Name: Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Scopri la valutazione conformazionale delle glicoproteine di busta HIV-1 tramite saggio Cell-ELISA. Questo metodo ad alto rendimento consente di analizzare l'interazione con anticorpi monoclonali usando quantità ridotte di reagenti.

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Ringraziamo il Dr. James Robinson per il suo generoso dono della A32, 17b, 48d, e C11 anticorpi monoclonali. PGT 121 è stato ottenuto attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Questo lavoro è stato sostenuto da una Fondazione canadese per l&#39;innovazione programma Leader # 29866, da un esercizio CIHR # 257792, da un FRQS Istituzione di Young Scientist concede # 24639 di AF e da un finanziamento continuo CRCHUM nonché da un CIHR sovvenzione catalizzatore # 126630 AF e MR. AF è il destinatario di un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 borsa di studio # 24639. MV è stato sostenuto da un CIHR Dottorato Research Award # 291485.

1 Giorno 1 - Colture Cellulari <ol><li> Piastra 2 x 10 4 osteosarcoma umano (HOS) cellule per pozzetto in una, 96 pozzetti coltura cellulare opaco adatto per la lettura luminescenza. Utilizzare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U / ml di penicillina-streptomicina. Incubare fino al giorno successivo a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 2 Giorno 2 - polietilenimmina (PEI) Transfezione <ol><li> Preparare mix trasfezione in base alle fasi successive. Regolare reagenti e le quantità di DNA secondo il numero di pozzi che devono essere trasfettate con la stessa Env. </li><li> Tubo A: Aggiungi 10 ng plasmide Tat-codifica (ad esempio PTAT-III, 27) e 150 ng Env-plasmide codificante per 5 microlitri DMEM supplementato con 25 HEPES mM. </li><li> Il plasmide Tat-codifica è necessaria solo se si utilizza Tat-dipendente Env-plasmidi codificanti, come pSVIII. </li><li> Tubo B: Aggiungere 450 ng PEI (da un 1mg / ml soluzione) a 5 microlitri DMEM. </li><li> Aggiungere il contenuto di tubo B a tubo A. Mescolare accuratamente con il vortex per 10 secondi e incubare mix trasfezione 10 minuti a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Aggiungere 10 ml di miscela di trasfezione per pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 48 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 3 Giorno 4 - ELISA <ol><li> Eseguire tutti gli esperimenti a temperatura ambiente per ridurre al minimo possibile l&#39;endocitosi di ENV / anticorpi complessi. </li><li> Preparare 250 ml di tampone di lavaggio per piastra in uso allo stesso tempo. Lavaggio Buffer è 1x salina tamponata con Tris (TBS) pH 7.5 (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl), supplementato con 1 mM MgCl 2 e CaCl 1,8 mm 2. </li><li> Preparare 125 ml di tampone di bloccaggio per piastra con l&#39;aggiunta di latte in polvere scremato 1% e 5 mM Tris pH 8.0 a Washing Buffer. </li><li> Rimuovere i supporti di coltura cellulare e mix trasfezione (surnatante) dalla piastra a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 100 μ; L di tampone di bloccaggio per pozzetto e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 50 ml di anticorpi (o siero) per bene, diluito alla concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Tipicamente, utilizzare una concentrazione di 1 mg / ml. Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x con 100 microlitri tampone di bloccaggio e quindi ripetere il lavaggio 3x processo con 100 microlitri di lavaggio tampone. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 100 microlitri tampone di bloccaggio, e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 50 ml di anticorpo secondario, diluito 1/3000 in tampone di bloccaggio. Variare diluizione anticorpo ottimale in base alle differenze produttore. Incubare 40 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x con 100 microlitri tampone di bloccaggio e quindi ripetere il lavaggio 3x processo con 100 microlitri di lavaggio tampone. </li></ol> 4 Acquisizione Dati <ol><li> Rimuovere il surnatante dal piatto e aggiungere 30 microlitri 1x chemiluminescenza (ECL) substrato per pozzetto. </li><li> Acquisire chemsegnale iluminescence per 1 sec / bene su un piatto adatto-reader secondo le istruzioni del produttore. Tempo di lettura può variare in base alle differenze di hardware. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Questo test è ottimizzato per rilevare l&#39;interazione di anticorpi monoclonali specifici da HIV-1 trimeric Env espresso sulla superficie cellulare. Una volta che il protocollo è stato stabilito, può essere utilizzato a medio-elevate produzioni con bassi costi di materiale complessivi e piccole quantità di anticorpi. Dal momento che questo saggio è basato trasfezione-, può essere facilmente adattato per coexpression delle proteine ​​cellulari, come CD4 al fine di studiare i loro effetti sulla Env conformazione. <p...

