Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare modelli di astrocitoma geneticamente modificati da tipi cellulari definiti per la caratterizzazione fenotipica in vitro e in vivo. Ciò si ottiene raccogliendo cellule primarie di tipo selvatico da topi geneticamente modificati condizionali neonatali non Cree per la coltura in vitro. Nella seconda fase, le cellule primarie vengono infettate con un vettore adenovirale che codifica per la ricombinazione Cree per indurre la ricombinazione genetica degli alleli F flox in vitro.

Successivamente, le cellule ricombinate vengono coltivate in serie per la loro caratterizzazione fenotipica. In definitiva, se le mutazioni definite promuovono l'agenesia di glio in specifici tipi di cellule neurali è determinato dalla caratterizzazione di fenotipi tumorali rilevanti in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave della neuro-oncologia come: quali sono le conseguenze fenotipiche delle mutazioni associate all'astrocitoma?

Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo preclinico di farmaci per gli astrocitomi, perché queste cellule geneticamente definite possono essere utilizzate in vitro e in vivo, in topi singenetici immunocompetenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di raccolta delle cellule e di iniezione ortotopica sono tecnicamente difficili e richiedono un'identificazione accurata delle strutture anatomiche. A dimostrare la procedura sarà Ryan Bash, un tecnico del mio laboratorio per raccogliere il tessuto cerebrale.

Iniziate usando le forbici da dissezione sterilizzate con etanolo per fare un taglio sagittale nella pelle sopra il cranio di un topo neonatale eutanasia di un giorno o di tre giorni, geneticamente modificato, dal midollo spinale al naso. Successivamente, praticare un taglio nel cranio lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale ed estendendosi oltre i bulbi olfattivi. Quindi usa una pinza curva per staccare delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente dal cervello usando micro pinze diritte.

Quindi, pizzicare delicatamente la porzione dorsale di ciascun emisfero corticale facendo attenzione a evitare il cervelletto e il bulbo olfattivo e posizionare il tessuto cerebrale in un piatto di coltura tissutale contenente H-B-S-S-N. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare due paia di micro pinze per rimuovere delicatamente le meningi da ciascun emisfero corticale e riposizionare il piatto di coltura tissutale sul ghiaccio per omogeneizzare il tessuto cerebrale. Per prima cosa, usa una lama di rasoio pulita per tagliare a dadini gli emisferi corticali.

Quindi spostare la piastra in una cappa di coltura tissutale e trasferire i pezzi di tessuto in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Sciacquare la piastra con un millilitro di HBSS ghiacciato e trasferire anche il lavaggio nel tubo. Dopo aver rimosso l'eccesso di HBSS a due millilitri di temperatura ambiente, incidere con EDTA nella provetta e associare ulteriormente i frammenti di tessuto pipettando su e giù circa 10 volte con una pipetta da un millilitro.

Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti. Mescolando accuratamente la soluzione cellulare mediante inversione ogni cinque minuti dopo l'incubazione, si mescolarono tre millilitri di terreno completo nella sospensione cellulare per inibire la tripsina pipettando su e giù 10 volte, come appena dimostrato. Quindi fai girare gli astrociti dissociati.

Rimuovere con cura la bocchetta con una pipetta da un millilitro e risospendere il pellet in quattro millilitri a 37 gradi Celsius. Media completi. Quindi trasferire la sospensione di astrociti in un pallone di coltura tissutale con tappo a vite T 75 e mantenere gli astrociti corticali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% circa 16 ore dopo il prelievo.

Lavare il pallone con quattro millilitri di 37 gradi Celsius HBSS. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno completo e mantenere gli astrociti corticali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Quando la coltura raggiunge circa il 95% di confluenza, agitare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Quindi rimuovere il terreno contenente le celle staccate e lavare la piastra con altri quattro millilitri di HBSS a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno completo fresco e incubare nuovamente le cellule 24 ore dopo aver arricchito la coltura per gli astrociti corticali. Rinfresca la coltura con due millilitri di terreno completo.

Quindi incubare le cellule con un millilitro di terreno completo contenente un microlitro di almeno un decimo del decimo pfu per millilitro dell'adenovirus di interesse a 32 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica a cinque. L'infezione da gfab CRE provoca un vantaggio proliferativo negli astrociti gfab ricombinati, aumentando la purezza degli astrociti dal 59% a oltre il 90% dopo cinque-nove passaggi in coltura. Dopo sei ore, rimuovere il terreno contenente il virus e incubare nuovamente la coltura in terreno fresco e completo.

