Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di interrogare le glicoproteine RIC HIV one envelope o la conferma ENV con anticorpi monoclonali. Ciò si ottiene effettuando prima il transecting delle cellule di aderenza per esprimere le proteine chimeriche dell'HIV e E NV sulla superficie cellulare. In una seconda fase, le cellule vengono incubate con anticorpi monoclonali anti ENV, che legheranno ENV a seconda dell'esposizione all'epitopo.

Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario coniugato HRP per quantificare l'interazione anticorpale mediante un test di chemiluminescenza. Si ottengono risultati che mostrano i livelli relativi di anticorpi legati al VNV in base alle unità di luce relative acquisite per ciascuno. Bene, il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la legatura basata sui fatti, è che questa tecnica può essere eseguita con una bassa quantità di anticorpi e ad alta produttività, un postdoc in laboratorio eseguirà questa tecnica.

Le cellule di osteosarcoma umano vengono utilizzate in questo esperimento un giorno prima della piastra di trasfezione, due volte 10 per la quarta cellula per pozzetto. In una piastra opaca per colture cellulari a 96 pozzetti adatta alla lettura della luminescenza. Il terreno usato delcos modified eagle integrato con siero fetale bovino e penicillina streptomicina incuba le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno successivo.

Preparare la miscela di trasfezione. Per prima cosa, posiziona due tubi, due vani e due B a due alloggiamenti. Aggiungere cinque microlitri di DMEM integrati con hippie da 25 millimolari, seguiti da 10 nanogrammi di plasmide tat e di rivestimento e 150 nanogrammi di glicoproteina codificante per l'HIV chimerico.

Si noti che il plasmide codificante TAT è richiesto solo quando si utilizza una glicoproteina dell'HIV tat dipendente che codifica il plasmide in due B a cinque microlitri di DMM e 450 nanogrammi di polietalina o PEI. Le quantità dei reagenti e del DNA devono essere regolate in base al numero di pozzetti che devono essere trasfettati con la stessa glicoproteina dell'HIV in un involucro. Quindi, aggiungere il contenuto di due B a due bay e mescolare accuratamente agitando per 10 secondi.

Incubare la miscela di trasfezione per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, aggiungere 10 microlitri della miscela di trasfezione per pozzetto della piastra a 96 pozzetti, incubare per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di ossido di carbonio. L'Ali SA per studiare il riconoscimento della glicoproteina chimerica dell'HIV con un involucro da parte di anticorpi monoclonali viene eseguita due giorni dopo la trasfezione delle cellule di osteosarcoma umano.

Preparare 250 millilitri di tampone di lavaggio per ogni piastra utilizzata contemporaneamente. Preparare 125 millilitri di tampone bloccante per piastra aggiungendo l'1% di latte scremato in polvere e cinque millimolari di tris pH 8.0 al tampone di lavaggio. Rimuovere il terreno di coltura cellulare e la miscela di trasfezione dalla piastra a 96 pozzetti.

Aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante per pozzetto e incubare per 20 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il surnatante e aggiungere 50 microlitri di anticorpo per pozzetto diluito alla concentrazione appropriata nel tampone bloccante. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare tre volte con 100 microlitri di tampone bloccante e poi ripetere il processo di lavaggio tre volte. Lavare tre volte con 100 microlitri di tampone bloccante e poi lavare tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio dopo l'ultimo lavaggio. Togliete il sate.

Aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante e incubare per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il surnatante e aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario diluito uno a 3000 in tampone bloccante. Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente dopo 40 minuti.

Lavare tre volte con 100 microlitri di tampone bloccante, seguiti da tre lavaggi con 100 microlitri di tampone di lavaggio. Per preparare i campioni per l'acquisizione dei dati, rimuovere il surnatante dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere 30 microlitri di un substrato di chemiluminescenza potenziato per pozzetto. Acquisire il segnale di chemiluminescenza per un secondo per pozzetto su un lettore di piastre adatto.

Secondo le istruzioni del produttore, l'impatto del CD 4 solubile o del CD 4 sull'esposizione degli epitopi CD 4 I sulle glicoproteine dell'involucro o ENV è stato l'interazione del test del CD quattro con ENV induce cambiamenti di conferma ENV che espongono gli epitopi 17 B e 48 D che si sovrappongono al sito di legame del co-recettore, ma non influisce sul dominio esterno riconoscendo l'anticorpo 2 G 12. Per valutare l'impatto delle mutazioni puntiformi nella conferma NV, sono stati utilizzati due mutanti ENV: H 66 A, che ha una ridotta propensione a campionare spontaneamente la conferma a quattro legamenti, e S3 75 W, che predispone la NV allo stato di quattro legati. Normalizzando i dati grezzi in base ai livelli di espressione, si scopre che H 66 A diminuisce il riconoscimento di CD di quattro I 17 B, mentre S3 75 W aumenta il segnale di 17 B ed è sufficiente a ripristinare il fenotipo di H 66.

Una culla di analisi delle cellule mutanti trasfettata con quantità crescenti di un espressore CD quattro. Insieme alla NV le barre blu hanno rivelato segnali crescenti per gli anticorpi monoclonali CD 4 I, A tre, due e C 11, che hanno riconosciuto epitopi discontinui nel dominio interno della glicoproteina ENV. Il riconoscimento di GP one 20 ENV da parte dei due anticorpi G 12 non è stato influenzato.

Infine, i dati grezzi sono stati normalizzati a due G 12, l'assenza di una modulazione 32 e C 11 quando ENV è stato trasfettato in culla con un mutante CD quattro con ridotta capacità di interagire con ENV indica che l'aumento dei segnali dipendeva dall'interazione E NV CD quattro Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore.