Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive

Quindi la nostra ricerca si concentra sulla comprensione di come le cellule situate a distanza nei tessuti comunicano tra loro. Stiamo usando il disco immaginale dell'ala di Drosophila come sistema modello per cercare di capire come si formano le citidine, come funzionano e quale ruolo svolgono nel controllo locale della crescita dei tessuti. Gli studi suggeriscono che i fattori di crescita viaggiano spesso attraverso proiezioni cellulari specializzate come i filopodi di segnalazione a base di actina, chiamati citonimi, per essere consegnati alle cellule bersaglio.

I citonemi sono strutture molto sottili e fragili che vengono facilmente interrotte dal protocollo di fissazione. Per osservarli, è necessario utilizzare approcci di imaging dal vivo dedicati con proteina marcata in fluorescenza espressa. Ciò limita notevolmente lo strumento e gli approcci che possiamo utilizzare per indagarli.

Abbiamo identificato una proteina chinasi chiamata Slik che è coinvolta nella biogenesi del citonema. L'espressione di Slik in uno strato epidurale del disco immaginale dell'ala innesca la formazione di citonema che attraversa il lume del disco e stimola la proliferazione delle cellule nello strato epiteliale vicino. In futuro, vorremmo identificare la proteina che agisce a valle di Slik per promuovere la formazione del citonema, identificare il ligando che viene veicolato attraverso questo citonema per promuovere la perforazione e comprendere meglio l'importanza fisiologica di questo meccanismo nel controllo della crescita dei tessuti.

Per iniziare, taglia i singoli pozzetti dalla striscia di otto pozzetti usando le forbici e poi taglia ogni pozzetto a metà. Rimuovere il supporto protettivo da un lato di ciascuna metà e incollare i distanziatori sul vetrino del microscopio, distanziandoli leggermente per creare uno spazio centrale riparato per il posizionamento del disco. Raccogli le larve vaganti del terzo stadio dal tubo di allevamento dopo l'incrocio genetico e l'incubazione a 25 gradi Celsius.

Sotto un microscopio da dissezione, trasferire le larve in una goccia di terreno di imaging vivo su una piastra di Petri rivestita di silicone. Usando due pinze da dissezione, inizia la dissezione pizzicando le larve a circa 1/3 della lunghezza del corpo dalla parte anteriore con un paio di pinze per tenerle ferme. Con il secondo paio, pizzica il corpo appena dietro al primo punto e tira per separare la metà posteriore, isolando la sezione anteriore.

Capovolgere la metà anteriore afferrando entrambi i lati dell'estremità tagliata con una pinzetta e spingendo la testa attraverso usando un secondo paio, capovolgendolo. Questo espone strutture interne come i dischi immaginali, la trachea, le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino. Rimuovere le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino usando una pinza, facendo attenzione a non disturbare i tronchi tracheali laterali sovrastanti i dischi alari.

Utilizzando una pinza, trasferire le metà anteriori pulite con i dischi alari attaccati in una goccia di terreno di imaging dal vivo pulito con ganci posizionati tra i distanziatori del vetrino. Per isolare i dischi alari, sezionarli delicatamente dai rami tracheali sottili con una lama della pinza da dissezione o un filo di tungsteno sottile montato su un portaago da dissezione. Scartare la carcassa rimanente.

Orientare i dischi alari utilizzando una lama di una pinza da dissezione o un ago di tungsteno in modo che il lato della membrana peripodiale sia rivolto verso l'alto. Regolare il volume medio in modo che riempia leggermente il pozzetto al di sopra del livello del distanziatore. Rimuovere il supporto protettivo superiore dal distanziatore di imaging e abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti sul campione.

Premere il vetrino coprioggetti nei punti di contatto del distanziatore utilizzando l'estremità arrotondata della pinza per garantire una corretta adesione. Per proiettare le pile di immagini in ImageJ, selezionare Immagine, quindi Pile, quindi Z Project, quindi Z Project, e scegliere Intensità massima dal menu. Nelle immagini di proiezione alla massima intensità, identificare l'area della sacca alare in base al modello di piegatura del disco alare utilizzando il canale dei ganci e lo strumento di selezione dei poligoni.

Applicate la stessa selezione al canale GFP e selezionate Modifica seguito da Cancella esterno per eliminare il rumore al di fuori della regione selezionata. Utilizzare il canale hooks nelle immagini di proiezione alla massima intensità per identificare i punti artefatti nelle immagini GFP. Quindi, seleziona l'area utilizzando lo strumento di selezione del poligono.

Fare clic su Modifica e scegliere Cancella. Nelle immagini di proiezione pulite con intensità massima, selezionare Analizza, seguito da Istogramma, e scegliere Elenco per ottenere tutti i valori dei pixel. Copia questo elenco in una tabella del foglio di calcolo.

Per impostare un valore di soglia, analizzare il segnale di fondo nei campioni di controllo negativi e confermare questo valore utilizzando altre immagini campione. Calcola la percentuale di superficie positiva GFP dividendo il numero di pixel al di sopra della soglia per il numero totale di pixel validi e moltiplicando il risultato per 100. Infine, normalizzare ogni valore calcolato dopo averlo diviso per la media della condizione di riferimento, che è impostata su uno.

Nei dischi wild-type privi di entrambe le componenti GFP divise, è stata osservata solo una minima autofluorescenza granulare della GFP vicino al centro della sacca alare e questo segnale di base è stato utilizzato per definire una soglia di fluorescenza. I dischi che esprimono solo la GFP1-10 divisa da CD4 nello strato del disco vero e proprio hanno mostrato livelli di fluorescenza indistinguibili da quelli wild-type, confermando la natura non fluorescente della sola GFP1-10. La co-espressione della scissione CD4 GFP1-10 nel disco vero e proprio e di CD4spGFP11 nella membrana peripodiale ha portato ad un notevole aumento di macchie GFP discrete e luminose localizzate nel lume del disco, con un'area positiva di fluorescenza significativamente più ampia sopra la soglia rispetto ai controlli.

L'espressione di Slik nel disco vero e proprio ha causato un forte aumento della densità dei nuclei della membrana peripodiale e un drammatico aumento dell'intensità del segnale GFP nella regione della tasca alare, suggerendo che i citonemi indotti da Slik stabiliscono un contatto potenziato con le cellule della membrana peripodiale.