Name: Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a propagare il virus influenzale A in uova di pollo fecondate per ottenere titoli elevati. Questo metodo economico supporta la ricerca virologica e lo sviluppo di vaccini con successo garantito.

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Il presente studio è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) e dall'American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

NOTA: Osservazioni generali: eseguire tutte le procedure che comportano la manipolazione delle uova in condizioni sterili, e una tecnica sterile deve essere utilizzato di conseguenza. Pre-pulire tutte le apparecchiature con il 70% di etanolo prima dell&#39;uso. In generale, l&#39;inoculazione di virus influenzale e la raccolta devono essere condotti in un laboratorio BSL-2. Tuttavia, se si utilizza questo protocollo per propagare molto più patogeno virus influenzali (ad esempio, ceppi pandemici e pre-pandemia, i ceppi che rappresentano un pericolo per pollame e bestiame, i ceppi di influenza aviaria ad alta patogenicità, 1918 H1N1 ceppo), i livelli di biosicurezza più alti e in alcuni casi, sono necessarie precauzioni di biosicurezza e le autorizzazioni. Il Comitato Istituzionale Biosicurezza locale dovrebbe approvare tutte le ricerche che coinvolgono il virus dell&#39;influenza. 1. Preparazione di uova per Inoculation <ol><li> Ottenere uova siero (SPF) esenti da organismi patogeni appena fecondato aviaria da un fornitore adatto. Tipicamente, si usano uova di gallina. Le uova devono essere noied immediatamente all&#39;arrivo. </li><li> Al posto All&#39;arrivo uova in una incubatrice dell&#39;uovo umidificato con un tornitore automatico uovo per ruotare le uova regolarmente. Se un tornitore automatica uovo non è disponibile, ruotare manualmente le uova almeno 2-3 volte al giorno (assicuratevi di indossare guanti e tenere tutto il più sterile possibile). </li><li> Incubare le uova a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10-11 giorni. </li></ol> Speratura 2. Egg <ol><li> Utilizzare un candler uovo per esaminare l&#39;uovo contro una luce in una stanza buia per controllare le uova per l&#39;infertilità da speratura dopo circa 7 o 8 giorni di incubazione. <ol><li> Pulire la candler uovo con il 70% di etanolo. Cambiare i guanti spesso e disinfettare con il 70% di etanolo per minimizzare il rischio di contaminazione da patogeni. </li><li> Rimuovere le uova dal termostato e metterli in cartoni delle uova vuote. </li><li> Spegnere le luci in sala. </li><li> Tenere l&#39;estremità grande ogni uovo uno alla volta contro l&#39;candler. </li><li> Osservare l&#39;uovo al determine se è fertile o infertile. NOTA: i vasi sanguigni sottili che portano a un embrione a forma di fagiolo deve essere chiaramente visibile. Uova non fecondate appariranno come una piccola macchia di sangue con un tuorlo d&#39;uovo visibile. </li></ol></li><li> Eliminare le uova che sono non fecondato, e restituire le uova vitali per l&#39;incubatrice. Non lasciare uova di fuori dell&#39;incubatore per più di 30 min. Se lo stato di un uovo non può essere confermata, segnare, e osservare in seguito. </li></ol> 3. Preparazione di Virus Inoculum <ol><li> Diluire virus dell&#39;influenza stock da circa marzo 10 - aprile 10 pfu / ml in PBS sterile contenente HEPES 10 mM (pH 7.4). Passaggio fondamentale: Diluire lo stock di virus immediatamente prima dell&#39;uso e conservare il virus diluito su ghiaccio per tutto il tempo. </li></ol> 4. Influenza Virus inoculazione mediante la Strada Allantoic <ol><li> Il giorno di inoculazione del virus (il giorno 10 o 11), candela di nuovo le uova ed eliminare eventuali embrioni morti. Distinguere embrioni vivi percercando movimento all&#39;interno dell&#39;uovo. </li><li> Rimuovere le tre uova dal termostato, e organizzare le uova in un supporto separato con il sacco aria fino. </li><li> Segnare lo spazio aereo delle uova con un pennarello indelebile. </li><li> Lavare il guscio d&#39;uovo sopra lo spazio aereo con il 70% di etanolo. </li><li> Mettere