Name: Sviluppo di un In Vitro Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Impara a valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali post-EMT mediante un saggio di contrazione del gel. Questa tecnica riproducibile non richiede attrezzature specializzate e facilita lo studio delle malattie infiammatorie come la fibrosi polmonare.

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Ringraziamo il Dr. Tadashi Koyama per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; una sovvenzione al Gruppo di Ricerca sull'Insufficienza Respiratoria del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone; una sovvenzione per la ricerca sulle malattie allergiche e l'immunologia, Giappone.

1. Preparazioni e coltura di cellule epiteliali del polmone <ol><li> cellule epiteliali del polmone umano A549 Cultura (linea cellulare aderente) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 100 UI / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. </li><li> Rimuovere e scartare il terreno di coltura di cellule dal piatto di cultura, e lavare una volta con 5 - 10 ml di tampone fosfato salino (PBS). Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml Tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,05%) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 3 min. </li><li> Raccogliere le cellule staccate in provette da centrifuga contenenti terreno di coltura cellulare, centrifugare le provette a temperatura ambiente per 4 min a 150 × g. </li><li> Risospendere le cellule pellet in 2 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per il conteggio delle cellule. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro con Trypan blu macchia di verificare la vitalità delle cellule. </li><li> cellule Seed A549 su10 piatti cm polistirolo con una densità di 0,5 - 1,0 × 10 6 cellule / piatto con 10 ml di terreno per test gel contrazione. Seme le celle 6 pozzetti di polistirene ad una densità di 0,5 - 1,0 × 10 5 cellule / pozzetto con 2 ml di mezzo per la conferma EMT. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore. </li></ol> 2. Procedura EMT <ol><li> Aggiungere 10 ml di TGF-β1 (5 mg / ml) e 10 ml di TNF-α (10 ug / ml) alla piastra per test gel contrazione seminate in fase 1.6. Aggiungere 2 ml di TGF-β1 (5 mg / ml) e 2 ml di TNF-α (10 ug / ml) alla piastra di conferma EMT seminate in fase 1.6. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore. </li></ol> 3. Conferma di procedura EMT mediante PCR e Western Blotting <ol><li> Confermare il cambiamento nella morfologia (da ciottoli simile al mandrino forma) di cellule trattate usando la microscopia a contrasto di fase. Nota: Normcellule di Al A549 hanno cobble aspetto lapideo e di forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali, ma dopo stimolazione con TGF-β1 e TNF-α, le cellule appaiono lungo e mandrino forma che è simile alle cellule mesenchimali 14,15. </li><li> Valutare l&#39;espressione di un marcatore epiteliale, come ad esempio E-caderina, e marcatori mesenchimali quali la N-caderina, vimentina, e α-actina del muscolo liscio utilizzando PCR o Western blotting. <ol><li> Estratto RNA totale dalle cellule utilizzando kit di estrazione di RNA 16 e sintetizzare cDNA utilizzando trascrittasi inversa 17 secondo il protocollo del produttore. </li><li> Misurare l&#39;espressione dei livelli di mRNA utilizzando in tempo reale del sistema PCR 18 e colorante cianinico monomerico kit per la PCR in base alle istruzioni del fabbricante. I primers specifici per GAPDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), ACTA2 (alpha-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) sono mostrati in Tabella 1 </strong&gt;. </li><li> Lisare le cellule utilizzando un tampone di lisi (Tabella 2) soluzione contenente 1% di cocktail di inibitori delle proteasi. Misurare tutte le concentrazioni di proteine ​​del campione utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​19,20, e applicare le stesse quantità di proteine ​​ad un gel di poliacrilammide. <ol><li> Eseguire SDS gel elettroforesi e trasferimento semi-dry delle proteine ​​di membrana PVDF 21. Incubare la membrana con anticorpi primari in tampone di bloccaggio per 1 - 2 ore. Dopo l&#39;incubazione, lavare due volte la membrana con tampone di lavaggio e incubare la membrana hr 1 secondo anticorpi. Nota: vedere la tabella Materiali / Attrezzature per gli anticorpi e le diluizioni utilizzati in questi studi. Vedere la Tabella 2 per i componenti del tampone di bloccaggio. </li><li> Lavare la membrana con tampone di lavaggio due volte. Scattare foto della membrana con il kit di rilevamento occidentale blotting 22 con una camera CCD 11,23 freddo. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Contrazione Assay per EMT valutazione <ol><li> Aspirare il supporto condizionata dalla nave coltura cellulare, e lavare bene con 5 - 10 ml di PBS per rimuovere le cellule morte. Dopo il lavaggio, aspirare immediatamente la PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina / EDTA e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 3 min. </li><li> Raccogliere le cellule staccate in provette da centrifuga contenenti DMEM integrato con inibitore della tripsina (1 mg / ml), centrifugare le provette a temperatura ambiente per 4 minuti a 150 × g. </li><li> Mescolare tipo gel 1 collagene con acqua distillata, e 4 × DMEM concentrati per regolare i volumi per ottenere una concentrazione di collagene di 1,75 mg / ml e 1 x concentrazione DMEM. Essere sicuri di mantenere il supporto gel sul ghiaccio durante questa fase. Nota: Per fare 6 ml di mezzo di gel, mescolare bene 3,5 ml di tipo 1 collagene gel (3 mg / ml), 1,5 ml di 4 × DMEM concentrato e 1 ml di acqua distillata. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS e rimuovere un campione per il conteggio delle cellule. Contareil numero delle cellule utilizzando un emocitometro con trypan blue macchia per verificare la vitalità cellulare. </li><li> Aggiungere il mezzo gel per regolare i volumi di raggiungere una densità cellulare di 3,0 x 10 5 cellule / pozzetto (6,0 × 10 5 cellule / ml) e delicatamente ma rapidamente mescolare pipettando senza gelificazione. </li><li> Versare 0,5 ml della miscela in ciascun pozzetto di una piastra non trattata 24 pozzetti rapidamente e con attenzione per rendere forma cilindrica ordinata. Fare attenzione a non consentire eventuali bolle d&#39;aria per contaminare i gel (Figura 1A). Nota: Il mezzo gel contenente le cellule è viscoso e può facilmente gel e la forma forma di mezzaluna nel pozzo. </li><li> Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e il 95% di umidità al gel completamente. </li><li> Staccare gel dalla piastra senza rompere spostando una spatola sterilizzato in modo per disegnare una circonferenza in una direzione. Utilizzando una spatola, trasferire delicatamente i gel a 60 mm piatti di coltura dei tessuticontenente 5 ml di DMEM / FBS 1% con o senza TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Agitare delicatamente i piatti per garantire gel stanno galleggiando sul supporto. Incubare in un incubatore cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 e il 95% di umidità. </li></ol> 5. Misura di Gel Size <ol><li> Misurare le dimensioni gel di collagene dopo 0, 24, 48, e 72 ore utilizzando un sistema di analisi dell&#39;immagine. <ol><li> Accendere il sistema di documentazione gel (Figura 2A), e mettere i piatti nel mobile luce di schermatura. Poi togliere il coperchio di piatti nel mobile. </li><li> Aprire il relativo software di analisi di gel. Fare clic sul pulsante &quot;acquisizione delle immagini&quot; nella barra dei menu per visualizzare l&#39;immagine del gel nel cabinet. Quindi, fai clic su &quot;acquisire&quot; nella barra dei menu per scattare foto dei gel (Figura 2b). </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;rilevamento&quot; nella barra dei menu (Figura 2C) e regolare la regione di misura (cerchio giallo in Figura 2C) trascinando il mouse. Quindi, fare clic sul pulsante &quot;auto-detect&quot; nella barra dei menu (vedi pulsante nella Figura 2D). Il software rileva automaticamente i gel che mostra una mappa termica (Figura 2D). </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot; per estrarre il contorno dei gel di elaborazione delle immagini e per calcolare le aree circondate da contorno (Figura 2E). Dopo che l&#39;area viene calcolata, l&#39;area calcolata viene visualizzata nella finestra pop-up separata. Nota: se il gel si sovrappongono l&#39;un l&#39;altro durante l&#39;imaging, spostare i gel delicatamente con un puntale sterile. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il protocollo sviluppato in questo studio comprende due fasi. Il primo passo è eseguito per indurre EMT, mentre il secondo passo è il dosaggio gel contrazione. Poiché è importante confermare che le cellule sottoposti EMT, passaggio 2 fornisce un eccellente complemento ai cambiamenti di espressione morfologiche e geniche. Studi precedenti hanno mostrato che EMT delle cellule A549 è stata indotta da solo il 24 TGF-β1; tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza 10, TNF-α aumenta EMT e l&#39;acquis...

