Name: Sviluppo di un In Vitro Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Impara a valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali post-EMT mediante un saggio di contrazione del gel. Questa tecnica riproducibile non richiede attrezzature specializzate e facilita lo studio delle malattie infiammatorie come la fibrosi polmonare.

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Ringraziamo il Dr. Tadashi Koyama per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; una sovvenzione al Gruppo di Ricerca sull'Insufficienza Respiratoria del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone; una sovvenzione per la ricerca sulle malattie allergiche e l'immunologia, Giappone.

1. Preparazioni e coltura di cellule epiteliali del polmone <ol><li> cellule epiteliali del polmone umano A549 Cultura (linea cellulare aderente) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 100 UI / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. </li><li> Rimuovere e scartare il terreno di coltura di cellule dal piatto di cultura, e lavare una volta con 5 - 10 ml di tampone fosfato salino (PBS). Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml Tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,05%) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 3 min. </li><li> Raccogliere le cellule staccate in provette da centrifuga contenenti terreno di coltura cellulare, centrifugare le provette a temperatura ambiente per 4 min a 150 × g. </li><li> Risospendere le cellule pellet in 2 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per il conteggio delle cellule. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro con Trypan blu macchia di verificare la vitalità delle cellule. </li><li> cellule Seed A549 su10 piatti cm polistirolo con una densità di 0,5 - 1,0 × 10 6 cellule / piatto con 10 ml di terreno per test gel contrazione. Seme le celle 6 pozzetti di polistirene ad una densità di 0,5 - 1,0 × 10 5 cellule / pozzetto con 2 ml di mezzo per la conferma EMT. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore. </li></ol> 2. Procedura EMT <ol><li> Aggiungere 10 ml di TGF-β1 (5 mg / ml) e 10 ml di TNF-α (10 ug / ml) alla piastra per test gel contrazione seminate in fase 1.6. Aggiungere 2 ml di TGF-β1 (5 mg / ml) e 2 ml di TNF-α (10 ug / ml) alla piastra di conferma EMT seminate in fase 1.6. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore. </li></ol> 3. Conferma di procedura EMT mediante PCR e Western Blotting <ol><li> Confermare il cambiamento nella morfologia (da ciottoli simile al mandrino forma) di cellule trattate usando la microscopia a contrasto di fase. Nota: Normcellule di Al A549 hanno cobble aspetto lapideo e di forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali, ma dopo stimolazione con TGF-β1 e TNF-α, le cellule appaiono lungo e mandrino forma che è simile alle cellule mesenchimali 14,15. </li><li> Valutare l&#39;espressione di un marcatore epiteliale, come ad esempio E-caderina, e marcatori mesenchimali quali la N-caderina, vimentina, e α-actina del muscolo liscio utilizzando PCR o Western blotting. <ol><li> Estratto RNA totale dalle cellule utilizzando kit di estrazione di RNA 16 e sintetizzare cDNA utilizzando trascrittasi inversa 17 secondo il protocollo del produttore. </li><li> Misurare l&#39;espressione dei livelli di mRNA utilizzando in tempo reale del sistema PCR 18 e colorante cianinico monomerico kit per la PCR in base alle istruzioni del fabbricante. I primers specifici per GAPDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), ACTA2 (alpha-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) sono mostrati in Tabella 1 </strong&gt;. </li><li> Lisare le cellule utilizzando un tampone di lisi (Tabella 2) soluzione contenente 1% di cocktail di inibitori delle proteasi. Misurare tutte le concentrazioni di proteine ​​del campione utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​19,20, e applicare le stesse quantità di proteine ​​ad un gel di poliacrilammide. <ol><li> Eseguire SDS gel elettroforesi e trasferimento semi-dry delle proteine ​​di membrana PVDF 21. Incubare la membrana con anticorpi primari in tampone di bloccaggio per 1 - 2 ore. Dopo l&#39;incubazione, lavare due volte la membrana con tampone di lavaggio e incubare la membrana hr 1 secondo anticorpi. Nota: vedere la tabella Materiali / Attrezzature per gli anticorpi e le diluizioni utilizzati in questi studi. Vedere la Tabella 2 per i componenti del tampone di bloccaggio. </li><li> Lavare la membrana con tampone di lavaggio due volte. Scattare foto della membrana con il kit di rilevamento occidentale blotting 22 con una camera CCD 11,23 freddo. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Contrazione Assay per EMT valutazione <ol><li> Aspirare il supporto condizionata dalla nave coltura cellulare, e lavare bene con 5 - 10 ml di PBS per rimuovere le cellule morte. Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina / EDTA e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 3 min. </li><li> Raccogliere le cellule staccate in provette da centrifuga contenenti DMEM integrato con inibitore della tripsina (1 mg / ml), centrifugare le provette a temperatura ambiente per 4 minuti a 150 × g. </li><li> Mescolare tipo gel 1 collagene con acqua distillata, e 4 × DMEM concentrati per regolare i volumi per ottenere una concentrazione di collagene di 1,75 mg / ml e 1 x concentrazione DMEM. Essere sicuri di mantenere il supporto gel sul ghiaccio durante questa fase. Nota: Per fare 6 ml di mezzo di gel, mescolare bene 3,5 ml di tipo 1 collagene gel (3 mg / ml), 1,5 ml di 4 × DMEM concentrato e 1 ml di acqua distillata. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS e rimuovere un campione per il conteggio delle cellule. Contareil numero delle cellule utilizzando un emocitometro con trypan blue macchia per verificare la vitalità cellulare. </li><li> Aggiungere il mezzo gel per regolare i volumi di raggiungere una densità cellulare di 3,0 x 10 5 cellule / pozzetto (6,0 × 10 5 cellule / ml) e delicatamente ma rapidamente mescolare pipettando senza gelificazione. </li><li> Versare 0,5 ml della miscela in ciascun pozzetto di una piastra non trattata 24 pozzetti rapidamente e con attenzione per rendere forma cilindrica ordinata. Fare attenzione a non consentire eventuali bolle d&#39;aria per contaminare i gel (Figura 1A). Nota: Il mezzo gel contenente le cellule è viscoso e può facilmente gel e la forma forma di mezzaluna nel pozzo. </li><li> Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e il 95% di umidità al gel completamente. </li><li> Staccare gel dalla piastra senza rompere spostando una spatola sterilizzato in modo per disegnare una circonferenza in una direzione. Utilizzando una spatola, trasferire delicatamente i gel a 60 mm piatti di coltura dei tessuticontenente 5 ml di DMEM / FBS 1% con o senza TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Agitare delicatamente i piatti per garantire gel stanno galleggiando sul supporto. Incubare in un incubatore cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e il 95% di umidità. </li></ol> 5. Misura di Gel Size <ol><li> Misurare le dimensioni gel di collagene dopo 0, 24, 48, e 72 ore utilizzando un sistema di analisi dell&#39;immagine. <ol><li> Accendere il sistema di documentazione gel (Figura 2A), e mettere i piatti nel mobile luce di schermatura. Poi togliere il coperchio di piatti nel mobile. </li><li> Aprire il relativo software di analisi di gel. Fare clic sul pulsante &quot;acquisizione delle immagini&quot; nella barra dei menu per visualizzare l&#39;immagine del gel nel cabinet. Quindi, fai clic su &quot;acquisire&quot; nella barra dei menu per scattare foto dei gel (Figura 2b). </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;rilevamento&quot; nella barra dei menu (Figura 2C) e regolare la regione di misura (cerchio giallo in Figura 2C) trascinando il mouse. Quindi, fare clic sul pulsante &quot;auto-detect&quot; nella barra dei menu (vedi pulsante nella Figura 2D). Il software rileva automaticamente i gel che mostra una mappa termica (Figura 2D). </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot; per estrarre il contorno dei gel di elaborazione delle immagini e per calcolare le aree circondate da contorno (Figura 2E). Dopo che l&#39;area viene calcolata, l&#39;area calcolata viene visualizzata nella finestra pop-up separata. Nota: se il gel si sovrappongono l&#39;un l&#39;altro durante l&#39;imaging, spostare i gel delicatamente con un puntale sterile. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il protocollo sviluppato in questo studio comprende due fasi. Il primo passo è eseguito per indurre EMT, mentre il secondo passo è il dosaggio gel contrazione. Poiché è importante confermare che le cellule sottoposti EMT, passaggio 2 fornisce un eccellente complemento ai cambiamenti di espressione morfologiche e geniche. Studi precedenti hanno mostrato che EMT delle cellule A549 è stata indotta da solo il 24 TGF-β1; tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza 10, TNF-α aumenta EMT e l&#39;acquis...