le uova con lo spazio aereo fino in un cartone di uova e in una cappa di biosicurezza (BSL-2). </li><li> Utilizzare un ago 18G sterili per perforare un piccolo foro nel guscio sopra la sacca d&#39;aria di ciascun uovo. Fare attenzione a non inserire l&#39;ago troppo profondamente per evitare di pugnalare l&#39;embrione o il tuorlo. </li><li> Redigere il virus dell&#39;influenza diluita in una siringa sterile da 1 ml e inserire un ago 22G. </li><li> Avanzare con cautela la siringa con l&#39;ago a un angolo nella cavità allantoica 45 °. </li><li> Iniettare 0,2 ml di virus dell&#39;influenza diluito. </li><li> Ripetere l&#39;iniezione con le altre due uova, e poi scarta la siringa e l&#39;ago. </li><li> Sigillare il foro con una goccia di colla da una pistola per colla (o paraffina fusa). Be attenzione che la colla non perde dentro l&#39;uovo. </li><li> Mettere le uova di nuovo nel incubatore uovo con lo spazio aereo puntato verso l&#39;alto. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,12 finché non sono stati inoculati tutte le uova. </li></ol> 5. Incubazione <ol><li> Incubare le uova infette senza girare a 37 ° C e ~ 60% di umidità. </li><li> Scegliere tempo ottimale di incubazione a seconda del tipo di virus dell&#39;influenza. Incubare influenza A per 48 ore; incubare l&#39;influenza B e C per 72 ore. </li></ol> 6. Influenza Virus Harvest <ol><li> Dopo il periodo di incubazione, le uova raffreddare a 4 ° C per un minimo di 4 ore (o O / N) per uccidere l&#39;embrione e costrizione dei vasi sanguigni per ridurre il rischio di contaminazione del liquido allantoico infetto di sangue. Questa operazione consente di evitare che i globuli rossi di assorbire il virus, che riduce il rendimento. In alternativa, le uova freddo per 30 min a -20 ° C; tuttavia questo aumenta il rischio di contaminazione del sangue. </li><li> Dopo che le uova sono state sufficientemente raffreddata, trasferire le uova di una cappa di biosicurezza. Mettere l&#39;uovo in un supporto stabile con la sac di aria verso l&#39;alto. Pulire la superficie dell&#39;uovo con il 70% di etanolo. </li><li> Usare le forbici sterili per aprire il guscio sopra la sacca d&#39;aria. Togliere il guscio intorno al sacco aereo facendo attenzione a non distruggere la membrana corioallantoidea. </li><li> Aprire la membrana corioallantoidea con una pinza smussato sterili. Spostare delicatamente a parte l&#39;embrione e il sacco vitellino con una piccola spatola o un cucchiaio. Fare attenzione a non rompere il tuorlo. </li><li> Usando una pipetta Eppendorf 1 ml, raccogliere con cura il liquido allantoico. Se necessario, inclinare l&#39;uovo un po &#39;di lato per raccogliere quanto più fluido possibile. </li><li> Combinare il liquido allantoico da tutte le uova in un tubo di plastica conica 50 ml. Tenere tubi sul ghiaccio in qualsiasi momento durante la vendemmia virus. I rendimenti Un uovo 5-10 ml di un liquido leggermente giallognolo. </li><li> Spin il liquido allantoico contenente il virus a 1.000 xg per 10 min a 46; C a pellet detriti. Trasferire il liquido chiaro in un nuovo tubo da 50 ml tenuta in ghiaccio. Smaltire le uova in un contenitore di rifiuti BSL-2. </li></ol> 7. Conservazione <ol><li> Un&#39;aliquota immediatamente il liquido chiarificato allantoico (ad esempio, 50, 100 o 500 aliquote ul) e snap-congelare in azoto liquido. Trasferire le riserve di virus congelati a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
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<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Influenza provoca un grande carico globale di malattia, e il lavoro continua nella comprensione della patogenesi del danno polmonare 7. Per la ricerca facilitato in questa malattia mortale, vari metodi sono stati sviluppati per diffondere il virus dell&#39;influenza 6. Qui, descriviamo una tecnica per la produzione di virus dell&#39;influenza in uova di gallina. Il vantaggio di questo metodo è che è altamente riproducibile e si traduce in grandi quantità ad alto titolo di riserve di virus influenza...

