Name: Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Scopri come generare modelli di astrocitoma geneticamente ingegnerizzati da astrociti corticali e cellule staminali neurali di topi condizionali. Questo metodo consente la caratterizzazione fenotipica in vitro e in vivo per studiare le mutazioni associate all'astrocitoma.

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CRM è un ricercatore clinico di Damon Runyon-Genentech. Questo lavoro è stato supportato, in parte, da sovvenzioni al CRM dalla Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), dal Dipartimento della Difesa (W81XWH-09-2-0042) e dal Fondo per la ricerca sul cancro dell'Università della Carolina del Nord (UCRF). Gli autori desiderano ringraziare Daniel Roth per l'assistenza nell'allevamento dei topi. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette e Susannah Krom per l'assistenza alla coltura dei tessuti e all'immunofluorescenza.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi più critici per assicurare la corretta raccolta e la cultura di astrociti corticali sono 1) di asportare la corteccia senza prendere il tessuto al di sotto del corpo calloso, 2) per togliere le meningi, 3) per dissociare completamente le cellule, e 4) per arricchire di GFAP + astrociti. Anche se abbiamo usato meccanica (scuotimento) e genetico (limitazione di ricombinazione genetica con un vettore Ad5GFAPCre o l&#39;utilizzo di una trasformazione transgene dominante (TgGZT 121) ...

Astrocitomi sono il tumore cerebrale primario più comune e glioblastoma (GBM), un astrocitoma di grado IV, è il sottotipo più comune e aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 12-15 mesi 1,2. Invasione di astrocitomi diffusi, in particolare GBM, preclude la resezione chirurgica completa, limita l&#39;efficacia delle terapie adiuvanti, e porta inevitabilmente alla post-trattamento recidiva 3. I pazienti inizialmente presenti sia con de novo (primario) GBM o con astrocitoma di grado inferiore che progredisce inevitabilmente (secondaria) GBM 4. GBM è genomicamente eterogeneo e caratterizzato da mutazioni si escludono a vicenda e co-si verificano in geni che governano tre principali vie di segnalazione: G 1 / S (Rb) checkpoint del ciclo cellulare, il recettore tirosin chinasi (RTK), e TP53 Percorsi di 5-7. GBM è composto da quattro sottotipi genomiche con profili di espressione distinti che assomigliano a diversi tipi di cellule del cervello, suggerendo che GBM sottotipo è influenfluenzati dalla sua cella di origine 6,8,9. Modelli di astrocitoma migliori sono tenuti a definire il ruolo di specifiche combinazioni di mutazioni in particolari tipi di cellule durante astrocitoma patogenesi. Sfruttando questi modelli per lo sviluppo di farmaci più efficaci preclinico in ultima analisi, contribuire a migliorare i risultati dei pazienti. Modelli di astrocitoma correnti comprendono stabilite linee cellulari umane, paziente derivante xenotrapianti (PDX), normali astrociti umani geneticamente modificati e cellule staminali neurali (NSC), e topi geneticamente ingegnerizzati (GEM) 10-14. Abbiamo sviluppato una alternativa, GEM non germinali (NGEM) modello 15 che utilizza cellule cerebrali primari - astrociti corticali e NSC - raccolti da GEM ospitare diverse combinazioni di alleli floxed oncogeni. L&#39;obiettivo era quello di generare modelli di astrocitoma con cellule geneticamente definite che potrebbero essere caratterizzati fenotipicamente sia in vitro che in vivo e potenzialmente utilizzabili per lo sviluppo di farmaci in preclinico itopi mmune-competenti. Linee cellulari umane Fondata sono il modello più comunemente usato di astrocitoma patogenesi e la risposta ai farmaci in vitro e in vivo. Essi sono tecnicamente semplice, ampiamente disponibile, e hanno definito cinetica e cancerogenicità su ortotopico xenotrapianto in topi immunodeficienti 10,11,16-18 . I loro svantaggi includono l&#39;incapacità di generare linee cellulari stabilizzate da astrocitomi di basso grado, limitando studio solo per astrocitoma di alta qualità; mancanza di una cella definita di origine; la presenza di anomalie genomiche complesse, spesso con profili genomici che si differenziano notevolmente dal campione del paziente originale; e suscettibilità fenotipica e genotipica deriva durante la cultura di serie nel siero 11,17,19-22. Le conseguenze fenotipiche delle singole mutazioni oncogene in linee cellulari GBM umani stabiliti possono essere mascherati dalla moltitudine di anomalie che sono