Name: Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri un metodo di ricostituzione GFP per visualizzare i citonemi nei dischi alari di Drosophila vivi. Questa tecnica permette di studiare la comunicazione cellulare e la regolazione della crescita tessutale in tempo reale.

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Il driver nubbin-GAL4 viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP1-10 in modo specifico nella regione della tasca alare del DP (Figura 1A). Il driver PerM-LexA21 viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP11 in modo specifico nel PerM (Figura 1A). Questi due sistemi di espressione sono indipendenti l'uno dall'altro, consentendo l'espressione simultanea e specifica di diversi transgeni in DP e PerM (Figura 1B, C).
Lo schema genetico di base prevede l'incrocio di mosche per generare larve del genotipo nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Come controllo negativo, tralasciamo il transgene LexAop-CD4-spGFP11 . Altri transgeni (ad esempio, RNA a doppio filamento codificante proteine) possono essere espressi a piacere nello strato DP (sotto il controllo di sequenze UAS ) o nel PerM (sotto il controllo dell'operatore LexA).
Si tratta di un protocollo di imaging dal vivo che non può essere interrotto. La preparazione del materiale è stimata in ~10 min. Le dissezioni non devono essere eseguite per più di 20 minuti alla volta prima dell'imaging. L'imaging dura ~30 minuti e non dovrebbe durare più di ~1 ora. Per più condizioni o un numero elevato di campioni, la procedura deve essere eseguita in più cicli per garantire i migliori risultati.
1. Preparazione del materiale
<ol>
	<li>Prima della dissezione, pinzetta pulita, una piastra di depressione in vetro a 9 pozzetti (o altro contenitore adatto per la raccolta e la pulizia delle larve) e una piastra di Petri riutilizzabile rivestita in Sylgard (silicone) utilizzata per la dissezione con etanolo al 70%.</li>
	<li>Preparare i vetrini da microscopio eseguendo un lavaggio con etanolo al 70% e quindi attaccando un distanziatore di imaging al vetrino essiccato. Tagliare i singoli pozzetti dalla striscia a 8 pozzetti con le forbici e tagliarli a metà (Figura 2A). Rimuovere il supporto protettivo da un lato di ciascuna metà e attaccare i distanziatori alla slitta, leggermente distanziati per creare uno spazio riparato al centro dove verranno posizionati i dischi (Figura 2B). NOTA: In base alla nostra esperienza, questo semplifica il montaggio del campione poiché il volume preciso del fluido trasferito al vetrino è meno critico. Qualsiasi piccolo volume in eccesso fluirà semplicemente attraverso la fessura durante il vetrino. Poiché immaginiamo solo per un tempo relativamente breve (generalmente ~1 h), non abbiamo riscontrato alcun problema con l'essiccazione media.</li>
	<li>Scongelare il terreno di imaging dal vivo ( Drosophila Medium di Schneider non integrato conservato in aliquote congelate da 10 mL) e tenerlo facilmente accessibile in un secchiello del ghiaccio.</li>
	<li>In una provetta da microcentrifuga da 2 mL, miscelare 1,5 mL di terreno con 20 μL di 200 μg/mL Hoechst 33342 (concentrazione finale 2,7 μg/mL). Mantieni il tubo sul ghiaccio. NOTA: Questa forma specifica di colorante Hoechst viene utilizzata perché è altamente permeabile alla membrana. ATTENZIONE: I guanti devono essere utilizzati quando si maneggia Hoechst 33342. Gli strumenti devono essere lavati dopo l'uso.</li>
</ol>
2. Dissezione del disco alare e preparazione del vetrino
<ol>
	<li>Dopo l'incrocio genetico e l'allevamento a 25°C, prelevare le larve vaganti del terzo stadio dal tubo e lavarle in un terreno di imaging vivo freddo in una piastra di depressione in vetro a 9 pozzetti. NOTA: I citonemi sono molto fragili. Nelle fasi seguenti, è necessario prestare attenzione a manipolare i tessuti attorno ai dischi, cercando di evitare il contatto diretto tra i dischi e gli strumenti di dissezione. Prepariamo tre o quattro larve alla volta, poiché il danneggiamento di alcuni dischi è inevitabile e questo può diventare evidente solo durante le fasi di imaging.</li>
	<li>Sotto il microscopio da dissezione, trasferire le larve in una goccia di terreno di imaging vivo su una piastra di Petri rivestita di silicone e iniziare a dissezionare utilizzando due pinze da dissezione. Per fare ciò, prima tieni ferma la testa e la parte anteriore del corpo pizzicando le larve con un paio di pinze a circa un terzo della lunghezza del corpo (dalla parte anteriore). Usando il secondo paio di pinze, pizzica il corpo appena dietro la prima pinza. Quindi, tirare via la parte posteriore delle larve per isolare la "metà" anteriore.</li>
	<li>Capovolgi la metà anteriore fissandola con un paio di pinzette su entrambi i lati dell'estremità tagliata e spingendo la testa con l'altro paio (come capovolgere un calzino), per esporre le strutture interne, inclusi i dischi immaginali, la trachea, le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino.</li>