La fibrosi è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie croniche progressive, come la malattia polmonare interstiziale, fibrosi cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale terminale, sclerosi sistemica, e malattie autoimmuni 1. Tra le malattie polmonari interstiziali, la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia cronica progressiva e mostra prognosi infausta. caratteristica patologica della IPF è lo sviluppo di focolai fibroblastici costituito da fibroblasti attivati ​​e miofibroblasti che sono associati con la prognosi. Le origini di tali fibroblasti polmonari sono proposti per essere derivato da varie cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti polmonari residenti in origine e fibrociti circolanti dal midollo osseo. Recentemente, transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è stata proposta per essere associato con la formazione di cellule mesenchimali 2, e contribuire alla patogenesi di malattie fibrotiche. Si pensa che EMT svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo fetale, la guarigione della ferita, e la progressione del cancro, tra cui l&#39;invasione tumorale e metastasi 3. A seguito del processo di EMT, cellule epiteliali ottenere la capacità delle cellule mesenchimali da perdita di marcatori epiteliali, come la E-caderina, e l&#39;espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina, e α-actina del muscolo liscio (SMA) 4,5. Studi precedenti hanno mostrato l&#39;evidenza che processo EMT è stato associato con lo sviluppo della fibrosi tissutale nel rene e del polmone 6 7. Inoltre, l&#39;infiammazione cronica promuove fibrotica malattia 8; Inoltre, tali citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale membro superfamiglia 14 (TNFSF14, la luce), il fattore di necrosi tumorale (TNF) -α, e l&#39;interleuchina-1β, hanno dimostrato di migliorare EMT 9-12. assay contrazione di gel di collagene, un saggio contrazione delle cellule a base di collagene, in cui fibroblasti sono incorporati nel tipo Icollagene gel tridimensionale, è un ideale modello in vitro per la valutazione della contrattilità. Contrattilità è una delle funzioni caratteristiche di fibroblasti e contribuisce al normale ferita riparazione e fibrosi 13. In questo saggio, si ritiene che l&#39;attaccamento di fibroblasti di collagene di tipo I mediante meccanismi di integrine e dovrebbe produrre tensione meccanica in alcune condizioni, e di conseguenza portare alla contrazione del tessuto. Qui, lo sviluppo del test gel contrazione è segnalato per essere adattato per valutare l&#39;acquisizione della funzione contrattile nelle cellule che sottoposti EMT. Questo rapporto dimostra che questo saggio modificato è adatto per valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Per A549 medio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante-&beta; 1, Umano, ricombinante</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano TNF-&alfa;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Caderina (24E10) Clone monoclonale di coniglio</td> Tecnologia <td>di segnalazione cellulare</td><td>#3195</td><td>Diluizione 1:3.000</td></tr><tr><td>Vimentina (D21H3) Corpo monoclonale di coniglio</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#5741</td><td>Diluizione 1:3.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-alfa-tubulina</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>Diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-actina, &alfa;-Muscolo liscio& nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>Diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-N-caderina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>IgG anti-topo, Pecora antiaderente intera legata a HRP (anticorpo secondario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>Diluizione 1:20.000 IgG</td></tr><tr><td>anti-coniglio, Asino antiaderente intero legato a HRP (anticorpo secondario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL 1</td><td>:20.000 diluizione</td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% in TBS-T</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti, con coperchio</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piatto per coltura cellulare</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>tecnologie per la vita</td> in polvere <td>12100-046</td><td>Per 4&volte; DMEM</td></tr><tr><td>Gel di collagene di tipo 1</td><td>Gelatina Nitta</td><td>Cellmatrix tipo I-A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di documentazione su gel&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel imager</td></tr><tr><td>Software di analisi su gel</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>software di analisi in bundle con AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti, soluzione di</td> tripano <td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td>non trattata</tr><tr><td>, 0,4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita</td> della<td>trascrittasi inversa</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Kit PCR verde Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Kit per PCR verde</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFKit</td><td></td> per il dosaggio delle proteine ATTO 2392390 <td></td></tr><tr><td></td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel di poliacrilammide</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di rilevamento Western blotting</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD a freddo</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene (20)Monolaurato di sorbitano</td><td>Wako Prodotti chimici di laboratorio</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene (9) ottiifenile etere</td><td>Wako Prodotti chimici di laboratorio</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un<em&gt; in vitro</em&gt; test per valutare funzione contrattile del mesenchimali le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

