Sviluppo di un In Vitro Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito in vitro la transizione mesenchimale epiteliale indotta da citochine infiammatorie, o EMT. Questo mesenchimale è una variazione della funzione cellulare di base dopo EMT indotta da risposte immunitarie infiammatorie, come durante la fibrosi polmonare idiopatica o il rimodellamento delle vie aeree nell'asma grave. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede dispositivi specifici e che dimostra un alto contenuto A demontare la procedura saranno Hideyuki Takeshima e Kosuke Makita studenti laureati del mio laboratorio.

Inizia lavando una coltura di cellule epiteliali polmonari umane A-549 con da cinque a dieci millilitri di PBS. Successivamente, staccare le cellule aderenti con due millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica. Dopo tre minuti, trasferire la sospensione cellulare in provette coniche contenenti terreno di coltura cellulare e centrifugare le cellule in una centrifuga.

Risospendere i pellet in due millilitri di terreno di coltura cellulare, riservandone un piccolo eloquato per il conteggio. Quindi seminare da 0,5 a 1 volte 10 alla sesta cellula in dieci millilitri di terreno per dieci centimetri di piatto di polisterene e incubare le colture cellulari per 24 ore. Per l'induzione EMT, il giorno successivo, trattare le cellule con 10 microlitri di TGF beta 1 e TNF alfa e rimettere le piastre nell'incubatore per altre 48 ore.

Il quarto giorno, lavare le colture indotte da emt con cinque-dieci millilitri di pbs, quindi staccare le cellule con tripsina-EDTA come appena dimostrato. Successivamente, centrifugare le sospensioni cellulari in DMEM integrato con inibitore della tripsina e risospendere i pellet in 500 microlitri di pbs. Quindi contare le cellule e aggiungere il terreno di coltura preparato fresco a una densità di 3 volte 10 alla quinta cellula per pozzetto, mescolando delicatamente ma rapidamente la soluzione con una pipetta prima della gelificazione.

Prontamente, ma con attenzione, erogare 0,5 millilitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti non trattata in forme cilindriche pulite. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 15 minuti. Quando il gel si è completamente solidificato, muovi una spatola sterilizzata in un cerchio attorno all'esterno di ciascun gel in una direzione, per staccare i gel dalle piastre senza rompersi.

Quando si rimuove il gel, fare attenzione a non muovere la spatola avanti e indietro nel pozzetto. Quindi utilizzare la spatola per trasferire delicatamente i gel in piastre individuali di coltura tissutale da 16 millimetri contenenti cinque millilitri di DMEM integrati con l'1% di FBS, con o senza TGF beta 1 e TNF alfa. Infine, agitare delicatamente i piatti per assicurarsi che i gel galleggino sul terreno e rimettere i gel nell'incubatore per colture cellulari.

Le cellule a541 non trattate mostrano un aspetto simile a un ciottolo e a forma di triangolo, caratteristico delle cellule epiteliali. Dopo la loro stimolazione con TGF beta 1 e TNF alfa, tuttavia, le cellule mostrano una forma a fuso lungo, simile a quella osservata per le cellule mesinfemali. Il QRTCPR dell'espressione dei marcatori epiteliali e mesinfemali prima e dopo l'EMT rivela che le cellule A541 trattate con citochine infiammatorie per 48 ore mostrano un'espressione significativamente ridotta di CDH1 e un'espressione significativamente aumentata di VIAM e ACTA2.

Inoltre, la stimolazione con queste citochine attenua l'espressione di E-caderina come determinato dall'analisi del sangue occidentale, mentre vengono indotte le espressioni di vimentina, N-caderina e alfa actina della muscolatura liscia. In un test di contrazione su gel, dopo 48 ore, i gel contenenti cellule trattate con TGF beta 1 e TNF alfa sono più piccoli dei gel controllati contenenti cellule trattate con PBS. Infatti, dopo 72 ore, la dimensione dei gel contenenti i gel trattati con citochine è significativamente ridotta, rispetto ai gel controllati misurati da un analizzatore di gel.

Come osservato, le fasi di contrazione del gel possono essere completate in tre ore se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare che l'EMT è stato indotto con successo prima di eseguire il test di contrazione del gel. Dopo l'osservazione, questa tecnica fornisce un modo per variare il processo EMT durante lo stato infiammatorio come la fibrosi o il rimodellamento polmonare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come emettere cellule che hanno EMT, in un tipo di cuagenter e montarle in terreno.