La fibrosi è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie croniche progressive, come la malattia polmonare interstiziale, fibrosi cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale terminale, sclerosi sistemica, e malattie autoimmuni 1. Tra le malattie polmonari interstiziali, la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia cronica progressiva e mostra prognosi infausta. caratteristica patologica della IPF è lo sviluppo di focolai fibroblastici costituito da fibroblasti attivati ​​e miofibroblasti che sono associati con la prognosi. Le origini di tali fibroblasti polmonari sono proposti per essere derivato da varie cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti polmonari residenti in origine e fibrociti circolanti dal midollo osseo. Recentemente, transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è stata proposta per essere associato con la formazione di cellule mesenchimali 2, e contribuire alla patogenesi di malattie fibrotiche. Si pensa che EMT svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo fetale, la guarigione della ferita, e la progressione del cancro, tra cui l&#39;invasione tumorale e metastasi 3. A seguito del processo di EMT, cellule epiteliali ottenere la capacità delle cellule mesenchimali da perdita di marcatori epiteliali, come la E-caderina, e l&#39;espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina, e α-actina del muscolo liscio (SMA) 4,5. Studi precedenti hanno mostrato l&#39;evidenza che processo EMT è stato associato con lo sviluppo della fibrosi tissutale nel rene e del polmone 6 7. Inoltre, l&#39;infiammazione cronica promuove fibrotica malattia 8; Inoltre, tali citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale membro superfamiglia 14 (TNFSF14, la luce), il fattore di necrosi tumorale (TNF) -α, e l&#39;interleuchina-1β, hanno dimostrato di migliorare EMT 9-12. assay contrazione di gel di collagene, un saggio contrazione delle cellule a base di collagene, in cui fibroblasti sono incorporati nel tipo Icollagene gel tridimensionale, è un ideale modello in vitro per la valutazione della contrattilità. Contrattilità è una delle funzioni caratteristiche di fibroblasti e contribuisce al normale ferita riparazione e fibrosi 13. In questo saggio, si ritiene che l&#39;attaccamento di fibroblasti di collagene di tipo I mediante meccanismi di integrine e dovrebbe produrre tensione meccanica in alcune condizioni, e di conseguenza portare alla contrazione del tessuto. Qui, lo sviluppo del test gel contrazione è segnalato per essere adattato per valutare l&#39;acquisizione della funzione contrattile nelle cellule che sottoposti EMT. Questo rapporto dimostra che questo saggio modificato è adatto per valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Per A549 medio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante-&beta; 1, Umano, ricombinante</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano TNF-&alfa;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Caderina (24E10) Clone monoclonale di coniglio</td> Tecnologia <td>di segnalazione cellulare</td><td>#3195</td><td>Diluizione 1:3.000</td></tr><tr><td>Vimentina (D21H3) Corpo monoclonale di coniglio</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#5741</td><td>Diluizione 1:3.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-alfa-tubulina</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>Diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-actina, &alfa;-Muscolo liscio& nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>Diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-N-caderina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>IgG anti-topo, Pecora antiaderente intera legata a HRP (anticorpo secondario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>Diluizione 1:20.000 IgG</td></tr><tr><td>anti-coniglio, Asino antiaderente intero legato a HRP (anticorpo secondario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL 1</td><td>:20.000 diluizione</td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% in TBS-T</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti, con coperchio</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piatto per coltura cellulare</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>tecnologie per la vita</td> in polvere <td>12100-046</td><td>Per 4&volte; DMEM</td></tr><tr><td>Gel di collagene di tipo 1</td><td>Gelatina Nitta</td><td>Cellmatrix tipo I-A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di documentazione su gel&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel imager</td></tr><tr><td>Software di analisi su gel</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>software di analisi in bundle con AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti, soluzione di</td> tripano <td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td>non trattata</tr><tr><td>, 0,4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita</td> della<td>trascrittasi inversa</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Kit PCR verde Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Kit per PCR verde</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFKit</td><td></td> per il dosaggio delle proteine ATTO 2392390 <td></td></tr><tr><td></td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel di poliacrilammide</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di rilevamento Western blotting</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD a freddo</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene (20)Monolaurato di sorbitano</td><td>Wako Prodotti chimici di laboratorio</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene (9) ottiifenile etere</td><td>Wako Prodotti chimici di laboratorio</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un<em&gt; in vitro</em&gt; test per valutare funzione contrattile del mesenchimali le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