Influenza A continua ad essere una grave minaccia per la salute umana. Si tratta di una malattia respiratoria potenzialmente devastante con un grande carico globale provocando fino a 500.000 morti nel mondo ogni anno 1. I virus influenzali sono nella famiglia Orthomyxoviridae e portano a 8 negativo-sense singolo filamento di RNA nel loro genoma 1,2. L&#39;elevata mutevolezza (cioè, &quot;drift&quot; antigenico) del genoma virale impedisce immunità a lungo termine. Inoltre, l&#39;influenza è sempre più resistenti ai farmaci anti-virali 3. Il 2009 H1N1 pandemia influenzale ha evidenziato tutti i problemi difficili associati alla malattia influenzale (ceppo pandemico, la resistenza anti-virale, la produzione di vaccini in ritardo). La formulazione del vaccino è determinato annualmente dalla Organizzazione Mondiale della Sanità per i ceppi influenzali più probabile patogeni (uno ciascuno per H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Poiché questo metodo si basa su ceppo influenzale previstos, i ceppi patogeni sono a volte erroneamente identificati e l&#39;efficacia del vaccino si riduce drasticamente. Inoltre, la comparsa di nuovi ceppi di influenza può aggirare questi programmi di prevenzione che causano pandemie 2. La creazione di un vaccino influenzale universale è stato sfuggente 5. Pertanto, la ricerca deve continuare nella comprensione della patogenesi del danno polmonare. Per struttura di ricerca di laboratorio, diversi metodi sono stati sviluppati per l&#39;isolamento virale e la propagazione 6. Virus influenzali umani possono essere amplificati in una varietà di substrati cellulari di mammifero. Tuttavia, generando virus ad alto titolo in grandi quantità sono più raggiunti in uova embrionate. Il protocollo che segue descrive una tecnica per l&#39;influenza A la propagazione del virus e lo stoccaggio delle scorte di virus esistenti.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>uova di gallina fecondate senza agenti patogeni (SPF) sieriche&nbsp;</td>Incubatrice umidificata <td>per uova VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modello 2100</td><td></td></tr><tr><td>girauova automatico</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modello 3200</td><td></td></tr><tr><td>candelabro per uova</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modello 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>ago 18G</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>ago 20G / 22G</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo>99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluito al 70% utilizzando la pistola per colla ad acqua</td></tr><tr><td>"Ad tech Hi Temp Progetto Pro"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Colla modello 1105</td><td></td></tr><tr><td>"Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>Cellule MDCK</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Globuli rossi di tacchino in pool lavati, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus propagazione in embrionate di pollo uova

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Infezione influenzale è associata con circa 36.000 morti e più di 200.000 ricoveri ogni anno negli Stati Uniti. L&#39;emergere continuo di nuovi ceppi di virus influenzale dovute alla mutazione e ri-assortimento complica il controllo del virus e richiede lo sviluppo permanente di nuovi farmaci e vaccini. Lo studio in laboratorio di influenza richiede un metodo affidabile e conveniente per la propagazione del virus. Qui, un protocollo globale è costituita per influenza A propagazione dei virus in uova di gallina fertili, che produce costantemente le scorte virali ad alto titolo. In breve, esenti da organismi patogeni (SPF) uova di gallina fecondate siero sono incubate a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10 - 11 giorni. In questo periodo, lo sviluppo dell&#39;embrione può essere facilmente monitorato mediante un Candler uovo. Virus inoculazione viene effettuata mediante iniezione del virus magazzino nella cavità allantoidea utilizzando un ago. Dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C, le uova sonorefrigerata per almeno 4 ore a 4 ° C. Il guscio d&#39;uovo sopra la sacca d&#39;aria e la membrana corioallantoidea sono poi accuratamente aperto, e il liquido allantoico contenente il virus è raccolto. Il fluido viene cancellato da detriti mediante centrifugazione, aliquotato e trasferito a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. La grande quantità (5-10 ml di virus contenenti liquido per uovo) titolo e precisa di virus che di solito si ottiene con questo protocollo ha reso l&#39;utilizzo di uova per la preparazione virus nostro metodo favorevole, in particolare per gli studi in vitro, che richiedono grandi quantità del virus in cui sono necessari dosaggi elevati di virus stesso magazzino.