effettivamente presenti, che spesso preclude elucidation delle conseguenze dirette genotipo-fenotipo. PDX sono generati attraverso il passaggio sottocutanea di cellule di astrocitoma-isolati di pazienti in topi immunodeficienti o attraverso la loro cultura come sferoidi non aderenti a definito, terreno privo di siero prima dell&#39;iniezione ortotopico nel cervello di topi immunodeficienti 12,23. PDX mantenere più accuratamente il paesaggio genomico di astrocitoma umano, ma simile a linee cellulari umane stabilite, l&#39;effetto fenotipico di singole mutazioni oncogene può essere mascherato a causa della loro complessità genomica 19,24. Per definire le conseguenze fenotipiche di specifiche mutazioni oncogene, in particolare in risposta alle nuove terapie, i pannelli di linee cellulari umane stabiliti o PDX sono spesso utilizzati per stabilire correlazioni genotipo-fenotipo, mostrare generalizzabilità, e ridurre al minimo la probabilità di effetti specifiche della linea di cellule. Mentre PDX ricapitolare con precisione le caratteristiche istopatologiche di astrocitoma umano, incLuding invasione, xenotrapianti ortotopici di linee cellulari umane stabiliti in genere non 21,23,25. Inoltre, normali astrociti umani e NSC sono stati geneticamente ingegnerizzato con mutazioni oncogene definite per modellare astrocitoma tumorigenesi in vitro e in vivo 13,14,26. Queste cellule non hanno la complessità genomica delle linee cellulari umane consolidate e PDX e ricapitolano accuratamente istopatologia astrocitoma umano, ma richiedono xenotrapianto nei roditori immunodeficienti in vivo. Poiché tutti i modelli cellulari umani richiedono host roditori immunodeficienti per evitare immuno-mediata rifiuto xenotrapianto, questi modelli non riescono a ricapitolare le interazioni tumore-stroma nativi di un sistema singeniche e mancano di un sistema immunitario intatto, limitando indagine preclinica di stroma-mirata e immuno-modulazione terapie 10,11. GEM permesso di esame delle conseguenze fenotipiche di combinazioni predeterminate di muta oncogenozioni in vivo durante la tumorigenesi in situ. Considerando che la GEM non-condizionale hanno mutazioni all&#39;interno di tutti i tessuti durante lo sviluppo, GEM condizionale hanno floxed alleli oncogeni che consentono il targeting di mutazioni limitando ricombinazione Cre-mediata di specifici tipi cellulari attraverso l&#39;uso di specifici del tipo di cellule promotori 10,11,15,18. Condizionale astrocitoma GEM sono stati utilizzati per chiarire i ruoli funzionali di mutazioni in oncogeni tipi cellulari distinti all&#39;interno di un cervello intatto 11. L&#39;utilità di preclinico in situ gliomagenesis usando GEM condizionale è limitato da una serie di fattori, tra cui 1) la mancanza di una correlazione in vitro, 2) la difficoltà nel generare grandi coorti di topi con genotipi complessi, 3) tempi di latenza delle nello sviluppo del tumore in situ , 4) e stocastico progressione tumorale. Perché in situ tumorigenesi manca un modello corrispondente in vitro, test anti-droga in vitro non può essere eseguita wesima modelli GEM condizionali convenzionali. A differenza di altri tipi di tumore, modelli GEM condizionali di astrocitoma sono raramente indotti da singole mutazioni oncogeniche 11. Pertanto, i regimi di allevamento complessi sono necessari per generare GEM condizionale con più mutazioni oncogene. Inoltre, astrocitoma iniziazione si verifica con penetranza variabile, dopo un lungo periodo di latenza in questi modelli, mentre la progressione di astrocitomi di alto grado si verifica in genere in modo non uniforme, stocastico modo e dà infine origine a tumori con complessi paesaggi genomiche e cinetica di crescita rapida 27, 28. La penetranza variabile e la natura stocastica della progressione maligna nei modelli GEM condizionale richiede che i singoli topi proiettati da radiografie per rilevare la presenza e la posizione di astrocitomi di alto grado prima del loro arruolamento negli studi preclinici di droga. Nel loro insieme, queste limitazioni ostacolano la generazione e la sperimentazione di grandi coorti di GEM condizionale necessario per prtest eClinical droga. Il sistema GEM RCAS-TVA, che utilizza retrovirali aviaria (RCA) vettori per infettare GEM ingegnerizzato per esprimere il recettore virale (TVA) su specifici tipi di cellule neurali, è stato ampiamente utilizzato per modellare astrocitoma tumorigenesi 11. In contrasto con GEM condizionale, questo sistema modello permette l&#39;introduzione