Name: Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Impara la dissezione e l'immunostaining di dischi immaginali da Drosophila melanogaster per studiare l'espressione genica e proteica. Questo metodo consente di analizzare i processi di sviluppo con microscopia a fluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Donald Pronto e Kevin Mosè per l&#39;insegnamento JPK la procedura di dissezione disco immaginale originale. Ringraziamo anche Bonnie Weasner per il disco genitale in Figura 1B e il disco occhio in Figura 2A, Brandon Weasner per la figura 3, il Bloomington Drosophila Stock Center per le macchie Fly e la Developmental Studies Ibridoma Banca per gli anticorpi. CMS è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), il Frank W. Putnam Research Fellowship, e Robert Briggs Research Fellowship. JPK è supportata da una sovvenzione da parte del National Eye Institute (R01 EY014863)

1 Preparazione di larve <ol><li> Riempire una capsula di Petri 35 millimetri con tampone dissezione. </li><li> Porre larve in piastra di Petri e permettere loro di nuotare in giro per alcuni minuti (step-autopulente). </li><li> Trasferimento larve ad un pool di buffer di dissezione su un piatto dissezione a base di silicone. Questa piscina deve essere di un bordo della piastra. La piastra dissezione costituita da una soluzione di silicone che è stato versato e indurito in una piastra di Petri di vetro. </li><li> Usando una pipetta pasteur-, posizionare un grande pool di buffer di dissezione nel centro del piatto dissezione. </li><li> Utilizzando # 5 pinze, trasferire un singolo larva pulita dalla piccola piscina al più grande pool di buffer di dissezione. </li></ol> 2 Coarse Dissezione di larve <ol><li> Mentre la larva è ancora all&#39;interno della grande piscina di buffer di dissezione stringere la larva con le pinze. Un paio di pinze deve essere usato per afferrare i ganci bocca, mentre l&#39;altra coppia di pinze è utilizzato per contenere la animaltri ancora (afferrare la larva dolcemente terzo lunghezza del corpo). </li><li> Hold Steady la coppia di pinze contenenti la cuticola vicino i ganci bocca mentre rapidamente tirando il resto del corpo via con la seconda coppia di pinze. </li><li> Quando la larva comincia a lacerare vi sentirete un leggero rilascio di tensione. Rilasciare la larva dalle pinze e consentire il &quot;coraggio&quot; della larva di fuoriuscire. Questo permette per i dischi immaginali a rimanere nella loro conformazione normale e impedisce loro di deformarsi. </li><li> Con una coppia di pinze afferrare nuovamente i ganci bocca per tenere l&#39;estremità anteriore della larva in posizione. Usando l&#39;altra coppia di pinze rimuovere minore due terzi delle larve comprese le viscere interne. Nota: un complesso contenente i ganci bocca, i dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, gangliari ventrale, le ghiandole salivari, alcuni dischi gamba, e la cuticola sovrastante rimarranno. </li><li> Con un paio di pinze rimuovere delicatamente la cuticola sovrastante, ghiandole salivari, dischi gamba ealtri tessuti. Nota: solo tessuto che deve rimanere è i ganci bocca, dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, e ganglio ventrale (Figura 3). </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,5 con larve supplementare per 15-20 minuti. Nota: i dischi immaginali che rimangono nel buffer di dissezione per lunghi periodi di tempo tendono a degradare e infine appariranno come meno di esemplari ideali per essere fotografati. Così, dopo un massimo di 20 minuti tutti i tessuti sezionati devono essere trasferiti al fissativo PLP (vedi sotto). </li></ol> 3 Fissazione e colorazione di tessuti con anticorpi <ol><li> Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti sezionati per un vetro da orologio contenente freddo paraformaldeide-lisina-periodato (PLP) fissativo. Limite volume di tampone dissezione trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione di PLP. Assicuratevi di tagliare la punta con una lama di rasoio in modo che l&#39;apertura punta è grande abbastanza per ospitare i tessuti sezionati. Usando un paio di pinze oun ago di tungsteno assicura che i tessuti sezionati sono completamente immersi in ordine per il fissaggio adeguato a verificarsi. Incubare tessuti sezionati a freddo PLP fissativo per 45 min. Questo incubazione può avvenire a temperatura ambiente, senza agitazione. </li><li> Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti dissezionati di tampone di lavaggio (RT) utilizzando un altro punta gialla tagliata per 45 min. Il volume Limite di PLP trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione del tampone di lavaggio. Nota: tutti i tessuti sezionati devono essere completamente sommerse. </li><li> Trasferire 20-30 insiemi di tessuto sezionato a 1,5 ml provetta da microcentrifuga. Nota: se un numero maggiore di complessi dischi occhio-antenne vengono combinati all&#39;interno del tubo, vi è la possibilità che il tessuto nella parte inferiore del tubo non sarà esposto correttamente agli anticorpi. Per ottenere risultati ottimali, non più di 20-30 complessi disco occhio-antenne dovrebbero essere presenti all&#39;interno di un singolo tubo. Il tessuto sezionato si depositerà sul fondo della provetta per microcentrifuga. Pertanto, in successive fasi di uSE una Pipetman per rimuovere e sostituire il tampone di lavaggio, soluzione bloccante, e gli anticorpi. </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 ml di soluzione bloccante: il 10% di siero normale di capra in tampone di lavaggio. Incubare a RT con rotazione delicata su un rotatore tavolo per 10 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirlo con 100 ml di anticorpi primari che sono stati opportunamente diluito in siero normale di capra al 10%. Incubare a RT con rotazione dolce per 16 ore. </li><li> Rimuovere gli anticorpi primari e sostituirlo con 750 ml di tampone di lavaggio. Inserire provette su un nutator e lasciare nutate a temperatura ambiente per 10 min. Nota: L&#39;anticorpo primario può essere salvato (conservare a 4 ° C) e riutilizzato in seguito. Riutilizzo anticorpi più volte può aiutare a ridurre legame non specifico. </li><li> Consenti teste di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 ml di anticorpi secondari che sono stati opportunamente diluiti in siero normale del 10%. Incubare a RT con rotazione delicato per 2̵1; 4 ore. </li><li> Rimuovere soluzioni anticorpo secondario da tessuto e sostituirlo con 500 ml di tampone di lavaggio. Lasciare tessuto di depositarsi sul fondo della provetta. </li><li> Uso di un P-200 e una punta di giallo taglio, trasferire tutti i tessuti sezionati a un pool di tampone di lavaggio che è stato messo sul piatto dissezione. Mentre procedere con la fase successiva di dissezione bene, il tessuto sarà incubare al tampone di lavaggio. Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso. </li></ol> 4. fine dissezione di Eye-antenne Disc Complessi e Montaggio su diapositive <ol><li> Utilizzare un paio di pinze per stringere la cuticola dai ganci bocca con il lato ventrale del complesso rivolta verso il basso. Con una seconda coppia di pinze togliere le due lobi cerebrali chiudendo la seconda pinza nello spazio tra i dischi del cervello e degli occhi (Figura 3, freccia rossa) e rapidamente tirando il cervello lontano dai ganci bocca. </li><li> Continuando a tenere su i ganci bocca, un pizzico fuoriil tessuto più vicino possibile al collegamento tra la sezione antenne del disco oculare antenne ed i ganci bocca (Figura 3, blu freccia). Nota: i complessi del disco occhio-antenne dovrebbero essere liberi di tutti i tessuti (Figura 1A). Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato desiderato che può essere posizionato su vetrini è stato sezionato. Questo protocollo può essere adattato per isolare ala, haltere, gamba e dischi immaginali genitali (Figura 1B-E). </li><li> Aggiungere due piccoli pezzi di carta velina (dimensione del coprioggetto) circa 3. Parte sul piatto dissezione. Posizionare un vetrino sul piatto - i due pezzi di carta velina dovrebbero essere sotto le estremità del vetrino. Questo consentirà di evitare la diapositiva da attaccare alla base di silicone del piatto dissezione. </li><li> Uso di un P-20 con una punta tagliata, aggiungere 9 ml di un agente anti-sbiancante al centro del vetrino per microscopio. Questo impedisce sbiancamento del tessuto se visto con fluorescenteluce. </li><li> Utilizzando la stessa punta tagliata, raccogliere tutti i dischi degli occhi-antenne e aggiungerli alla goccia di reagente anti-imbianchimento. Ridurre al minimo la quantità di tampone di lavaggio che viene riportato. Cercare di limitare la quantità di tampone di lavaggio a 10 ml o meno. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per separare e diffondere i dischi occhio-antenne all&#39;interno della goccia di reagente anti-imbianchimento. Lasciare i dischi di incubare in reagente anti-imbianchimento per alcuni minuti. Nota: i dischi girare chiaramente come il tessuto assorbe il reagente anti-imbianchimento. </li><li> Utilizzando un pennello fine abbassare delicatamente un coprioggetto sul campione. Ciò impedisce la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Conservare scivola a -20 ° C fino al momento di visualizzare i dischi immaginali eye-antennali o altri che utilizzano la luce o la microscopia a fluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Anche se questa procedura è in gran parte concentrata sulla isolamento e successivo trattamento di dischi occhio-antenne, è suscettibile di essere utilizzato per isolare e analizzare l&#39;ala, haltere, gamba e dischi genitali (Figura 4). L&#39;unica modifica necessaria del protocollo per isolare questi dischi (in contrasto con il disco occhio-antenne) è il metodo della dissezione grossolana (sezione 2 del protocollo). La prima tappa (T1) coppia toracica si trova alla anteriore della larva e può essere ...