Più metodi sono stati sviluppati per titolo virale influenzale. Una considerazione quando si sceglie un metodo appropriato è che alcuni determinano particelle totali, indipendentemente della redditività (ad esempio, test emoagglutinina), mentre altri si basano su infettività, che valuterà virioni vitali (ad esempio, test placca) 6. Qui, il titolo virale di liquido allantoico raccolti da uova di pollo inoculate con un virus influenzale mouse adattato (A / PR / 8/34) è stata determinata median...

Le uova di gallina fertili sono ampiamente utilizzate per produrre grandi quantità di virus dell'influenza A umana in quanto forniscono un sistema conveniente ed economico per dimostrare alti rendimenti di virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre grandi quantità di un virus influenzale ad alto titolo in un sistema economicamente vantaggioso. Ciò si ottiene innanzitutto ottenendo uova di gallina fresche e fertilizzate, libere da agenti patogeni sierici. Nel secondo passaggio, le uova vengono infettate con il virus influenzale tramite la radice allantoinica.Per 48 ore, il liquido Alan Toic, che contiene il virus, viene quindi raccolto e il virus viene congelato rapidamente in azoto liquido. Infine, possono essere eseguiti saggi di placche e di emagglutinina per determinare l'influenza del titolo virale del liquido Alan Toic raccolto. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di raccolta sono molto delicate e richiedono una manipolazione accurata delle uova e una buona conoscenza della loro anatomia.Prima di iniziare la procedura, procurarsi uova di quaglia fecondate e libere da agenti patogeni da un fornitore adeguato. Immediatamente dopo l'arrivo, posizionare le uova in un'incubatrice per uova umidificata dotata di girauova automatico, in modo da ruotare regolarmente le uova a 37 gradi Celsius e al 55-60% di umidità per 10-11 giorni. Dopo sette-otto giorni di incubazione, indossando guanti disinfettati con etanolo al 70%.Pulire un candeloscopio per uova con etanolo e trasferire le uova dall'incubatrice nei portauova vuoti. Spegnere quindi le luci e tenere l'estremità più grande delle uova, una alla volta, contro il candeloscopio. Se un uovo è fecondato, dovrebbero essere chiaramente visibili sottili vasi sanguigni che conducono a un embrione di forma simile a un fagiolo.Se l'uovo non è fecondato, si osserverà una piccola macchia di sangue con un tuorlo visibile. Scartare quindi gli uova non fecondati e reinserire quelli vitali nell'incubatrice. Se lo stato di un uovo non può essere confermato, contrassegnarlo per un'osservazione successiva al giorno 10 o 11 dopo la fecondazione e immediatamente prima dell'uso, diluire un ceppo del virus dell'influenza A a uno per dieci alla terza fino a dieci alla quarta PFU per millilitro in PBS sterile integrato con hippies e porre in ghiaccio.Quindi candela nuovamente ogni uovo ed elimina tutti gli embrioni morti e immobili. Successivamente, rimuovi tre uova dall'incubatrice e disponile in un portauova separato. Con le camere d'aria rivolte verso l'alto, segna la camera d'aria delle uova con un pennarello indelebile.Quindi lavare la zona sopra lo spazio d'aria con etanolo al 70% e trasferire le uova con lo spazio aereo rivolto verso l'alto in un portauova all'interno di una cappa di sicurezza biologica di livello BSL-2. Ora utilizzare un ago sterile da 18 gauge per praticare un piccolo foro nel guscio sopra la camera d'aria di ciascun uovo, avendo cura di non inserire troppo profondamente l'ago per evitare di ferire l'embrione o il tuorlo.Quindi aspirare il virus dell'influenza diluito in una siringa sterile da un millilitro. Applicare un ago da 22 gauge e inserire con attenzione l'ago a un angolo di 45 gradi nella cavità allantoidea del primo uovo. Iniettare 0,2 millilitri del virus diluito nell'uovo; dopo aver iniettato anche negli altri due uova, smaltire la siringa e l'ago e sigillare ciascun foro con una goccia di colla proveniente da una pistola per colla.Assicurarsi che la colla non fuoriesca all'interno dell'uovo, quindi riposizionare le uova nell'incubatrice. Dopo aver inoculato tutte le uova, incubare le uova infette a 37 gradi Celsius e umidità al 60% senza ruotarle, per il tempo di incubazione ottimale, a seconda del tipo di virus influenzale.Al termine del periodo di incubazione, raffreddare le uova per un minimo di quattro ore a quattro gradi Celsius per uccidere l'embrione e