Umana di tipo 1 del virus dell&#39;immunodeficienza (HIV-1) ingresso, mediato dalle trimeriche glicoproteine ​​dell&#39;involucro virale (ENV) è il primo passo del ciclo infettivo. Essendo l&#39;unico antigene virale esposto presentato alla superficie di virioni, la Env trimero suscita anticorpi neutralizzanti e nonneutralizing. Come tale, esso rappresenta un candidato interessante per la progettazione del vaccino immunogeno. Tuttavia, le prove di vaccinazione con Env in forme solubili o ricombinanti hanno suscitato risposte solo con efficacia minima contro la maggior parte primaria da HIV-1 isolati 1-3. Tuttavia, l&#39;efficacia parziale osservato nel trial vaccino RV144 4 rinnovato interesse per HIV-1 Env come candidato immunogeno. Questo è stato confermato da un recente studio che descrive che gli anticorpi vaccino-suscitato anti-Env sono stati sufficienti a generare un certo grado di protezione contro SIV e HIV sfide 5. Dopo essere sintetizzati nel reticolo endoplasmatico, il glycoprote Envin precursori, gp160, subisce varie modificazioni post-traduzionali che sono fondamentali per la sua capacità di alimentare il processo di fusione virale. Il precursore Env deve piegare correttamente e associato in trimeri prima di essere spaccati nelle sue extra-citoplasmatici gp120 e gp41 subunità transmembrana 6-10, con interazioni non covalenti mantenendo il collegamento gp120-gp41. La macchina cellula infetta è anche responsabile pesantemente glicosilazione Env, che comprende circa il 50% della sua massa totale 11,12. La struttura complessa risultante permette Env di essere conformazione flessibile 13,14, mentre fornisce un metastabilità che è pensato per consentire Env di adattarsi e nascondere alcuni epitopi altamente immunogenico che altrimenti sarebbero esposti 15-19, sottolineando l&#39;importanza di comprendere meglio le diverse conformazioni campionata dal Env trimero nativo. Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche e con successo utilizzati per studiare Env ch conformazionaleanges. Tuttavia, essi variano nelle loro limitazioni, essendo spesso limitato a specifici contesti Env. Ad esempio, risonanza plasmonica di superficie o immunoprecipitazione con anticorpi monoclonali specifici di conformazione (MAK, MAB), si basano sia su monomeriche molecole solubili o solubilizzati Env che sono noti per essere immunogenetically diverso dal loro forme trimeriche 20,21. Recenti studi suggeriscono anche che la scissione colpisce conformazioni Env conseguente l&#39;esposizione di epitopi principalmente riconosciuti da anticorpi nonneutralizing 14,22,23. Qui si descrive in dettaglio un metodo che permette di determinare facile e veloce della conformazione del-cellularmente espresso Env trimeri 18,24-26. A seguito di trasfezione transiente di Env in una linea di cellule aderenti umano il legame di anticorpi specifici Env-viene rilevato utilizzando una semplice reazione di chemiluminescenza. Questa tecnica può anche essere utilizzato per caratterizzare la preferenza conformazionale di conformazione Depenanticorpi dent. Così, questo saggio fornisce un metodo di rilevazione robusta e altamente flessibile.

<table><tbody><tr><td>Cellule HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura tissutale bianca opaca, 96 pozzetti, fondo piatto</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, 25.000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Preparato in soluzione da 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-umano di capra, coniugato con perossidasi</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di chemiluminescenza potenziato</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, lettore di piastre</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione conformazionale di hiv-1 trimeric busta glicoproteine ​​utilizzando una base di cell-elisa saggio

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Le glicoproteine dell'involucro dell'HIV-1 (Env) mediano l'ingresso virale nelle cellule bersaglio e sono essenziali per il ciclo infettivo. Comprendere in che modo queste glicoproteine sono in grado di alimentare il processo di fusione attraverso i loro cambiamenti conformazionali potrebbe portare alla progettazione di immunogeni migliori e più efficaci per le strategie vaccinali. Qui descriviamo un test ELISA basato su cellule che consente di studiare il riconoscimento dell'HIV-1 Env trimero da parte di anticorpi monoclonali. In seguito all'espressione di HIV-1 trimerico Env sulla superficie delle cellule trasfettate, gli anticorpi anti-Env specifici per la conformazione vengono incubati con le cellule. Un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano e una semplice reazione di chemiluminescenza vengono quindi utilizzati per rilevare gli anticorpi legati. Questo sistema è altamente flessibile ed è in grado di rilevare i cambiamenti conformazionali di Env indotti da CD4 solubili o da proteine cellulari. Richiede una quantità minima di materiale e nessuna attrezzatura o know-how altamente specializzato. Pertanto, questa tecnica può essere stabilita per lo screening a rendimento medio-alto di antigeni e anticorpi, come gli anticorpi appena isolati.

