Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare i dischi immaginali dalle larve di drosophila Per l'immunoistochimica, ciò si ottiene rimuovendo prima il complesso della testa costituito da bocca, uncini, occhio e dischi tenali e cervello dalle larve. Il secondo passo consiste nel fissare il complesso della testa e incubarlo con anticorpi primari e secondari. Successivamente, l'occhio e i dischi tenali vengono separati dal complesso della testa.

Il passaggio finale consiste nel montare i dischi immaginali in agente anti sbiancante su un vetrino. In definitiva, i reporter fluorescenti o LAC Z e la colorazione degli anticorpi possono rivelare l'espressione spaziale e temporale di geni e proteine all'interno dei tessuti immaginali utilizzando la microscopia a fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per fornire informazioni sulla localizzazione di geni e proteine nel disco enten-immaginale.

Può anche essere applicato ad altri tessuti immaginali, come la gamba dell'ala, e fermarsi. Qui. Per iniziare l'esperimento, riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con un tampone di dissezione. Metti da 10 a 20 larve nella capsula di Petri e lasciale nuotare per cinque minuti.

Per autopulirsi con un parassita, la pipetta crea una grande piscina di tampone di dissezione al centro di una piastra di dissezione a base di silicone. Posiziona tre piscine più piccole che circondano la piscina grande e usa una pinza per trasferire le larve nella piscina inferiore. Successivamente, utilizzando la pinza numero cinque, trasferire una singola larva pulita dal piccolo pool al pool più grande di tampone di dissezione.

Per iniziare la dissezione grossolana, usa un paio di pinze per afferrare i ganci della bocca e l'altro paio di pinze per afferrare delicatamente le larve. A un terzo della lunghezza del suo corpo tiene fermo il gancio della bocca. Allontana rapidamente il resto del corpo con un secondo paio di pinze.

Rilasciare la larva dalla pinza e lasciare che le viscere fuoriescano, consentendo ai dischi immaginali di rimanere nella loro normale conferma. Quindi afferra i ganci per la bocca e usa l'altro paio di pinze per rimuovere i due terzi inferiori delle larve, comprese le viscere interne. Quindi, rimuovi delicatamente le ghiandole salivari, i dischi delle gambe e altri tessuti.

Gli unici tessuti che dovrebbero rimanere sono una piccola quantità di cuticola sovrastante. Gli uncini della bocca, i dischi oculari e tenali, gli emisferi cerebrali e il ganglio ventrale. Dopo un massimo di 20 minuti, trasferire tutti i tessuti sezionati nell'aldeide paraforma lisina paria.

Fissativo della data o PLP. Non lasciare che i dischi immaginali rimangano nel tampone di dissezione per più di 20 minuti, altrimenti si degraderanno dopo la dissezione. Trasferire i tessuti sezionati con incrementi di 100 microlitri su un vetro dell'orologio contenente PLP freddo.

Utilizzare un paio di pinze per assicurarsi che i tessuti sezionati siano completamente sommersi. Incubare i tessuti sezionati in un fissativo PLP freddo per 45 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Successivamente, trasferire 100 microlitri di tessuti sezionati dal PLP al tampone di lavaggio.

Assicurarsi che i tessuti siano completamente immersi e incubarli a temperatura ambiente senza agitare per 45 minuti. Quindi trasferire i tessuti sezionati in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri. Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 microlitri di soluzione bloccante.

Incubare i tessuti a temperatura ambiente con una leggera rotazione su un rotatore da tavolo per 10 minuti. Dopo il blocco, rimuovere la soluzione e sostituirla con 100 microlitri di soluzione di anticorpi primari in siero di capra 10%Normal . Incubare i tessuti a temperatura ambiente con una rotazione delicata per 16 ore a seconda della forza dell'anticorpo.

Quindi, rimuovere l'anticorpo primario e sostituirlo con 750 microlitri di tampone di lavaggio. Posizionare la provetta su un mutatore a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il tubo dal mutatore e lasciare che le testine si depositino sul fondo del tubo.

Quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di soluzione di anticorpi secondari nel siero 10%Normal. Incubare la provetta a temperatura ambiente con una leggera rotazione per almeno due ore a seconda della forza dell'anticorpo. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpi secondari dal tessuto.

Sostituirlo con 500 microlitri di tampone di lavaggio e lasciare che il fazzoletto si depositi sul fondo del tubo. Posizionare tre pozze di tampone di lavaggio su una piastra di dissezione in silicone. Trasferire tutti i tessuti sezionati nella grande vasca di tampone di lavaggio che è stata posizionata sulla piastra di dissezione.

Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso per iniziare la dissezione fine, posizionare il complesso della testa con il lato ventrale rivolto verso il basso e afferrare la cuticola per i ganci della bocca. Posiziona un secondo paio di pinze nello spazio tra il cervello e i dischi oculari e allontana rapidamente il cervello dai ganci della bocca per rimuovere i due lobi cerebrali continuando a tenere i ganci della bocca. Pizzica il tessuto il più vicino possibile al collegamento tra la sezione dell'antenna del disco dell'antenna oculare e il gancio per la bocca.

Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato è stato sezionato. Quindi, aggiungi due piccoli pezzi di carta velina delle dimensioni di vetrini coprioggetto a tre pollici di distanza sul piatto di dissezione. Posizionare un vetrino di vetro su questi pezzi di carta per evitare che il vetrino si attacchi alla base in silicone del piatto di dissezione.

Utilizzando una pipetta P 20, aggiungere nove microlitri di agente anti-sbiancamento al centro del vetrino del microscopio per evitare lo sbiancamento fluorescente del tessuto con la stessa punta non tagliata, raccogliere tutti i dischi I e tenali e aggiungerli alla goccia di reagente anti-sbiancamento. Quindi, usa una pinza per separare e allargare l'occhio e i dischi tenali all'interno della goccia di reagente antisbiancante fino a quando i dischi immaginali non si toccano. Utilizzando un pennello fine, abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla goccia di agente antisbiancante per evitare la formazione di bolle d'aria.

Infine, conservare i vetrini a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al momento di visualizzare e visualizzare i dischi tenali ionici utilizzando la microscopia a luce o a fluorescenza. Questo metodo produce in modo affidabile materiale di alta qualità per l'analisi, come trasmesso da queste immagini confocali di dischi immaginali. I dischi sono stati trattati con un foide e un fluoro quattro coniugato, che si lega alla f actina e quindi delinea ogni cellula.

Una delle caratteristiche più sorprendenti del disco entale è il solco morfogenetico, che può essere visto come una rientranza all'interno del tessuto che corre lungo l'asse ventrale dorsale. Man mano che il solco avanza attraverso il campo oculare, il mare di cellule disordinate si trasforma in una schiera ordinata di occhi unitari periodicamente distanziati o Oma Tedia. La verifica dell'espressione clonale e l'analisi del disco immaginale sono possibili applicazioni a valle di questo metodo.

I tre pannelli superiori mostrano dischi che sono stati colorati con diversi anticorpi come ilis, DPP A, reporter trascrizionale LAC Z e marcatori specifici delle cellule come la visione embrionale, letale, anormale o vy, che codifica una proteina legante l'RNA panneuronale. I tre pannelli inferiori mostrano i dischi in cui la GFP viene utilizzata per marcare le popolazioni di cellule. Una volta padroneggiato il corso, l'isolamento dei complessi della testa da 10 a 20 larve richiederà circa 10 minuti e, inoltre, l'isolamento fine del disco tenale ionico da questi complessi richiederà circa 10 minuti.