Per più di un secolo il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato un sistema di premier per studiare lo sviluppo, il comportamento e la fisiologia. Sviluppo in volo può essere diviso in due grandi fasi: embrionali e post-embrionali con gran parte quest&#39;ultimo che si svolgono all&#39;interno monostrato epiteli chiamati dischi immaginali 1-3. Disegni di dischi immaginali sono stati pubblicati nel 1864 da August Weismann, come parte della sua vasta monografia sullo sviluppo degli insetti 1. Questi dischi iniziano il loro sviluppo durante l&#39;embriogenesi, vengono modellato durante gli stadi larvali, sopravvivere alla massiccia histolysis delle fasi pupa primi, e, infine, dare origine ad una elevata percentuale di strutture per adulti che si trovano dentro l&#39;adulto volare 1-14. Durante lo sviluppo larvale ogni disco rende diverse decisioni critiche per quanto riguarda il destino, forma e dimensione. Entro i primi e secondi stadi larvali, i dischi hanno il compito di adozione di un destino primario, establishing confini vano, adottando la forma corretta e generando il numero richiesto di cellule 15-16. Durante il terzo stadio larvale e precoce fase di pre-pupa, i dischi immaginali continuano a dividersi e sono modellati come le cellule adottano i loro destini morsetto 16. Durante la prima storia della Drosophila biologia dello sviluppo, dischi immaginali sono stati studiati quasi esclusivamente nel contesto dello sviluppo normale e nei casi limitati in cui una perdita o un mutante di guadagno-di-funzione era praticabile. L&#39;uso di raggi X per indurre ricombinazione mitotica permesso di mutazioni letali da analizzare in cloni di cellule all&#39;interno dei tessuti larvali e adulti. Questo metodo è stato migliorato con l&#39;introduzione di metodi transgenici per analizzare perdita e guadagno-di-funzione mutazioni in entrambi i tessuti larvali e adulti. Il numero di anticorpi, giornalisti trascrizionali e trappole di proteine ​​per descrivere il paesaggio molecolare di tipo selvatico e tessuti mutanti è anche constantly crescente. L&#39;utilizzo di questi marcatori molecolari per analizzare perdita e guadagno-di-funzione di cloni di cellule mutanti ha reso sempre più possibile per ottenere in tempo reale comprensione di come le cellule mutanti deviano dalle loro tipo cugini selvatici durante lo sviluppo. Per sfruttare adeguatamente questi strumenti e reagenti è fondamentale disporre di preparazioni di alta qualità di dischi immaginali che possono essere visualizzati, fotografati e analizzati. L&#39;obiettivo di questo manoscritto è fornire un protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento e la preparazione del complesso disco-occhio antenne (Figura 1A). Può anche essere utilizzato con successo per isolare un&#39;ampia varietà di dischi aggiuntivi compresi quelli che danno origine alle ali, bilancieri, gambe T1-T3 e genitali (Figura 1B-E). Questa procedura, con piccole modifiche, è stato utilizzato per isolare i dischi immaginali da Drosophila per quasi 80 anni. Come descritto in precedenza, poiché la maggior parte dei geni sono espressi durante il multiple fasi di sviluppo e in una moltitudine di tessuti, è spesso impossibile studiare gli effetti che hanno sulla mutanti nulli l&#39;intero occhio, come l&#39;animale muore ben prima della fase larvale al terzo stadio. Quattro metodi hanno reso possibile lo studio dei tessuti più sviluppate, come la retina significativamente più trattabile. Il primo è il metodo flippase (FLP) / flippase Ricombinazione Target (FRT) di generare cloni di cellule mutanti all&#39;interno di un tipo di tessuto altrimenti selvaggio 17-19. In questo caso il tessuto mutante è identificato dall&#39;assenza di un marcatore visivo come proteina fluorescente verde (GFP) e può essere confrontato con il tipo selvatico tessuto circostante in cui GFP è presente (Figura 2D). Il secondo è il metodo &quot;flp-out&quot;, in cui un transgene viene espresso in una popolazione di cellule 20. In questo caso i cloni cellulari sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvatico tessuto circostante che manca il reporter GFP (Figura2E). Il terzo è l&#39;analisi Mosaico con un marcatore cellulare reprimibile (MARCM) tecnica, che combina elementi del clone mutante FLP / FRT e sistemi di espressione FLP-out 21. Con questo metodo un transgene può essere espressa all&#39;interno di una popolazione di cellule che sono simultaneamente mutante per un locus genetico individuale. Come cloni FLP-out, cloni marcm sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvaggio circostante tessuto che manca il marcatore GFP (Figura 2F). E, infine, i geni ei costrutti RNAi possono essere espressi nei tessuti immaginari sotto il controllo di specifici costrutti promotore-GAL4. Questi quattro metodi hanno aumentato l&#39;interesse per lo studio dei dischi immaginali dal cloni o modelli mutanti o over-espressione può essere direttamente confrontati con il tessuto adiacente wild type. Il metodo descritto in questa procedura è stata sviluppata in modo che i ricercatori che studiano lo sviluppo post-embrionale dei tessuti adulti in Drosophila,particolare di quelli derivati ​​dal disco occhio-antenne, sarà in grado di ottenere tessuti di alta qualità per l&#39;analisi. Anche se i singoli ricercatori hanno fatto lievi modifiche, il nucleo di questa procedura (che descriviamo qui) è rimasto sostanzialmente inalterato. Dal momento che l&#39;ottenimento di tessuti di alta qualità è fondamentale per lo studio dei dischi immaginali Ci auguriamo che questo protocollo scritto e video che accompagna serviranno come risorsa didattica preziosa.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomero Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Utilizzato per creare la base per la piastra di dissezione</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Utilizzare il coperchio per la piastra di dissezione</td></tr> <tr><td>#5 Pinze da dissezione</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Le pinze devono essere mantenute molto affilate</td></tr><tr><td>9 pozzetti di vetro per orologi</td><td>Vairous Fornitori</td><td></td><td>Utilizzato per la fissazione di complessi di dischi immaginali</td></tr><tr><td>Fiaschetta di Erlenmeyer da 50 ml</td><td>Vari fornitori Piccola</td><td></td><td></td></tr><tr><td>barra di agitazione</td><td>Vari fornitori Abbastanza</td><td></td><td>piccolo da poter essere inserito nel pallone di Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Vari fornitori Provette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per microfuga da 1,5 ml</td><td>Vari fornitori Trasparente</td><td></td><td>o scuro a seconda dell'applicazione</td></tr><tr><td>Rack</td> <td>per microfugaVari fornitori Rotatore</td><td></td><td></td></tr> da <tr><td>banco</td><td>Vari fornitori</td><td></td><td>100 &#956; il volume non deve schizzare a bassa impostazione</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Serve come fissativo</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Utilizzato per fare tamponi di dissezione e lavaggio</td></tr><tr><td>Sodio Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Usato per fare tamponi di dissezione e lavaggio</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Utilizzato nella soluzione fissativa</td></tr><tr><td>Periodo di sodio</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Utilizzato nella soluzione fissativa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Utilizzato per perforare i dischi immaginali</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Utilizzato per sciogliere la paraformaldeide</td></tr><tr><td>100% Siero di capra normale</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Serve come soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td>Vari fornitori Diluire</td><td></td><td>in siero di capra al 10% come indicato dal produttore</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari</td><td>Vari fornitori Diluire</td><td></td><td>in siero di capra al 10% come indicato dal produttore</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td><td>Vectashield</td><td>H-1000</td><td>Previene lo sbiancamento dei campioni</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura in vetro 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Vari fornitori</td><td></td><td>Impedisce ai vetrini di aderire alla base in silicone</td></tr><tr><td>Pennello Panit 000</td><td>Vari fornitori Utilizzare</td><td></td><td>per abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti sui campioni</td></tr></tbody></table>

