Ridotto gravità ambiente hardware Dimostrazioni di un prototipo miniaturizzato Citofluorimetro e Companion Microfluidic tecnologia di miscelazione

L'obiettivo generale di questa procedura è far funzionare un citometro a flusso miniaturizzato a bordo di un volo parabolico in condizioni di gravità ridotta, utilizzando preparazione dei componenti e procedure in volo potenzialmente adattabili ad altri allestimenti. Questo risultato si ottiene innanzitutto selezionando attentamente componenti commerciali e realizzati su misura, scelti per facilità d'uso e sicurezza in condizioni di gravità ridotta. Il secondo passaggio consiste nell'assemblare i componenti all'interno di un banco di prova per volo parabolico, contenente elementi aggiuntivi per il contenimento, la visualizzazione, l'automazione e la facilitazione di più dimostrazioni.

Successivamente, il team si prepara per sperimentazioni di successo in volo attraverso una pianificazione accurata, lo sviluppo di protocolli e un adeguato addestramento. L'ultimo passaggio prevede dimostrazioni in volo con componenti multipli. In definitiva, i test in volo parabolico vengono utilizzati per illustrare le potenziali applicazioni spaziali della tecnologia e per identificare gli effetti delle variazioni di gravità in condizioni di assenza di peso e delle vibrazioni sulle prestazioni.

Sebbene questo metodo possa essere applicato alla citometria a flusso e alle tecnologie correlate, può essere parzialmente applicato anche ad altri tipi di test diagnostici individuali in condizioni di gravità ridotta, in particolare a qualsiasi procedura che preveda più dimostrazioni o procedure di attivazione. Per questo motivo abbiamo deciso di realizzare questo video per JO sul test in volo parabolico, perché quando ci stavamo preparando per i nostri voli parabolici con la NASA, fondamentalmente non esistevano molti video né tantomeno letteratura che descrivesse nel modo più accurato come prepararsi al meglio per gli esperimenti. Abbiamo dovuto effettivamente sforzarci molto per parlare con le persone giuste in diverse sedi della NASA al fine di recuperare queste informazioni qui.

In questo caso, desideriamo condividere queste informazioni con i lettori di JoVE, in modo che possano prepararsi adeguatamente anche a questi voli. La costruzione di un semplice sistema di citometria a flusso per l'uso in condizioni di gravità ridotta richiede diversi componenti prototipali di fluidica, ottici ed elettronici. Iniziare preparando un sistema a pressione con esigenze minime di peso e potenza per azionare il sistema.

La componentistica fluidica collega una pompa d'aria miniaturizzata a un sensore di pressione differenziale. Successivamente, assemblare un contenitore per la sorgente fluidica che possa essere caricato senza intrappolare bolle d'aria. Un flacone di plastica rigida con un diaframma di gomma elastico, un tappo fissabile saldamente e un tubo di ingresso dell'aria alla base del flacone.

Sigillare il collegamento del tubo dell'aria in entrata utilizzando un adesivo ottico. Posizionare una pinza per vetrino temporanea sul tubo di uscita del tappo per evitare l'espulsione di liquido durante e dopo l'inserimento del tappo. Per caricare la provetta, espandere il diaframma con una siringa collegata all'ingresso dell'aria.

Versare il liquido fino all'orlo e inserire il tappo con un angolo tale da non intrappolare aria al di sotto. Rimuovere brevemente la pinza della lamella per preparare il tubo di uscita e rilasciare la pressione di collasso esercitata dalla membrana. Assicurarsi che la pompa pressurizzi la provetta senza perdite di aria o di liquido.

Comprimere il diaframma per spingere il flusso del fluido fuori dal tubo di uscita del cap. Il terzo componente necessario è un contenitore per i rifiuti di fluido, per raccogliere gli scarti senza generare una pressione di contropressionamento che comprometta il flusso. Utilizzare un vial incollato all'interno di un altro vial progettato per un contenimento doppio.

Chiudere le provette con un tappo in spugna di gomma fissato che trattiene i liquidi galleggianti, ma permette l'equalizzazione della pressione atmosferica con l'ambiente della cabina, per realizzare un caricatore di campioni adatto all'uso in condizioni di gravità ridotta. Assemblare un sistema di morsetto a molla con guide lineari in modo da bloccare in modo affidabile un capillare con guaina tra due O-ring nella linea fluida. Assicurarsi che, in assenza del capillare, le molle premano gli O-ring l'uno contro l'altro per chiudere la linea fluida e permettere l'invio del fluido iniziale senza perdite. Progettare un micromiscelatore che non richieda componenti meccanici alimentati per funzionare.

Utilizzando il metodo rapido di prototipazione in polimetilmetacrilato, si sceglie e si realizza un miscelatore microfluidico a spirale con doppia entrata per rilevare singole particelle in flusso. Montare un blocco ottico miniaturizzato su misura delle dimensioni di un palmo su una piastra per microscopio utilizzando componenti optomeccanici disponibili in commercio. L'ultimo passaggio nell'assemblaggio del prototipo consiste nel progettare l'elettronica e il software per il controllo del dispositivo e l'acquisizione dei dati.