di mutazioni multiple oncogeni in tipi specifici di cellule, senza la necessità di sistemi di allevamento complessi. Tuttavia, è limitato da penetranza variabile, il requisito per dividere attivamente le cellule per ottenere l&#39;integrazione virale, e l&#39;inserimento casuale di transgeni nel genoma dell&#39;ospite 29. GEM (NGEM) Modelli non germinali, che utilizzano le cellule raccolte da GEM, stanno diventando sempre più importanti perché superare molte delle limitazioni degli altri sistemi modello 15. Il ruolo di avvio tipo di cellula e mutazioni co-occorrenti in astrocitoma patogenesi sono difficili da scoraggiareminiera utilizzando stabilito linee cellulari umane GBM o PDX perché derivano da tumori allo stadio terminale che hanno accumulato ampi mutazioni genetiche in tipi cellulari non definiti nel corso della progressione maligna. Al contrario, tutti i tipi di astrocitoma possono essere modellati utilizzando NGEM inducendo definite mutazioni genetiche all&#39;interno di specifici tipi di cellule cerebrali purificate 11,30. Così, l&#39;influenza di mutazioni genetiche specifiche e tipo cellulare su fenotipi cellulari e molecolari può essere determinata in vitro e in vivo. Simile a linee di cellule GBM umani stabiliti, in vitro test iniziale in droga utilizzando NGEM può essere utilizzato per dare priorità farmaci per la sperimentazione in vivo che utilizzano le stesse cellule. Tumorigenesi in vivo può essere determinato da allotrapianto di cellule NGEM ortotopicamente nel cervello dei fratellini singeniche immuno-competente 30. Questi modelli trapianto allogenico ortotopici permettono quindi nei test in vivo non solo convenzionali citotossici unnd terapie mirate, ma immuno-modulante e terapie stroma mirate pure. Infine, il ruolo del microambiente sulla iniziazione tumorale e la progressione può essere determinata confrontando i risultati tra NGEM e modelli GEM convenzionali utilizzando le stesse mutazioni negli stessi tipi cellulari. Noi e altri abbiamo sviluppato astrocitoma NGEM utilizzando cellule primarie - astrociti, NSC, o cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) - raccolte da GEM 30-34. La logica alla base dello sviluppo di un astrocitoma NGEM era quello di creare un modello per determinare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni in oncogeni specifici tipi cellulari che potrebbero essere utilizzati per la sperimentazione preclinica dei farmaci in vitro e in vivo in animali immuno-competenti. Abbiamo raccolto astrociti fenotipicamente WT corticali e NSC da non esprimono Cre, GEM subordinata mantenuto su un 94% C57 / BL6 sfondo&gt; con floxed RB percorso - Rb1 loxP / loxP, o TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K pathway - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - geni in varie combinazioni 35-39. Siamo indotti ricombinazione genetica in vitro utilizzando vettori adenovirali codificanti Cre ricombinasi. Perché raccolti astrociti corticali contengono una miscela di tipi di cellule, abbiamo utilizzato vettori Ad5GFAPCre o transgeni oncogeni dominanti, come TgGZT 121 guidato dal promotore GFAP umana, per arricchire di GFAP + astrociti corticali in queste culture. Abbiamo definito le conseguenze fenotipiche della G 1 / S (Rb), MAPK, e mutazioni di PI3K pathway in astrociti corticali e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K pathway attivato G1 / S-difettosi astrociti molecolarmente imitato GBM umano proneurale e, a seguito di iniezione ortotopico, tumori formate in una posizione pre-definita con cinetica di crescita uniformi, brevi latenze, e la istopatologiciAL caratteristiche di GBM umano 30. Monitoraggio longitudinale della crescita tumorale in vivo aiuta droga test preclinici attraverso la normalizzazione delle coorti di trattamento e analisi quantitativa della crescita tumorale in risposta al trattamento 40. Abbiamo determinato cinetica di crescita tumorale da parte longitudinale bioluminescenza imaging topi iniettati con luciferasi che esprimono astrociti corticali. Pertanto, astrociti corticali e NSC derivate da GEM condizionale forniscono un sistema modello trattabili per la definizione delle conseguenze funzionali di mutazioni astrocitoma associate e di un sistema di potenziale modello per lo sviluppo di farmaci preclinico.