Utilizzando la procedura generale di cui sopra, abbiamo adattato il protocollo per saggiare l'impatto dei CD4 solubile (sCD4) e CD4 cellulare coexpressed sull'esposizione di epitopi CD4i su entrambi wild-type (WT) o mutato Env, come descritto in precedenza 18,24, 25,28. figura 1 rappresenta schematicamente la procedura generale e l'esposizione di epitopi CD4i seguito di trattamento con sCD4 o da coexpression di CD4 cellulare 18. Nella figura 2, abbiamo usato sCD4 d...

Comprendere le conformazioni degli antigeni di superficie virali è necessario per valutare la neutralizzazione degli anticorpi e guidare la progettazione di immunogeni efficaci per i vaccini. Qui descriviamo un test ELISA basato su cellule che consente lo studio del riconoscimento di HIV-1 Env trimero espresso sulla superficie di cellule trasfettate da specifici anticorpi anti-Env.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di interrogare le glicoproteine RIC HIV one envelope o la conferma ENV con anticorpi monoclonali. Ciò si ottiene effettuando prima il transecting delle cellule di aderenza per esprimere le proteine chimeriche dell'HIV e E NV sulla superficie cellulare. In una seconda fase, le cellule vengono incubate con anticorpi monoclonali anti ENV, che legheranno ENV a seconda dell'esposizione all'epitopo.Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario coniugato HRP per quantificare l'interazione anticorpale mediante un test di chemiluminescenza. Si ottengono risultati che mostrano i livelli relativi di anticorpi legati al VNV in base alle unità di luce relative acquisite per ciascuno. Bene, il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la legatura basata sui fatti, è che questa tecnica può essere eseguita con una bassa quantità di anticorpi e ad alta produttività, un postdoc in laboratorio eseguirà questa tecnica.Le cellule di osteosarcoma umano vengono utilizzate in questo esperimento un giorno prima della piastra di trasfezione, due volte 10 per la quarta cellula per pozzetto. In una piastra opaca p

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Immunologia e Infezioni

La regione corona di diverse sequenze ciclo V3 della glicoproteina busta superficie (gp120) del virus HIV-1 può essere strutturalmente caratterizzata in molti casi in ripiegamento silico di posizioni 10 a 22 del circuito con un...

Valutazione della immunologicamente rilevanti dinamiche Caratteristiche strutturali del terziario di HIV-1 sequenza R2 Loop Corona V3 da Ab initio Pieghevole

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine ​​di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di...

Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell&#39;HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di...

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Illustriamo qui un saggio di legame della membrana in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e le membrane lipidiche vengono analizzate visivamente utilizzando Gag con tag YFP sintetizzato in un sistema di traduzione in vitro basato su germe di grano e GUVs preparati con una tecnica di elettroformazione.

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Descriviamo un'analisi basata sulle celle per segnalare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Può essere utilizzato per testare gli inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l'antigene (VLP). L'immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell'involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all'analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della...

Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

Qui, descriviamo un test immunologico fluorescente multiplex di nuova concezione che utilizza un sistema citometrico a flusso dual-reporter per rilevare contemporaneamente due epitopi unici della proteina spike su particelle virali intatte di coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) che erano state catturate da microsfere magnetiche accoppiate all'enzima di conversione dell'angiotensina-2.

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Qui, descriviamo alcuni metodi consolidati per determinare lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l'attivazione della risposta proteica dispiegata (UPR), con particolare enfasi sull'infezione da HIV-1. Questo articolo descrive anche una serie di protocolli per studiare l'effetto dello stress ER/UPR sulla replicazione dell'HIV-1 e sull'infettività del virione.

Misurazione dello stress del reticolo endoplasmatico e della risposta proteica dispiegata nelle cellule T infette da HIV-1 e analisi del suo ruolo nella replicazione dell'HIV-1

Scopri la valutazione conformazionale delle glicoproteine di busta HIV-1 tramite saggio Cell-ELISA. Questo metodo ad alto rendimento consente di analizzare l'interazione con anticorpi monoclonali usando quantità ridotte di reagenti.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

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