	<li>Rimuovere con cura le ghiandole salivari, il corpo adiposo e l'intestino, facendo attenzione a non disturbare i tronchi laterali della trachea, che dovrebbero sovrastare e proteggere i dischi alari.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per trasferire con cura le metà anteriori pulite con i dischi alari attaccati in una goccia di terreno di imaging dal vivo pulito con Hoechst, posizionato tra i distanziatori su un vetrino preparato (Figura 2C). Isolare i dischi alari dal resto dei tessuti sezionandoli delicatamente lontano dai rami sottili della trachea che si collegano al disco, utilizzando una lama della pinza da dissezione o un sottile filo di tungsteno attaccato a un portaaghi da dissezione. Scartare il resto della carcassa.</li>
	<li>Orientare i dischi utilizzando una lama della pinza da dissezione o un ago da dissezione a filo di tungsteno. A causa della loro forma appiattita a forma di goccia, i dischi alari cadranno con il DP o la PerM rivolti verso l'alto. Per questo protocollo, orientare tutti i dischi con il lato PerM rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Regolare il volume del mezzo per riempire completamente il pozzetto, leggermente al di sopra del livello del distanziatore di imaging, aggiungendo o rimuovendo il mezzo secondo necessità. Rimuovere il supporto protettivo dal lato superiore di ciascuna metà del distanziatore di imaging, quindi abbassare con cautela un vetrino coprioggetti sul campione. Premere delicatamente sul vetrino coprioggetti nel punto in cui entra in contatto con i distanziatori per immagini (ad esempio, con l'estremità arrotondata della pinza da dissezione) per assicurarsi che il vetrino coprioggetti aderisca al distanziatore. NOTA: Il livello medio deve essere leggermente superiore all'altezza del distanziatore per evitare di intrappolare bolle d'aria, ma non così alto da generare un flusso significativo quando il vetrino coprioggetti viene abbassato.</li>
</ol>
3. Imaging
<ol>
	<li>Imaging di campioni a temperatura ambiente utilizzando un microscopio confocale (laser a ioni argon con lunghezza d'onda di 488 nm per GFP, laser UV con lunghezza d'onda di 350 nm per Hoechst) dotato di lente a immersione in olio 40x/1,30 NA e software di microscopia. Acquisisci stack di immagini con incrementi di 1 μm che vanno da appena sopra il livello più alto della PerM (dove la fluorescenza di Hoechst diminuisce) al lato basale del DP, che generalmente equivale a più di 100 immagini per stack. Acquisisci pile di immagini ripetute per generare filmati timelapse. NOTA: Immaginiamo una diapositiva per non più di ~1-2 ore.</li>
	<li>Per le impostazioni del software del microscopio, acquisire immagini utilizzando la codifica a 8 bit, la media delle linee di 2, il guadagno del rivelatore generalmente compreso tra 650 e 750 e le tracce dei canali separate per ridurre il passaggio del segnale. Utilizzare le impostazioni identiche del laser e del rivelatore per tutte le condizioni, predeterminate eseguendo in anticipo i test su ciascuna condizione. NOTA: Con un ingrandimento di 40x, le nostre immagini hanno una risoluzione di 5,0386 pixel per μm (dimensione dei pixel: 0,1985 x 0,1985 μm2). Nella nostra configurazione, le impostazioni ottimali del microscopio confocale includevano la massima intensità laser possibile (senza danneggiare il tessuto) per catturare la maggior quantità di segnale possibile, producendo allo stesso tempo una saturazione minima o nulla; e il rumore più basso possibile valutato sui controlli negativi, ottenuto riducendo l'offset del rivelatore e la velocità di acquisizione (se necessario). Generalmente utilizziamo meno del 5% di potenza laser e la velocità massima della testina di scansione ("9" nelle impostazioni del software Zen). L'acquisizione di un singolo stack di immagini richiede in genere ~1 min 45 s e le immagini vengono acquisite ogni 2-3 minuti per le analisi timelapse.</li>
</ol>
4. Analisi delle immagini
<ol>
	<li>Proietta pile utilizzando la funzione di proiezione alla massima intensità del pacchetto software ImageJ (fare clic sull'immagine | Pile | Z progetto, selezionare Intensità massima nel menu).</li>
	<li>Nelle immagini MIP, determinare l'area della tasca alare in base al modello di piegatura del disco alare (utilizzando il canale Hoechst) utilizzando la selezione poligonale. Utilizzare la stessa selezione sul canale GFP con la funzione Clear Outside ( fare clic su Modifica | Cancella all'esterno) per impostare ogni valore di pixel esterno su 0.</li>
	<li>Nelle immagini MIP, utilizzare il canale Hoechst per pulire le immagini GFP, rimuovendo in particolare eventuali macchie artefatte che appaiono in entrambi i canali impostando il valore del pixel interessato su 0 (fare clic su Selezione poligono, quindi su Modifica | cancella).</li>