dissezione e immunostaining di immaginale dischi da drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Una parte significativa di sviluppo post-embrionale nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, si svolge all&#39;interno di un insieme di strutture sac-come chiamate dischi immaginali. Questi dischi danno luogo ad una elevata percentuale di strutture adulti che si trovano all&#39;interno della mosca adulta. Qui si descrive un protocollo che è stato ottimizzato per recuperare questi dischi e li prepara per l&#39;analisi con anticorpi, i giornalisti trascrizionali e trappole di proteine. Questa procedura è più adatto per tessuti sottili come dischi imaginali, ma può essere facilmente modificato per l&#39;utilizzo con i tessuti più spessi come il cervello adulto e dell&#39;ovaio larvale. Il protocollo scritto e video che accompagna guideranno il lettore / spettatore attraverso la dissezione di terza larve instar, la fissazione dei tessuti, e il trattamento di dischi immaginali con anticorpi. Il protocollo può essere utilizzato per analizzare i dischi immaginali dal più giovane primo e secondo instar larve pure. Il vantaggio di questo protocollo è che è relativamente breve e deve essereen ottimizzato per la conservazione di alta qualità del tessuto sezionato. Un altro vantaggio è che la procedura di fissazione che è impiegato funziona bene con il numero enorme di anticorpi che riconoscono le proteine ​​di Drosophila. Nella nostra esperienza, vi è un numero molto piccolo di anticorpi sensibili che non funzionano bene con questa procedura. In queste situazioni, il rimedio sembra essere quello di utilizzare una fissazione cocktail alternativo, pur continuando a seguire le linee guida che ci siamo stabiliti per le fasi di dissezione ed incubazioni anticorpi.