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td>DMEM può essere acquistato anche da altri fornitori, tra cui GIBCOSigma e Cellgro</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione a punta affilata</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-395</td><td></td></tr><tr><td>Cartilagine Pinza per pollice, curva</td><td>Fisher Scientific</td><td>1631</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 17-301 Style 1 Pinze per gioiellieri, fine, 4</td><td>Miltex</td><td>17-301</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (200 proof)</td><td>Lamette da barba Decon Labs</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquido</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), Phenol Red</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td>Altre soluzioni di tripsina sono adatte anche per l'astrite corticale degli astrociti e la coltura</td></tr><tr><td>Piatto di coltura, 60 x 15 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>9380H77</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Stock di adenovirus</td><td>Trasferimento genico Vector Core, U. Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>Negozio in 5 &micro; l aliquote a -80 &deg;C. Pericoloso. Utilizzare le precauzioni di sicurezza Bsl2</td></tr><tr><td>Solfato di sodio (Na2SO4)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 238597</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di potassio (K2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221325</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sale</td> <td>di potassioSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)- Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa (0,22 &; m dimensione dei pori)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la proliferazione di Neurocult, mouse</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5702</td><td>Questo kit contiene il NeuroCult NSC Basal Medium e l'integratore NeuroCult NSC necessario per la coltura di NSC</td></tr><tr><td>Soluzione di eparina allo 0,2%</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>bFGF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td>Fare 10 mM stock in DMSO, negozio a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (40 &; micro; Corning</td><td></td> <td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione delle cellule staminali</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5707</td><td>In alternativa, utilizzare soluzioni enzimatiche delicate come l'Accutase</td></tr><tr><td>Methyl cellulosa 15 cP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x</td><td>Millipore</td><td>SLM-202-B</td><td>Per la produzione di una soluzione di metilcellulosa al 5%</td></tr><tr><td>1,7 ml Tappo a scatto Provetta per microcentrifuga</td><td>Corning</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton, 250 & micro; l LT senza ago</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-92</td><td></td></tr><tr><td>PB600-1 Dispenser di antigene</td><td>Hamilton</td><td> 83700</td><td></td></tr><tr><td>Aghi monouso da 18 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9015638</td><td></td></tr><tr><td>27 ga 1/2" ago con punta luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Unguento oftalmico</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>NC9689910</tr><tr><td>Modello 900 Telaio stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VETBOND</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9259532&nbsp;</td><td>Adesivo tissutale&nbsp;</td></tr><tr><td>Lidocaina&nbsp;</td><td>ShopMedVet</td><td>RXLIDO-EPI</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Kinetic</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Per imaging in vivo</td></tr><tr><td>D-Luciferina - Substrato bioluminescente al sale K+</td><td>PerkinElmer</td><td>122796</td><td>Per imaging a bioluminescenza in vivo</td></tr><tr><td>Kit di imaging EdU</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>MSCV Luciferase PGK-igro</td><td>Addgene</td><td>18782</td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione astrocitoma patogenesi in vitro e in vivo utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Gli attuali modelli di astrocitoma sono limitati nella loro capacità di definire i ruoli delle mutazioni oncogeniche in specifici tipi di cellule cerebrali durante la patogenesi della malattia e la loro utilità per lo sviluppo preclinico di farmaci. Al fine di progettare un sistema modello migliore per queste applicazioni, sono stati raccolti e coltivati in coltura astrociti corticali fenotipicamente wild-type e cellule staminali neurali (NSC) provenienti da topi condizionali geneticamente modificati (GEM) che ospitano varie combinazioni di alleli oncogenici floxati. La ricombinazione genetica è stata indotta in vitro utilizzando la ricombinazione adenovirale Cre-mediata, con conseguente espressione di oncogeni mutati e delezione di geni oncosoppressori. Le conseguenze fenotipiche di queste mutazioni sono state definite misurando la proliferazione, la trasformazione e la risposta ai farmaci in vitro. Per definire il ruolo delle mutazioni oncogeniche e del tipo di cellula sulla tumorigenesi in vivo, sono stati sviluppati modelli ortotopici di allotrapianto, in cui le cellule trasformate vengono iniettate stereotassicamente nel cervello di cucciolate immuno-competenti. A differenza della maggior parte degli xenotrapianti di linee cellulari di glioblastoma umano, l'iniezione di astrociti corticali trasformati derivati da GEM nel cervello di compagni di cucciolata immunocompetenti ha prodotto astrocitomi, incluso il sottotipo più aggressivo, il glioblastoma, che ricapitolava i segni distintivi istopatologici degli astrocitomi umani, inclusa l'invasione diffusa del parenchima cerebrale normale. L'imaging a bioluminescenza di allotrapianti ortotopici da astrociti trasformati ingegnerizzati per esprimere la luciferasi è stato utilizzato per monitorare la crescita tumorale in vivo nel tempo. Pertanto, i modelli di astrocitoma che utilizzano astrociti e NSC raccolti da GEM con alleli oncogenici condizionali forniscono un sistema integrato per studiare la genetica e la biologia cellulare della patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo e possono essere utili nello sviluppo preclinico di farmaci per queste malattie devastanti.

Abbiamo sviluppato un sistema modello NGEM con astrociti corticali e NSC raccolte da neonatale GEM l'ospitare floxed condizionali alleli oncogeni che possono essere caratterizzati fenotipicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Al fine di indagare le conseguenze delle mutazioni oncogeniche specificamente in astrociti corticali in vitro, è fondamentale per arricchire la prima per astrociti. Raccolti astrociti corticali contengono una miscela di microglia, astrociti, oligodendroc...

Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare modelli di astrocitoma geneticamente modificati da tipi cellulari definiti per la caratterizzazione fenotipica in vitro e in vivo. Ciò si ottiene raccogliendo cellule primarie di tipo selvatico da topi geneticamente modificati condizionali neonatali non Cree per la coltura in vitro. Nella seconda fase, le cellule primarie vengono infettate con un vettore adenovirale che codifica per la ricombinazione Cree per indurre la ricombinazione genetica degli alleli F flox in vitro.Successivamente, le cellule ricombinate vengono coltivate in serie per la loro caratterizzazione fenotipica. In definitiva, se le mutazioni definite promuovono l'agenesia di glio in specifici tipi di cellule neurali è determinato dalla caratterizzazione di fenotipi tumorali rilevanti in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave della neuro-oncologia come: quali sono le conseguenze fenotipiche delle mutazioni associate all'astrocitoma?Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo preclinico di farmaci per gli astrocitomi, perché queste cellule geneticamente definite possono essere utilizzate in vitro e in vivo, in topi singenetici immunocompetenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di raccolta delle cellule e di iniezione ortotopica sono tecnicamente difficili e richiedono un'identificazione accurata delle strutture anatomiche. A dimostrare la procedura sarà Ryan Bash, un tecnico del mio laboratorio per raccogliere il tessuto cerebrale.Iniziate usando le forbici da dissezione sterilizzate con etanolo per fare un taglio sagittale nella pelle sopra il cranio di un topo neonatale eutanasia di un giorno o di tre giorni, geneticamente modificato, dal midollo spinale al naso. Successivamente, praticare un taglio nel cranio lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale ed estendendosi oltre i bulbi olfattivi. Quindi usa una pinza curva per staccare delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente dal cervello usando micro pinze diritte.Quindi, pizzicare delicatamente la porzione dorsale di ciascun emisfero corticale facendo attenzione a evitare il cervelletto e il bulbo olfattivo e posizionare il tessuto cerebrale in un piatto di coltura tissutale contenente H-B-S-S-N. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare due paia di micro pinze per rimuovere delicatamente le meningi da ciascun emisfero corticale e riposizionare il piatto di coltura tissutale sul ghiaccio per omogeneizzare il tessuto cerebrale. Per prima cosa, usa una lama di rasoio pulita per tagliare a dadini gli emisferi corticali.Quindi spostare la piastra in una cappa di coltura tissutale e trasferire i pezzi di tessuto in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Sciacquare la piastra con un millilitro di HBSS ghiacciato e trasferire anche il lavaggio nel tubo. Dopo aver rimosso l'eccesso di HBSS a due millilitri di temperatura ambiente, incidere con EDTA nella provetta e associare ulteriormente i frammenti di tessuto pipettando su e giù circa 10 volte con una pipetta da un millilitro.Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti. Mescolando accuratamente la soluzione cellulare mediante inversione ogni cinque minuti dopo l'incubazione, si mescolarono tre millilitri di terreno completo nella sospensione cellulare per inibire la tripsina pipettando su e giù 10 volte, come appena dimostrato. Quindi fai girare gli astrociti dissociati.Rimuovere con cura la bocchetta con una pipetta da un millilitro e risospendere il pellet in quattro millilitri a 37 gradi Celsius. Media completi. Quindi trasferire la sospensione di astrociti in un pallone di coltura tissutale con tappo a vite T 75 e mantenere gli astrociti corticali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% circa 16 ore dopo il prelievo.Lavare il pallone con quattro millilitri di 37 gradi Celsius HBSS. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno completo e mantenere gli astrociti corticali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Quando la coltura raggiunge circa il 95% di confluenza, agitare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.Quindi rimuovere il terreno contenente le celle staccate e lavare la piastra con altri quattro millilitri di HBSS a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere quattro millilitri di terreno completo fresco e incubare nuovamente le cellule 24 ore dopo aver arricchito la coltura per gli astrociti corticali. Rinfresca la coltura con due millilitri di terreno completo.Quindi incubare le cellule con un millilitro di terreno completo contenente un microlitro di almeno un decimo del decimo pfu per millilitro dell'adenovirus di interesse a 32 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica a cinque. L'infezione da gfab CRE provoca un vantaggio proliferativo negli astrociti gfab ricombinati, aumentando la purezza degli astrociti dal 59% a oltre il 90% dopo cinque-nove passaggi in coltura. Dopo sei ore, rimuovere il terreno contenente il virus e incubare nuovamente la coltura in terreno fresco e completo.Dopo che gli astrociti corticali sono stati raccolti a circa il 90% di confluenza e il numero di cellule appropriato viene risospeso in metilcellulosa ghiacciata al 5%. Inserire una siringa di vetro da 250 microlitri in un erogatore di antigene ripetuto, quindi collegare un ago smussato calibro 18 alla siringa. Utilizzare l'ago calibro 18 per aspirare gli astrociti corticali nella siringa e rimuovere eventuali bolle d'aria.Quindi gettare l'ago calibro 18 e inserire un ago calibro 27 sulla siringa. Premere il pulsante sull'erogatore dell'antigene fino a quando il fluido non viene espulso dal nuovo ago per impiantare gli astrociti. Successivamente, fissare un animale ricevente immunocompetente di età compresa tra tre e sei mesi all'interno di una cornice stereotassica e praticare un'incisione sulla sutura sagittale lunga circa 0,5 centimetri tra le orecchie e gli occhi.Individuare l'intersezione delle suture coronali e sagittali o il BRE MA, nonché l'intersezione del lambdoide nelle suture sagittali o il Lambda. Dopo essersi assicurati che BMA e lambda si trovino sullo stesso piano orizzontale, collegare la siringa e il dispenser di antigene ripetuto al telaio stereotassico sopra la testa dell'animale e portare la punta dell'ago a contatto con il bgma. Solleva leggermente l'ago dalla superficie del cranio e spostati di due millimetri lateralmente e di un millimetro rostrale dal bgma.Quindi abbassare con cautela l'ago attraverso il cranio fino a destinazione. A quattro millimetri ventrali dalla MA breg e attivare il dispenser di antigene ripetuto. Una volta per iniettare cinque microlitri della sospensione cellulare.Lasciare l'ago in posizione per due minuti per consentire alla pressione intracranica di equilibrarsi, quindi ritirare l'ago