Murini trapianto di cornea: Un modello per studiare la forma più comune di trapianto di organi solidi

I topi sono stati utilizzati come modello per studiare molte forme di trapianto, incluso il trapianto di cornea. In questo rapporto descriviamo un modello murino sia per il trapianto di cornea acuto che per quello tardivo.

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di introdurre un modello per il rigetto acuto dell'allotrapianto corneale. Ciò si ottiene rimuovendo prima la cornea del donatore. I passaggi successivi della procedura consistono nel preparare il letto di innesto del ricevente e suturare la cornea del donatore in posizione.

Quindi viene testata l'integrità dell'innesto e, se non ci sono perdite, la palpebra viene suturata. Dopo una settimana, l'opacità dell'innesto corneale viene valutata per misurare il rigetto dell'allotrapianto. In definitiva, il modello può essere utilizzato, può testare una varietà di strategie terapeutiche per definire i fattori più importanti legati al rigetto dell'allotrapianto dei trapianti di organi solidi.

Il trapianto di cornea è il più comune negli Stati Uniti. Ci sono diversi modelli animali disponibili per questa procedura, ma i topi sono i più comunemente usati. Questo modello è stato utilizzato per definire i fattori, che coinvolgono sia il rigetto che l'accettazione del trapianto di cornea.

Dopo aver anestetizzato i topi donatori e riceventi e aver confermato i loro stati anestetizzati con un pizzico di dita, applicare unguento lubrificante puro sugli occhi non sottoposti a intervento chirurgico. Quindi fissare la testa con l'occhio del donatore orizzontalmente a un supporto robusto e mobile utilizzando una striscia di nastro adesivo sul collo. Ora utilizzando un dente di due millimetri di diametro la cui punta è stata tinta con blu metile, delineare il sito centrale dell'innesto della cornea.

Quindi, con una lama di coltello oftalmica di 15 gradi, penetrare la cornea per evitare danni alla lente sottostante. Iniettare la soluzione viscoelastica nella camera anteriore in modo che la camera diventi più profonda. Ora asportare l'innesto del donatore con le forbici di Venezia e trasferire l'innesto in una capsula di HBSS con ghiaccio fino all'uso per ottenere madre, somministrare un paio di gocce di aide all'1% di tpic e al 2,5% di efrin cloridrato all'occhio ricevente.

Quindi, utilizzando un dente da 1,5 millimetri, delineare il sito dell'innesto come descritto in precedenza, utilizzando una lama di coltello oftalmica di 15 gradi, penetrare nella cornea e iniettare una soluzione viscoelastica nella camera anteriore per approfondirla. Al fine di mantenere lo spazio tra la cornea del donatore e il cristallino, questo riduce la possibilità di danni al cristallino sottostante e all'endotelio del donatore. Con le forbici Venice, rimuovere il bottone corneale centrale delineato dal ricevente e gettarlo.

Aggiungere un mezzo viscoelastico all'area lasciata libera dalla rimozione del bottone corneale per proteggere le cellule endoteliali corneali dai danni causati dal contatto diretto con la lente. Ora posiziona la cornea del donatore sul letto dell'innesto utilizzando una micro pinza a punta super fine. Posizionare il primo morso di sutura in nylon 11.0 sul lato donatore attraverso la cornea del donatore a circa il 90% dello spessore completo.

Quindi sul lato ricevente alla stessa profondità, quindi legare. Continuare a fissare la cornea trapiantata utilizzando suture interrotte a metà cardinale. Sono sufficienti da otto a 10 suture.

Ora riformare e lavare la camera anteriore con un'iniezione di soluzione fisiologica. In alternativa, iniettare aria nella camera anteriore per riformarla. Dopo l'iniezione, testare delicatamente l'integrità dell'innesto utilizzando una spugna di cellulosa.

Infine, valuta l'occhio. Determina se la pupilla è rotonda e se la camera anteriore appare normale. Se l'innesto sembra buono, applicare un unguento antibiotico e, facoltativamente, chiudere la palpebra con la sutura di seta in esecuzione 7.0 dopo l'intervento.

Monitora il topo fino a quando non è completamente sveglio e poi continua a osservarlo nella sua gabbia domestica per due giorni. Rimuovere i punti di sutura dal topo anestetizzato tra i quattro e i sette giorni successivi all'operazione. Dopo aver rimosso i punti di sutura, osservare il topo per diversi giorni.

Utilizzando una scala di opacità, valuta ogni cornea con un punteggio da zero a cinque. Uno zero indica l'assenza di opacità. Un punteggio di uno corrisponde a un'opacità superficiale minima.

Un punteggio di due indica un'opacità da lieve a più profonda con una pupilla sottostante distinguibile. E l'iride è un segno di un punteggio di tre alle cornee con opacità stromale in cui l'iride non può essere vista in dettaglio ad eccezione dei margini della pupilla. Se c'è una densa opacità stromale e non si vedono strutture sottostanti, dare all'innesto un punteggio di quattro.

Se, se c'è un'opacità completa con edema stromale intenso e sia la pupilla che l'iride sono completamente oscurate, allora assegna all'innesto un punteggio di cinque. Il protocollo del testo suggerisce anche una scala da zero a otto sull'infiltrazione dei vasi sanguigni. È possibile eseguire un'ampia varietà di manipolazioni utilizzando il modello dell'innesto.

Ad esempio, le cellule della milza possono essere aggiunte alla camera anteriore dal topo donatore. Dopo che il donatore è stato soppresso, rimuovere la milza e trasferirla in un colino cellulare utilizzando uno stantuffo a siringa da tre millilitri, distruggere la milza, quindi lavare le cellule della milza in 10 millilitri di HBSS, risospendere le cellule lavate in 10 millilitri di HBSS e contare le cellule con un emocitometro. Conservare le celle a temperatura ambiente fino a quando non verranno utilizzate in seguito.

Prima di eseguire il trapianto di cornea, iniettare le cellule nella camera anteriore dell'occhio controlaterale utilizzando un microscopio da dissezione, iniettare 1 milione di cellule della milza in cinque microlitri di HBSS da un ago calibro 33. Il modello è stato utilizzato per verificare se la tolleranza sistemica delle cellule T dell'antigene allo agli antigeni espressi dall'allotrapianto corneale del donatore potesse migliorare la sopravvivenza del trapianto. I topi BC sono stati tollerati agli antigeni C 57 neri 10 allallo mediante iniezione di cellule B 10 della milza nella camera anteriore.

Ciò non ha migliorato l'accettazione dell'allotrapianto corneale. Gli studi dimostrano che stabilire la tolleranza antigene-specifica all'antigene, misurata dalle risposte DTH, non influisce sull'esito degli allotrapianti cutanei o corneali. Uno studio simile ha dimostrato che quando la tolleranza al DTH è stata stabilita nei topi BAB c verso gli antigeni B 10, il trapianto cutaneo risparmiando alcuni o tutti gli antigeni B 10 non ha aumentato la sopravvivenza.

Pertanto, il C intestinale con DTH antigene-specifico stabilito non ha beneficiato in modo misurabile degli allotrapianti corneali o cutanei. Come si può vedere dall'esperimento odierno, il trapianto di cornea è una procedura tecnicamente impegnativa. Tuttavia, questo è il modello migliore per studiare le celle e i fattori che determinano il successo o il fallimento del grafico.