Il metodo descritto in precedenza in modo affidabile produce materiale di alta qualità per l'analisi con sonde in situ, giornalisti trascrizionali, trappole di proteine ​​e anticorpi. In figura 1 mostriamo dischi eye-antenna, genitali, ala, haltere e gambe che vengono regolarmente recuperati con questo metodo. Questi dischi sono stati trattati con un fluoroforo falloidina coniugato, che si lega alla F-actina e quindi delinea ogni cella. Se il tessuto è stato fissato correttamente allora il solc...

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare i dischi immaginali dalle larve di drosophila Per l'immunoistochimica, ciò si ottiene rimuovendo prima il complesso della testa costituito da bocca, uncini, occhio e dischi tenali e cervello dalle larve. Il secondo passo consiste nel fissare il complesso della testa e incubarlo con anticorpi primari e secondari. Successivamente, l'occhio e i dischi tenali vengono separati dal complesso della testa.Il passaggio finale consiste nel montare i dischi immaginali in agente anti sbiancante su un vetrino. In definitiva, i reporter fluorescenti o LAC Z e la colorazione degli anticorpi possono rivelare l'espressione spaziale e temporale di geni e proteine all'interno dei tessuti immaginali utilizzando la microscopia a fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per fornire informazioni sulla localizzazione di geni e proteine nel disco enten-immaginale.Può anche essere applicato ad altri tessuti immaginali, come la gamba dell'ala, e fermarsi. Qui. Per iniziare l'esperimento, riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con un tampone di dissezione. Metti da 10 a 20 larve nella capsula di Petri e lasciale nuotare per cinque minuti.Per autopulirsi con un parassita, la pipetta crea una grande piscina di tampone di dissezione al centro di una piastra di dissezione a base di silicone. Posiziona tre piscine più piccole che circondano la piscina grande e usa una pinza per trasferire le larve nella piscina inferiore. Successivamente, utilizzando la pinza numero cinque, trasferire una singola larva pulita dal piccolo pool al pool più grande di tampone di dissezione.Per iniziare la dissezione grossolana, usa un paio di pinze per afferrare i ganci della bocca e l'altro paio di pinze per afferrare delicatamente le larve. A un terzo della lunghezza del suo corpo tiene fermo il gancio della bocca. Allontana rapidamente il resto del corpo con un secondo paio di pinze.Rilasciare la larva dalla pinza e lasciare che le viscere fuoriescano, consentendo ai dischi immaginali di rimanere nella loro normale conferma. Quindi afferra i ganci per la bocca e usa l'altro paio di pinze per rimuovere i due terzi inferiori delle larve, comprese le viscere interne. Quindi, rimuovi delicatamente le ghiandole salivari, i dischi delle gambe e altri tessuti.Gli unici tessuti che dovrebbero rimanere sono una piccola quantità di cuticola sovrastante. Gli uncini della bocca, i dischi oculari e tenali, gli emisferi cerebrali e il ganglio ventrale. Dopo un massimo di 20 minuti, trasferire tutti i tessuti sezionati nell'aldeide paraforma lisina paria.Fissativo della data o PLP. Non lasciare che i dischi immaginali rimangano nel tampone di dissezione per più di 20 minuti, altrimenti si degraderanno dopo la dissezione. Trasferire i tessuti sezionati con incrementi di 100 microlitri su un vetro dell'orologio contenente PLP freddo.Utilizzare un paio di pinze per assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare i tessuti sezionati in un fissativo PLP freddo per 45 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Successivamente, trasferire 100 microlitri di tessuti sezionati dal PLP al tampone di lavaggio.Assicurarsi che i tessuti siano completamente immersi e incubarli a temperatura ambiente senza agitare per 45 minuti. Quindi trasferire i tessuti sezionati in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri. Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 microlitri di soluzione bloccante.Incubare i tessuti a temperatura ambiente con una leggera rotazione su un rotatore da tavolo per 10 minuti. Dopo il blocco, rimuovere la soluzione e sostituirla con 100 microlitri di soluzione di anticorpi primari in siero di capra 10%Normal . Incubare i tessuti a temperatura ambiente con una rotazione delicata per 16 ore a seconda della forza dell'anticorpo.Quindi, rimuovere l'anticorpo primario e sostituirlo con 750 microlitri di tampone di lavaggio. Posizionare la provetta su un mutatore a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il tubo dal mutatore e lasciare che le testine si depositino sul fondo del tubo.Quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di soluzione di anticorpi secondari nel siero 10%Normal. Incubare la provetta a temperatura ambiente con una leggera rotazione per almeno due ore a seconda della forza dell'anticorpo. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpi secondari dal tessuto.Sostituirlo con 500 microlitri di tampone di lavaggio e lasciare che il fazzoletto si depositi sul fondo del tubo. Posizionare tre pozze di tampone di lavaggio su una piastra di dissezione in silicone. Trasferire tutti i tessuti sezionati nella grande vasca di tampone di lavaggio che è stata posizionata sulla piastra di dissezione.Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso per iniziare la dissezione fine, posizionare il complesso della testa con il lato ventrale rivolto verso il basso e afferrare la cuticola per i ganci della bocca. Posiziona un secondo paio di pinze nello spazio tra il cervello e i dischi oculari e allontana rapidamente il cervello dai ganci della bocca per rimuovere i due lobi cerebrali continuando a tenere i ganci della bocca. Pizzica il tessuto il più vicino possibile al collegamento tra la sezione dell'antenna del disco dell'antenna oculare e il gancio per la bocca.Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato è stato sezionato. Quindi, aggiungi due piccoli pezzi di carta velina delle dimensioni di vetrini coprioggetto a tre pollici di distanza sul piatto di dissezione. Posizionare un vetrino di vetro su questi pezzi di carta per evitare che il vetrino si attacchi alla base in silicone del piatto di dissezione.Utilizzando una pipetta P 20, aggiungere nove microlitri di agente anti-sbiancamento al centro del vetrino del microscopio per evitare lo sbiancamento fluorescente del tessuto con la stessa punta non tagliata, raccogliere tutti i dischi I e tenali e aggiungerli alla goccia di reagente anti-sbiancamento. Quindi, usa una pinza per separare e allargare l'occhio e i dischi tenali all'interno della goccia di reagente antisbiancante fino a quando i dischi immaginali non si toccano. Utilizzando un pennello fine, abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla goccia di agente antisbiancante per evitare la formazione di bolle d'aria.Infine, conservare i vetrini a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al momento di visualizzare e visualizzare i dischi tenali ionici utilizzando la microscopia a luce o a fluorescenza. Questo metodo produce in modo affidabile materiale di alta qualità per l'analisi, come trasmesso da queste immagini confocali di dischi immaginali. I dischi sono stati trattati con un foide e un fluoro quattro coniugato, che si lega alla f actina e quindi delinea ogni cellula.Una delle caratteristiche più sorprendenti del disco entale è il solco morfogenetico, che può essere visto come una rientranza all'interno del tessuto che corre lungo l'asse ventrale dorsale. Man mano che il solco avanza attraverso il campo oculare, il mare di cellule disordinate si trasforma in una schiera ordinata di occhi unitari periodicamente distanziati o Oma Tedia. La verifica dell'espressione clonale e l'analisi del disco immaginale sono possibili applicazioni a valle di questo metodo.I tre pannelli superiori mostrano dischi che sono stati colorati con diversi anticorpi come ilis, DPP A, reporter trascrizionale LAC Z e marcatori specifici delle cellule come la visione embrionale, letale, anormale o vy, che codifica una proteina legante l'RNA panneuronale. I tre pannelli inferiori mostrano i dischi in cui la GFP viene utilizzata per marcare le popolazioni di cellule. Una volta padroneggiato il corso, l'isolamento dei complessi della testa da 10 a 20 larve richiederà circa 10 minuti e, inoltre, l'isolamento fine del disco tenale ionico da questi complessi richiederà circa 10 minuti.