lentamente per un periodo di 30 secondi utilizzando un batuffolo di cotone per applicare pressione su eventuali sanguinamenti che potrebbero verificarsi. Infine, usa l'adesivo per tessuti per approssimare i bordi della ferita e per chiudere l'incisione, quindi posiziona l'animale in una gabbia pulita e calda per riprendersi. Gli xenotrapianti di linee cellulari umane consolidate richiedono ospiti immunodeficienti e generalmente non ricapitolano l'istopatologia degli astrocitomi umani.Ad esempio, gli xenotrapianti ortotopici di U 87 MG formano tumori circoscritti che non invadono un cervello normale. Al contrario, l'iniezione di astrociti nulli T RRP nel cervello di topi singenici immunocompetenti produce tumori che ricapitolano le caratteristiche istologiche delle loro controparti umane, in particolare l'invasione del tessuto cerebrale normale. Per monitorare la crescita dell'allotrapianto TRP null, i topi sono stati sacrificati ogni cinque giorni dopo l'iniezione di cellule e il carico tumorale è stato determinato quantificando l'area tumorale sulle sezioni cerebrali colorate con h ed e.È stato determinato che l'area tumorale aumenta esponenzialmente nel tempo e l'iniezione ortotopica di una volta 10 al quinto degli astrociti TP nll nel cervello ricevente ha portato alla morbilità neurologica. Con una sopravvivenza mediana di 22 giorni. L'imaging longitudinale in vivo è stato utilizzato per definire la cinetica di crescita del tumore.Pertanto, in questo esperimento, gli astrociti TR penali e ingegnerizzati per esprimere la luciferasi sono stati iniettati nel cervello di singenici immunocompetenti. I compagni di cucciolata e la crescita del tumore sono stati determinati mediante imaging seriale a bioluminescenza. Un aumento di 15 volte della bioluminescenza è stato osservato per un periodo di 16 giorni.Seguendo questa procedura, i test sui farmaci possono essere eseguiti in vitro e in vivo per determinare l'efficacia e testare nuove combinazioni di farmaci. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere astrociti corticali da topi geneticamente modificati condizionali che non esprimono crea, come indurre la ricombinazione genetica in vitro e come modellare la tumorgenesi utilizzando allotrapianti ortotopici in topi immunocompetenti.

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Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Gli astrociti piastrellano uniformemente la corteccia cerebrale, rendendo difficile l'analisi della loro complessa morfologia a livello cellulare. Il protocollo qui fornito utilizza l'etichettatura multicolore basata sull'elettroporazione in utero per singolo astrociti corticali e analizzarne il volume e la morfologia con una pipeline di analisi delle immagini intuitiva.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Descriviamo un protocollo per riprogrammare i fibroblasti derivati dalla pelle umana in cellule progenitrici neuronali indotte (INPC) e la loro successiva differenziazione in Astrociti indotti (iA). Questo metodo porta a una generazione rapida e riproducibile di iNPC e iA in grandi quantità.

Modellazione in vitro per malattie neurologiche utilizzando la conversione diretta dai fibroblasti alle cellule progenitrici neuronali e la differenziazione in astrociti

Qui riportiamo un metodo di bioprinting 3D di astrociti corticali murini per biofabbricare tessuti neurali simili per studiare la funzionalità degli astrociti nel sistema nervoso centrale e i meccanismi che coinvolgono le cellule gliali nelle malattie e nei trattamenti neurologici.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati ​​da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Emicrania e la sua trasformazione da emicrania cronica sono oneri sanitari immenso bisogno di migliori possibilità di cura. Cerchiamo di definire le modalità di segnalazione neuronali immunitario modula la suscettibilità di emicrania,...

Modellistica neurale segnalazione immunitario di emicrania episodica e cronica utilizzo Depressione Diffusione In Vitro</em

Scopri come generare modelli di astrocitoma geneticamente ingegnerizzati da astrociti corticali e cellule staminali neurali di topi condizionali. Questo metodo consente la caratterizzazione fenotipica in vitro e in vivo per studiare le mutazioni associate all'astrocitoma.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati (Video) | JoVE Journal

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

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