Per comodità e per la prototipazione iniziale, utilizzare componenti saldati a mano collegati a schede di acquisizione dati commerciali, codice e programma, e un software personalizzato per gestire i dispositivi dell'apparato e sincronizzare tutti i dati. Rimuovere la batteria del laptop e impostare il laptop in modo che funzioni esclusivamente tramite il cavo di alimentazione. Per motivi di sicurezza durante i voli a gravità ridotta, lo schema di alimentazione elettrica per l'alimentazione di tutti i dispositivi deve includere un meccanismo per lo spegnimento elettronico rapido e completo.

In volo. Un'unica presa multipla con un singolo pulsante di accensione e spegnimento è collegata al pannello di distribuzione dell'alimentazione dell'aeromobile; per garantire un corretto funzionamento in volo, è necessario considerare lo spazio totale disponibile e come verrà suddiviso tra lo spazio occupato dall'apparato sperimentale e lo spazio a disposizione dell'utente intorno all'apparato. Lo spazio totale disponibile è limitato a un'area più piccola rispetto a quella prevista per una dimostrazione analoga effettuata a terra.

Stabilire quali componenti è più opportuno raggiungere da una posizione accovacciata a livello del pavimento o in piedi. È inoltre importante considerare quali componenti trarranno maggior vantaggio dalla protezione offerta da una struttura di sostegno. La struttura di supporto del sistema qui descritta è un rack verticale per apparecchiature in grado di resistere alle accelerazioni durante il volo e che può essere fissato in modo sicuro all'aeromobile previsto.

I componenti assegnati al pavimento della cabina sono stati posizionati su diversi livelli all'interno del rack: un livello superiore per posizionare il laptop, un livello centrale del rack per contenere i sottocomponenti del prototipo e un livello inferiore per contenere salviette aggiuntive, guanti e un contenitore per rifiuti vari. Per fissare e contenere il prototipo e per osservare i campioni, è necessario realizzare o adattare diversi componenti non prototipali. Tra questi vi sono una scatola personalizzata in acrilico per contenere l'elettronica e una cappa a guanti in acrilico personalizzata, dotata di fori per l'inserimento delle braccia, che fornisce uno spazio cubico in cui eseguire una dimostrazione del caricatore senza rischiare di contaminare l'interno della cabina di volo.

Per registrare una dimostrazione del bullone del micromiscelatore, collegare un microscopio stereoscopico alla piastra breadboard dotata di un supporto personalizzato in acrilico per chip e di una telecamera CCD. Per consentire una dimostrazione sicura del blocco ottico, utilizzare una scatola opaca personalizzata in acrilico per bloccare la luce ambientale e controllare i rischi associati al laser. Alcune semplici strategie di progettazione possono eliminare la necessità di tubazioni manuali, regolazioni in tempo reale o altre operazioni che richiedono una notevole destrezza.

Ad esempio, per pressurizzare contemporaneamente più file sorgente, utilizzare una macchina personalizzata per la pressurizzazione di un collettore costituito da un cilindro cavo, adattato a un ago di ingresso e a più tubi di uscita per controllare la direzione del flusso del fluido. Utilizzando il computer, assemblare un pannello di valvole solenoidi a tre vie, controllate da interruttori MOSFET in serie collegati a una scheda DAQ.

Le valvole solenoidi a tre vie hanno un collegamento comune che è sempre connesso al collegamento predefinito di stato spento o a quello di stato acceso. L'attivazione dello stato acceso avviene mediante un segnale di cinque volt. Programmare il software in modo da procedere con le dimostrazioni attraverso interventi con un singolo pulsante, come un singolo clic sul laptop per commutare lo stato delle valvole o modificare la pressione di alimentazione della pompa.

Questo evita la necessità di regolazioni manuali dei tubi, che potrebbero causare perdite nell'ambiente e perdita di tempo sperimentale in un ambiente caotico. La dimostrazione del caricatore di campioni include il caricamento di un campione e il trasferimento del campione fino al blocco ottico o OB per il rilevamento. L'allestimento utilizza due valvole, una prima e una dopo il caricatore.

Durante il caricamento, entrambe le valvole sono impostate su spento, impedendo il movimento del fluido mentre si utilizza il caricatore; l'attivazione delle valvole apre il percorso fluido X che si estende dalla fiala di soluzione salina alla fiala di scarto, consentendo alla pompa di spingere il campione per l'analisi. La dimostrazione del blocco ottico comprende il rilevamento sequenziale di tre diversi tipi di campione senza la necessità di modificare manualmente i collegamenti dei tubi; la soluzione salina è in grado di lavare il sistema tra un campione e l'altro. La dimostrazione del micromiscelatore include segmenti di miscelazione di sangue e soluzione salina e di miscelazione di coloranti blu e giallo.

L'allestimento utilizza due valvole per indirizzare la pressione verso le fiale di sangue e soluzione salina o verso le fiale di colorante, in modo che solo una dimostrazione di miscelazione sia attiva alla volta. Una valvola aggiuntiva consente l'iniezione di bolle d'aria nel chip di miscelazione tra sangue e soluzione salina. Il sistema deve essere predisposto per sopportare brusche sollecitazioni meccaniche, vibrazioni o urti tra passeggeri durante il volo.