	<li>Nelle immagini MIP pulite, utilizzare la funzione Istogramma (fare clic su Analizza | Istogramma | Elenco) per ottenere e copiare l'elenco di tutti i valori dei pixel in una tabella di un foglio di calcolo.</li>
	<li>Impostare un valore di soglia basato sull'analisi del segnale di fondo nei controlli negativi (e poi verificato in altri campioni; vedi la discussione).</li>
	<li>Calcolate la percentuale di superficie positiva per la GFP utilizzando la seguente formula: %GFP-superficie positiva = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Normalizzare i dati alla fine dividendo ogni valore per la media della condizione di riferimento (che è impostata su 1). NOTA: Pixel valido = pixel con un valore ≥ 1, ignorando di fatto qualsiasi pixel eliminato il cui valore è stato impostato su 0. I valori dei pixel pari a 0 non si verificano naturalmente.</li>
	<li>Per determinare dove si localizza il segnale GFP ricostituito nei dischi, utilizzare sezioni XZ di pile di immagini per osservare l'asse apicobasale dell'epitelio del disco. Esegui le sezioni nelle Figi senza interpolazione e aumenta l'altezza dell'immagine sull'asse Z utilizzando la funzione Scala con interpolazione bilineare per migliorare la visibilità.</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscopio di dissezione Discovery V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscopio di dissezione</td></tr><tr><td>Pinza Dumont #55, punte per la biologia</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11255-20</td><td>pinza da dissezione</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC</td><td>Panneton et al. 2015&nbsp;</td><td>ceppo di mosca per esprimere Slik</td></tr><tr><td>FIGI</td><td></td><td>Schindelin J. et al. (2012)&nbsp;</td><td>software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>H3570&nbsp;</td><td>colorazione nucleare per imaging dal vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>ceppo di mosca</td></tr><tr><td>Microscopio confocale LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscopio confocale</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (BDSC)</td><td>86108</td><td>ceppo di mosca</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph et al., 2025</td><td>ceppo di mosca</td></tr><tr><td>Piastra spot in vetro PYREX a 9 depressionisell</td><td>Corning Scienze della Vita</td><td>7220-85</td><td>per la raccolta e il lavaggio delle larve</td></tr><tr><td>Drosophila di Schneider Medium</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>21720024</td><td>Mezzo di imaging dal vivo</td></tr><tr><td>Distanziatori di imaging SecureSeal, 8 pozzetti, spessore 0,12 mm&nbsp;</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>distanziatore</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico SYLGARD 184</td><td>Sylgard</td><td>3097358-1004</td><td>per la realizzazione di piastre di dissezione</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>ceppo di mosca</td></tr><tr><td>Zen Nero</td><td>Zeiss</td><td></td><td>software di acquisizione</td></tr></tbody></table>

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A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

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Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Questo video mostra la colorazione in immunofluorescenza di un cervello di Drosophila transgenico per l'imaging di cellule gliali su singola cellula. Il cervello esprime proteine mirate alla membrana fuse con diverse combinazioni di epitopi antigenici sotto il controllo di un sistema ricombinasi gliale-specifico. I cervelli isolati e fissati vengono colorati con anticorpi primari specifici per gli epitopi antigenici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori. Questa etichettatura...

Colorazione in immunofluorescenza del cervello di Drosophila per l'imaging di cellule gliali a singola cellula

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l'interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.

Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging dal vivo della divisione asimmetrica delle cellule staminali germinali (GSC) nella nicchia ovarica di Drosophila. Utilizziamo una linea transgenica che esprime ubiquitariamente una fusione di proteina fluorescente verde (GFP) della proteina spettrosoma Par-1.

Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

Scopri un metodo di ricostituzione GFP per visualizzare i citonemi nei dischi alari di Drosophila vivi. Questa tecnica permette di studiare la comunicazione cellulare e la regolazione della crescita tessutale in tempo reale.

Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive (Video) | JoVE Journal

Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive

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