazione streamer in un dispositivo che imita mezzi porosi. Realizzazione della piattaforma microfluidica, sono descritti i passi necessari per la cultura e la sperimentazione di cellule. Nei nostri esperimenti, il ceppo batterico tipo selvaggio di Pseudomonas fluorescens è stato impiegato. P. fluorescens, che si trova naturalmente nel suolo, svolge un ruolo chiave nel mantenimento ecologia del suolo 15. Il ceppo batterico impiegato era stato geneticamente per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) costitutivamente.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>sospendere 40 g in 1 L di acqua purificata</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>sospendere 20 g in 1 L di acqua purificata</td></tr><tr><td>Cappa di biosicurezza</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>sterile 100 mm x 15 mm in polistirene Petri</td></tr><tr><td>Agitatore per incubatore</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 Agitatore per incubatore serie</td></tr><tr><td>50 ml Tubo da centrifuga sterilizzato</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polipropilene Base priva di RNasi/DNasi</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td>103012 50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomero Base e agente indurente</td></tr><tr><td>Fotoresist positivo (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo di plastica</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo per il biofilm streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con micro-pilastri

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Diverse specie batteriche possiedono la capacità di attaccare alle superfici e colonizzare in forma di film sottili chiamati biofilm. I biofilm che crescono in mezzi porosi sono rilevanti per diversi processi industriali e ambientali come il trattamento delle acque reflue e di CO 2 sequestro. Abbiamo usato Pseudomonas fluorescens, un batterio aerobico Gram-negativi, per indagare la formazione di biofilm in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi. Il dispositivo di microfluidica è costituito da una serie di micro-posti, che sono stati fabbricati utilizzando soft-litografia. In seguito, la formazione di biofilm in questi dispositivi a flusso è stato studiato e ci dimostrano la formazione di biofilm filamentosi note come stelle filanti nel nostro dispositivo. Qui vengono fornite insieme ai protocolli di coltura batterica I protocolli dettagliati per la fabbricazione e l&#39;assemblaggio del dispositivo di microfluidica. Le procedure dettagliate per la sperimentazione con il dispositivo di microfluidica sono anche presentati insieme con il rappresentanterisultati.

Utilizzando il protocollo microfabbricazione sopra menzionato, un dispositivo microfluidico basato PDMS è stato costruito. Figura 1 mostra il microscopio elettronico a scansione (SEM) immagini del PDMS dispositivo. Figura 1a mostra la sezione di ingresso del dispositivo. Un ingresso a forcella è stato creato per equalizzare la testa di pressione attraverso il dispositivo. Ulteriori immagini SEM ha anche mostrato che le pareti pilastro sono quasi verticale (Figura 1b). L...

Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la formazione di filamenti batterici in un dispositivo microfluidico con micro pilastri. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto fabbricando il chip microfluidico. Il secondo passaggio della procedura consiste nel coltivare i batteri oggetto del test, in questo caso Pseudomonas fluorescence.Gli ultimi passaggi consistono nell'assemblare il sistema sperimentale, iniettare i batteri nel chip microfluidico e raccogliere i dati. In definitiva, i risultati possono mostrare l'evoluzione temporale degli streamer attraverso immagini di microscopia a fluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i diversi passaggi sono difficili da apprendere.A causa della natura interdisciplinare dell'esperimento, questa procedura richiede wafer di silicio con incisione ionica reattiva profonda. Il fotoresist sul wafer deve essere rimosso. Iniziare con il master mold silenziato.Aggiungere due o tre gocce di tricloroetilene in una provetta e posizionarla in un desiccante insieme al modello disposto con la superficie modellata rivolta verso l'alto, collocandolo accanto alla provetta. Dopo due o tre ore, il modello sarà silanizzato. Durante la silanizzazione, preparare la miscela di PDMS mescolando la base di silicone Cigar 1 8 4 con l'agente indurente in un rapporto di 10 a 1.Quindi sottoporre il PDMS a degasaggio sotto vuoto per circa due ore. Trasferire ora un wafer silanizzato su un supporto e versare il PDMS sopra, assicurandosi che non si formino bolle. Lasciare polimerizzare il PDMS sul wafer a 80 gradi Celsius per due ore.Questo produce un timbro A-P-D-M-S dallo stampo di silicio dimensionato. Al termine della polimerizzazione, rimuovere il timbro in PDMS con l'aiuto di un cutter. Quindi tagliare il timbro per ottenere un chip microfluidico utilizzando il cutter.Ora, utilizzando un trapano a corona, eseguire dei fori nelle posizioni di ingresso e di uscita sullo stampo. Il passaggio successivo consiste nell'unire lo stampo al vetro. Esporre un coprioggetto da 24 millimetri e lo stampo in PDMS a un plasma di ossigeno per 30 secondi.Dopo l'esposizione, fissare il vetrino sul lato inferiore del timbro in PDMS e si formerà un legame. Posizionare l'insieme in un forno a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Per completare il processo relativo a questo protocollo, preparare piastre LB realizzate con acqua ultrapura e addizionate con 50 microgrammi per millilitro di tetraciclina aggiunti a una temperatura compresa tra 50 e 55 gradi Celsius.Quando si versano le piastre, le bolle possono essere eliminate passandole alla fiamma. Le piastre raffreddate e solidificate devono essere datate e conservate a quattro gradi Celsius in un involucro di carta stagnola. Inoltre, preparare in anticipo del brodo LB ottenuto con acqua ultrapura e addizionato con 50 microgrammi per millilitro di tetraciclina.Conservare il brodo a quattro gradi Celsius e avvolto nella pellicola di alluminio. Ora coltivare ceppi di pseudomonas fluorescence conservati a meno 80 gradi Celsius su piastre LB, tracciare le piastre in un modello a zigzag e incubarle per tutta la notte a 30 gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, selezionare una colonia dalla piastra e inoculare un matraccio contenente S uno appena preparato, incubato per tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 150 RPM.Misurare la densità ottica della coltura dopo l'incubazione. Preparare quindi la soluzione S due. Aggiungere cinque millilitri di LB in un tubo di plastica, quindi aggiungere una quantità sufficiente della soluzione S uno per ottenere un OD a 600 nanometri di 0,1, valore tipico per un esperimento con biofilm.Per prima cosa, impostare l'esperimento utilizzando pinzette. Collegare tubi di plastica con un diametro interno di 0,20 pollici agli ingressi e alle uscite del chip preparato. I tubi devono essere flessibili e sufficientemente lunghi. In questo caso, sono circa 20 pollici.Poi riempire le siringhe con la soluzione S2. Applicare aghi ottusi da 30 gauge ed eliminare le bolle d'aria. Evitare che bolle d'aria entrino nel canale è un passaggio critico, soprattutto a causa della lunga durata dell'esperimento.Le bolle possono danneggiare le strutture morbide formate dai batteri. Collegare quindi le siringhe ai tubi di ingresso e i tubi di uscita ai contenitori di scarto. Posizionare ora le siringhe in una pompa per siringhe e impostare la pompa alla portata desiderata, ad esempio otto microlitri all'ora, su un microscopio dotato di una camera per cellule regolata alla temperatura di incubazione.Utilizzare un obiettivo 40x per visualizzare il chip microfluidico. Ora, avviare la pompa. Quando i batteri vengono introdotti nella camera, ha inizio anche la formazione del biofilm.Il biofilm si formerà e maturerà per ore, giorni; acquisire immagini per seguirne l'andamento. È stato utilizzato un chip microfluidico realizzato mediante SEMA per l'acquisizione delle immagini. L'ingresso a forma di forcella è stato creato per equalizzare il carico di pressione lungo il dispositivo.Si può inoltre osservare che le pareti dei pilastri sono quasi verticali. Per esaminare la formazione del biofilm, dei fluorocromi sono stati iniettati nel dispositivo a una velocità di otto microlitri all'ora. La formazione del biofilm è iniziata dopo alcuni minuti dall'infusione della coltura batterica diluita.Tuttavia, dopo alcune ore è stata osservata l'apparizione di strutture filamentose che si estendevano tra i microperni nella regione centrale. L'ellisse tratteggiata delimita un flusso in formazione; i flussi si formavano ancorati a un'estremità alla zona polare di uno dei microperni. Flussi sono stati osservati anche lungo la diagonale tra due microperni.Lo spessore dei filamenti aumentava nel tempo a causa della divisione cellulare e dell'incorporazione di batteri planctonici. Con il passare del tempo, i filamenti proliferavano occupando un ampio volume all'interno del dispositivo, portando alla formazione di un biofilm maturo, che poteva ostruire il dispositivo. Una simulazione meccanica del flusso attraverso il dispositivo mostra che inizialmente i filamenti si orientano lungo le linee di flusso del fluido.Inoltre, nella fase iniziale, i filamenti si originano in corrispondenza dei punti di massima velocità del flusso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come si formano ed evolvono i filamenti di biofilm in un ambiente microfluidico. Non dimenticare che lavorare con batteri può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come le norme di sicurezza biologica durante l'esecuzione di questa procedura.

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