Per la stabilizzazione dell'allineamento, applicare una resina epossidica a rapida essiccazione sui componenti allineati che possono essere facilmente spostati, in particolare i componenti ottici. Applicare anche una resina epossidica di grado industriale sopra quella a rapida essiccazione per fissare altri componenti secondo necessità, inclusa l'aggancio della telecamera CCD al pezzo I del microscopio per i test di disturbo fisico. Scuotere la struttura di supporto del dispositivo con tutti i componenti al loro posto.

Verificare il funzionamento dei singoli componenti dopo aver sottoposto l'apparato alla perturbazione, in particolare i componenti ottici allineati predisposti per eventi imprevisti in volo, inclusa la stabilizzazione improvvisa dell'aereo a metà di un esperimento o l'applicazione di forze repentine sull'apparato. Proteggere i passeggeri in levitazione aggiungendo imbottitura al telaio. Gli angoli formano più persone come operatori principali per gestire con perizia il dispositivo in volo.

Non è prevedibile chi si ammalerà durante il parais e un determinato utente potrebbe non essere colpito in un volo e ammalarsi in un altro. Controllare l'apparato dopo il trasporto al luogo del volo, effettuando tutte le riparazioni necessarie e configurando i collegamenti dei tubi prima del caricamento sull'aeromobile. Ogni giorno di volo, preparare e collegare le provette campione corrispondenti alle dimostrazioni della giornata.

Prepararsi a possibili lunghi intervalli tra l'allestimento e l'esperimento, nonché ad alte temperature ambientali, a seconda della località del volo. Evitare il mal d'aria durante il volo assumendo i farmaci forniti, come scopolamina con anfetamina, e utilizzare le prime parabole per abituarsi alle transizioni di gravità alzandosi lentamente in posizione parallela al pavimento e sdraiandosi completamente durante i periodi di alta gravità. Una volta in posizione di volo, gli operatori dell'apparato, quando ci si avvicina allo spazio aereo dedicato alle parabole, devono disporre di spazio sufficiente per potersi sdraiare durante gli intervalli di alta gravità e per consentire l'accesso alle cinghie delle gambe all'inizio delle parabole.

Non applicare forze eccessive al corpo durante la gravità ridotta, poiché ciò potrebbe far salire il corpo troppo rapidamente e in modo potenzialmente pericoloso per eseguire la dimostrazione del caricatore di campioni. Quando l'aereo entra nella fase di gravità ridotta, utilizzare la siringa del campione per depositare una goccia della miscela di colorante con perline di conteggio sulla punta di un dito. Per simulare un campione da puntura del dito, utilizzare un componente capillare monouso per prelevare il campione dal dito e caricarlo nel caricatore capillare.

Introdurre il campione nel sistema ottico per la rilevazione. Eseguire la dimostrazione del miscelatore microfluidico posizionato sotto il microscopio. Mescolare sangue e soluzione fisiologica in rapporto uno a uno a 1,52345 e sei PSI per almeno due parabole ciascuna.

Registrazione di dati video sincronizzati con altre letture. Qui viene mostrato un filmato reale durante il volo di una dimostrazione di un miscelatore. Iniettare aria nell'ingresso di soluzione salina per verificare se l'architettura del canale intrappolerà una bolla che potrebbe impedire un mescolamento ottimale. Mescolare.

Coloranti alimentari blu e gialli a 1,52345 e sei PSI per almeno due parabole ciascuna. Ancora una volta, i dati sincronizzati registrati mostrati qui sono risultati rappresentativi di due dimostrazioni di micromiscelazione osservate mediante una telecamera CCD montata sul pannello del microscopio stereoscopico. Il pannello A mostra il mescolamento di coloranti blu e giallo in condizioni di microgravità, e il pannello B mostra il mescolamento di sangue e soluzione salina in condizioni di gravità lunare.

La miscelazione può essere valutata visivamente in qualsiasi punto del canale a spirale e anche nel canale di uscita, dimostrando il rilevamento ottico mediante blocco di cellule bianche del sangue marcate con fluorescenza durante il volo in microgravità. Le metriche critiche di prestazione per i dati di citometria a flusso includono il coefficiente di variazione delle intensità di picco, i rapporti segnale-rumore, le frequenze di conteggio dei picchi e l'efficienza di rilevamento, come mostrato qui. Il rilevamento ottico mediante blocco sembra relativamente inalterato durante la transizione da circa 1,5 G a quasi zero G e prosegue durante il ritorno a 1,5 g.

Il rilevamento di microsfere fluorescenti per il conteggio aggiunte a un campione caricato, dopo aver dimostrato il funzionamento del caricatore in condizioni di gravità lunare, indica che il campione è stato caricato correttamente e ha raggiunto il blocco ottico per il rilevamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione migliore di come eseguire i test del dispositivo e ridurre la gravità a bordo di un volo parabolico, e in particolare di quali tipi di procedure siano fattibili; una pianificazione accurata, la selezione delle componenti e l'implementazione dei test contribuiscono tutti a garantire un'elevata resa dell'esperienza.