La fibrosi è spesso coinvolta nella patogenesi di varie malattie croniche progressive come la broncopneumopatia interstiziale. Il segno distintivo patologico è la formazione di focolai fibroblastici, che è associato alla gravità della malattia. Si propone che le cellule mesenchimali costituite dai focolai fibroblastici derivino da diverse fonti cellulari, inclusi i fibroblasti intrapolmonari originariamente residenti e i fibrociti circolanti del midollo osseo. Recentemente, si è supposto che anche le cellule mesenchimali sottoposte a transizione epitelio-mesenchimale (EMT) contribuiscano alla patogenesi della fibrosi. Inoltre, l'EMT può essere indotta trasformando il fattore di crescita β e l'EMT può essere potenziata da citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale α. Il test di contrazione su gel è un modello in vitro ideale per la valutazione della contrattilità, che è una delle funzioni caratteristiche dei fibroblasti e contribuisce alla riparazione delle ferite e alla fibrosi. Qui, è dimostrato lo sviluppo di un saggio di contrazione del gel per valutare la capacità contrattile delle cellule mesenchimali sottoposte a EMT.

Durante EMT, le cellule epiteliali perdono marcatori epiteliali, come E-caderina, e di ottenere l&#39;espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina e α-actina muscolo liscio 4,5. L&#39;incubazione delle cellule epiteliali umane A549 polmone con TGF-β1 e TNF-α induce EMT. L&#39;aspetto delle normali cellule A549 sono pietra ciottolo come forma e la forma triangolare che è una caratteristica delle cellule epiteliali (Figura 3A), ma dopo stimolate con TG...

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito in vitro la transizione mesenchimale epiteliale indotta da citochine infiammatorie, o EMT. Questo mesenchimale è una variazione della funzione cellulare di base dopo EMT indotta da risposte immunitarie infiammatorie, come durante la fibrosi polmonare idiopatica o il rimodellamento delle vie aeree nell'asma grave. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede dispositivi specifici e che dimostra un alto contenuto A demontare la procedura saranno Hideyuki Takeshima e Kosuke Makita studenti laureati del mio laboratorio.Inizia lavando una coltura di cellule epiteliali polmonari umane A-549 con da cinque a dieci millilitri di PBS. Successivamente, staccare le cellule aderenti con due millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica. Dopo tre minuti, trasferire la sospensione cellulare in provette coniche contenenti terreno di coltura cellulare e centrifugare le cellule in una centrifuga.Risospendere i pellet in due millilitri di terreno di coltura cellulare, riservandone un piccolo eloquato per il conteggio. Quindi semi

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Impara a valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali post-EMT mediante un saggio di contrazione del gel. Questa tecnica riproducibile non richiede attrezzature specializzate e facilita lo studio delle malattie infiammatorie come la fibrosi polmonare.

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