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo dimostra la tecnica di dissezione utilizzati per isolare i dischi immaginale da larve di drosofila nella fase 3 stadio. Metodi per il fissaggio del tessuto dopo aver detto e rimuovere l'ala, gambe, occhi e dischi sono dimostrate direttamente su un vetrino da microscopio per la successiva visualizzazione.

Dissezione di dischi immaginale da larve 3 Instar Drosophila

Descriviamo un romanzo rosso proteina fluorescente (RFP), giornalista che si esprime in particolare...

Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila</em

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

Quando si colorano i dischi immaginali di Drosophila, spesso viene eseguita una dissezione grossolana in cui i dischi sono esposti ma rimangono attaccati al corpo. Una volta colorati, i dischi di interesse vengono isolati e montati. Il protocollo di esempio dimostra una procedura per la dissezione e il montaggio del disco immaginale dell'ala.

drosofila Dissezione del disco immaginale larvale: un metodo per osservare lo sviluppo degli epiteli

L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire ai ricercatori di eseguire la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di dischi oculari pupali da Drosophila melanogaster di qualsiasi età.

Dissezione e Montaggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; pupa Dischi Eye

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Descriviamo un protocollo per misurare i contatti tra cellule in strati epiteliali adiacenti in dischi immaginali ali vivi di Drosophila utilizzando un approccio basato sulla ricostituzione GFP.

Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive

Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

Impara la dissezione e l'immunostaining di dischi immaginali da Drosophila melanogaster per studiare l'espressione genica e proteica. Questo metodo consente di analizzare i processi di sviluppo con microscopia a fluorescenza.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

Esplora altri video