Dopo che gli astrociti corticali sono stati raccolti a circa il 90% di confluenza e il numero di cellule appropriato viene risospeso in metilcellulosa ghiacciata al 5%. Inserire una siringa di vetro da 250 microlitri in un erogatore di antigene ripetuto, quindi collegare un ago smussato calibro 18 alla siringa. Utilizzare l'ago calibro 18 per aspirare gli astrociti corticali nella siringa e rimuovere eventuali bolle d'aria.

Quindi gettare l'ago calibro 18 e inserire un ago calibro 27 sulla siringa. Premere il pulsante sull'erogatore dell'antigene fino a quando il fluido non viene espulso dal nuovo ago per impiantare gli astrociti. Successivamente, fissare un animale ricevente immunocompetente di età compresa tra tre e sei mesi all'interno di una cornice stereotassica e praticare un'incisione sulla sutura sagittale lunga circa 0,5 centimetri tra le orecchie e gli occhi.

Individuare l'intersezione delle suture coronali e sagittali o il BRE MA, nonché l'intersezione del lambdoide nelle suture sagittali o il Lambda. Dopo essersi assicurati che BMA e lambda si trovino sullo stesso piano orizzontale, collegare la siringa e il dispenser di antigene ripetuto al telaio stereotassico sopra la testa dell'animale e portare la punta dell'ago a contatto con il bgma. Solleva leggermente l'ago dalla superficie del cranio e spostati di due millimetri lateralmente e di un millimetro rostrale dal bgma.

Quindi abbassare con cautela l'ago attraverso il cranio fino a destinazione. A quattro millimetri ventrali dalla MA breg e attivare il dispenser di antigene ripetuto. Una volta per iniettare cinque microlitri della sospensione cellulare.

Lasciare l'ago in posizione per due minuti per consentire alla pressione intracranica di equilibrarsi, quindi ritirare l'ago lentamente per un periodo di 30 secondi utilizzando un batuffolo di cotone per applicare pressione su eventuali sanguinamenti che potrebbero verificarsi. Infine, usa l'adesivo per tessuti per approssimare i bordi della ferita e per chiudere l'incisione, quindi posiziona l'animale in una gabbia pulita e calda per riprendersi. Gli xenotrapianti di linee cellulari umane consolidate richiedono ospiti immunodeficienti e generalmente non ricapitolano l'istopatologia degli astrocitomi umani.

Ad esempio, gli xenotrapianti ortotopici di U 87 MG formano tumori circoscritti che non invadono un cervello normale. Al contrario, l'iniezione di astrociti nulli T RRP nel cervello di topi singenici immunocompetenti produce tumori che ricapitolano le caratteristiche istologiche delle loro controparti umane, in particolare l'invasione del tessuto cerebrale normale. Per monitorare la crescita dell'allotrapianto TRP null, i topi sono stati sacrificati ogni cinque giorni dopo l'iniezione di cellule e il carico tumorale è stato determinato quantificando l'area tumorale sulle sezioni cerebrali colorate con h ed e.

È stato determinato che l'area tumorale aumenta esponenzialmente nel tempo e l'iniezione ortotopica di una volta 10 al quinto degli astrociti TP nll nel cervello ricevente ha portato alla morbilità neurologica. Con una sopravvivenza mediana di 22 giorni. L'imaging longitudinale in vivo è stato utilizzato per definire la cinetica di crescita del tumore.

Pertanto, in questo esperimento, gli astrociti TR penali e ingegnerizzati per esprimere la luciferasi sono stati iniettati nel cervello di singenici immunocompetenti. I compagni di cucciolata e la crescita del tumore sono stati determinati mediante imaging seriale a bioluminescenza. Un aumento di 15 volte della bioluminescenza è stato osservato per un periodo di 16 giorni.

Seguendo questa procedura, i test sui farmaci possono essere eseguiti in vitro e in vivo per determinare l'efficacia e testare nuove combinazioni di farmaci. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere astrociti corticali da topi geneticamente modificati condizionali che non esprimono crea, come indurre la ricombinazione genetica in vitro e come modellare la tumorgenesi utilizzando allotrapianti ortotopici in topi immunocompetenti.