La fibrosi è spesso coinvolta nella patogenesi di varie malattie croniche progressive come la broncopneumopatia interstiziale. Il segno distintivo patologico è la formazione di focolai fibroblastici, che è associato alla gravità della malattia. Si propone che le cellule mesenchimali costituite dai focolai fibroblastici derivino da diverse fonti cellulari, inclusi i fibroblasti intrapolmonari originariamente residenti e i fibrociti circolanti del midollo osseo. Recentemente, si è supposto che anche le cellule mesenchimali sottoposte a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) contribuiscano alla patogenesi della fibrosi. Inoltre, l'EMT può essere indotta trasformando il fattore di crescita β e l'EMT può essere potenziata da citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale α. Il test di contrazione su gel è un modello in vitro ideale per la valutazione della contrattilità, che è una delle funzioni caratteristiche dei fibroblasti e contribuisce alla riparazione delle ferite e alla fibrosi. Qui, è dimostrato lo sviluppo di un saggio di contrazione del gel per valutare la capacità contrattile delle cellule mesenchimali sottoposte a EMT.

Durante EMT, le cellule epiteliali perdono marcatori epiteliali, come E-caderina, e di ottenere l&#39;espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina e α-actina muscolo liscio 4,5. L&#39;incubazione delle cellule epiteliali umane A549 polmone con TGF-β1 e TNF-α induce EMT. L&#39;aspetto delle normali cellule A549 sono pietra ciottolo come forma e la forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali (Figura 3A), ma dopo stimolate con TG...

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito in vitro la transizione mesenchimale epiteliale indotta da citochine infiammatorie, o EMT. Questo mesenchimale è una variazione della funzione cellulare di base dopo EMT indotta da risposte immunitarie infiammatorie, come durante la fibrosi polmonare idiopatica o il rimodellamento delle vie aeree nell'asma grave. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede dispositivi specifici e che dimostra un alto contenuto A demontare la procedura saranno Hideyuki Takeshima e Kosuke Makita studenti laureati del mio laboratorio.Inizia lavando una coltura di cellule epiteliali polmonari umane A-549 con da cinque a dieci millilitri di PBS. Successivamente, staccare le cellule aderenti con due millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica. Dopo tre minuti, trasferire la sospensione cellulare in provette coniche contenenti terreno di coltura cellulare e centrifugare le cellule in una centrifuga.Risospendere i pellet in due millilitri di terreno di coltura cellulare, riservandone un piccolo eloquato per il conteggio. Quindi seminare da 0,5 a 1 volte 10 alla sesta cellula in dieci millilitri di terreno per dieci centimetri di piatto di polisterene e incubare le colture cellulari per 24 ore. Per l'induzione EMT, il giorno successivo, trattare le cellule con 10 microlitri di TGF beta 1 e TNF alfa e rimettere le piastre nell'incubatore per altre 48 ore.Il quarto giorno, lavare le colture indotte da emt con cinque-dieci millilitri di pbs, quindi staccare le cellule con tripsina-EDTA come appena dimostrato. Successivamente, centrifugare le sospensioni cellulari in DMEM integrato con inibitore della tripsina e risospendere i pellet in 500 microlitri di pbs. Quindi contare le cellule e aggiungere il terreno di coltura preparato fresco a una densità di 3 volte 10 alla quinta cellula per pozzetto, mescolando delicatamente ma rapidamente la soluzione con una pipetta prima della gelificazione.Prontamente, ma con attenzione, erogare 0,5 millilitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non trattata in forme cilindriche pulite. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 15 minuti. Quando il gel si è completamente solidificato, muovi una spatola sterilizzata in un cerchio attorno all'esterno di ciascun gel in una direzione, per staccare i gel dalle piastre senza rompersi.Quando si rimuove il gel, fare attenzione a non muovere la spatola avanti e indietro nel pozzetto. Quindi utilizzare la spatola per trasferire delicatamente i gel in piastre individuali di coltura tissutale da 16 millimetri contenenti cinque millilitri di DMEM integrati con l'1% di FBS, con o senza TGF beta 1 e TNF alfa. Infine, agitare delicatamente i piatti per assicurarsi che i gel galleggino sul terreno e rimettere i gel nell'incubatore per colture cellulari.Le cellule a541 non trattate mostrano un aspetto simile a un ciottolo e a forma di triangolo, caratteristico delle cellule epiteliali. Dopo la loro stimolazione con TGF beta 1 e TNF alfa, tuttavia, le cellule mostrano una forma a fuso lungo, simile a quella osservata per le cellule mesinfemali. Il QRTCPR dell'espressione dei marcatori epiteliali e mesinfemali prima e dopo l'EMT rivela che le cellule A541 trattate con citochine infiammatorie per 48 ore mostrano un'espressione significativamente ridotta di CDH1 e un'espressione significativamente aumentata di VIAM e ACTA2.Inoltre, la stimolazione con queste citochine attenua l'espressione di E-caderina come determinato dall'analisi del sangue occidentale, mentre vengono indotte le espressioni di vimentina, N-caderina e alfa actina della muscolatura liscia. In un test di contrazione su gel, dopo 48 ore, i gel contenenti cellule trattate con TGF beta 1 e TNF alfa sono più piccoli dei gel controllati contenenti cellule trattate con PBS. Infatti, dopo 72 ore, la dimensione dei gel contenenti i gel trattati con citochine è significativamente ridotta, rispetto ai gel controllati misurati da un analizzatore di gel.Come osservato, le fasi di contrazione del gel possono essere completate in tre ore se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare che l'EMT è stato indotto con successo prima di eseguire il test di contrazione del gel. Dopo l'osservazione, questa tecnica fornisce un modo per variare il processo EMT durante lo stato infiammatorio come la fibrosi o il rimodellamento polmonare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come emettere cellule che hanno EMT, in un tipo di cuagenter e montarle in terreno.

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Sviluppo di un In Vitro Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali (Video) | JoVE Journal

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