restringere i vasi sanguigni. Una volta che le uova sono state sufficientemente raffreddate, trasferirle in una cappa a sicurezza biologica e in un supporto stabile, quindi pulire le superfici delle uova con etanolo al 70%.Quindi utilizzare forbici sterili per aprire il guscio dell'uovo sopra la camera d'aria del primo uovo. Rimuovere il guscio intorno alla camera d'aria, facendo attenzione a non danneggiare la membrana corioallantoidica.Quindi, utilizzare pinze sterili senza punta per aprire la membrana corioallantoidea e spostare delicatamente l'embrione e il sacco vitellino con una piccola spatola o cucchiaio, avendo cura di non rompere il tuorlo. Successivamente, utilizzando una pipetta di un millilitro, raccogliere con attenzione il liquido allantoideo, inclinando l'uovo lateralmente per raccogliere tanta quantità di liquido quanto necessario. Ogni uovo dovrebbe fornire da cinque a dieci millilitri di un fluido leggermente giallastro per ogni uovo raccolto.Raccogliere il liquido allantoideo in provette coniche di plastica da 50 millilitri su ghiaccio. Una volta raccolto tutto il liquido, centrifugare il virus e trasferire il liquido limpido in una nuova provetta da 50 millilitri su ghiaccio. Infine, smaltire le uova in un contenitore per rifiuti di livello di sicurezza biologica 2 e procedere immediatamente all’elucodazione del liquido allantoideo chiarificato.Quindi, congeli rapidamente il virus in azoto liquido e colloca gli steli congelati in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per la conservazione a lungo termine, l'infezione da virus dell'influenza provoca un effetto citopatico che determina la formazione di zone circolari di cellule lacunose o placche su un monostrato cellulare. In questo esperimento, le placche sono state rese visibili colorando le cellule con violetto di cristallo e sono state contate 65 placche nel pozzetto con il diluizione di virus pari a uno per 10 alla meno 12, poiché 500 microlitri di ceppo virale diluito sono stati coltivati sulle cellule.In questo esperimento, il titolo finale era di 1,3 volte 10 alla 14 PFU per millilitro. Il saggio di emagglutinazione è un metodo per la titolazione del virus dell'influenza basato sulla capacità del virus di legarsi alla superficie dei globuli rossi. Come osservato, la sospensione virale agglutina i globuli rossi, impedendo loro di sedimentare fuori dalla sospensione.È stato osservato un risultato chiaramente negativo con una diluizione di due alla meno decima del virus in 50 microlitri. Pertanto, il titolo finale è di 2,1 × 10⁴ UHA per millilitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come propagare il virus dell'influenza inoculando uova di pollo e raccogliendo il liquido allantoidico contenente il virus.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

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Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Questo video mostra una tecnica per generare varianti di fuga di anticorpi monoclonali neutralizzanti del virus dell'influenza. La sospensione virale neutralizzata con anticorpi viene iniettata nelle uova di gallina embrionate per propagare selettivamente le varianti di fuga. Ciò si traduce in una popolazione virale prevalentemente di varianti di fuga, confermata tramite un test di emoagglutinazione.

Generazione di varianti di fuga dal virus dell'influenza contro gli anticorpi neutralizzanti

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Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

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L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.

In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente &gt; 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Questo metodo presenta l'embrione di pollo come un modello in vivo semplice ed economico per far rivivere il patogeno batterico L. monocytogenes da uno stato vitale ma non coltivabile (VBNC) e con potenziali ulteriori usi nella comprensione dei meccanismi di dormienza batterica.

L'embrione di pollo come modello in vivo per rianimare patogeni vitali ma non coltivabili

Impara a propagare il virus influenzale A in uova di pollo fecondate per ottenere titoli elevati. Questo metodo economico supporta la ricerca virologica e lo sviluppo di vaccini con successo garantito.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

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