Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

L'obiettivo generale di questa procedura è costruire un equivalente cutaneo tridimensionale a spessore completo, che riproduca la pelle naturale, e generare ferite precise e riproducibili in condizioni sterili mediante un dispositivo automatizzato per la creazione di ferite. Ciò viene ottenuto innanzitutto incorporando fibroblasti dermici umani primari in un idrogel di collagene di tipo I. Successivamente, cheratinociti epidermici umani primari vengono seminati sulla superficie dell'idrogel rivestito con fibronectina.

Successivamente, il modello viene coltivato in condizioni di immersione e poi all'interfaccia aria-liquido, formando un equivalente tridimensionale della cute a spessore completo, composto da un componente dermico e da un epidermide multistrato. Infine, viene generata una ferita standardizzata in un ambiente sterile. Alla fine, la colorazione immunoistochimica e la microscopia vengono utilizzate per valutare la struttura istologica dell'equivalente cutaneo a spessore completo ferito.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come ad esempio i modelli animali, è che l'equivalente di pelle a spessore completo è composto da cellule umane primarie. Pertanto, insieme al dispositivo automatizzato per la creazione di ferite, possiamo generare ferite standardizzate. In questo modo, il dispositivo automatizzato per ferite può fornire informazioni sui processi di guarigione delle ferite cutanee in un ambiente umanizzato. Può inoltre essere applicato anche ad altri nostri sistemi, come l'ingegneria dei tessuti ossei.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla guarigione delle ferite, come i processi biologici, la riparazione cutanea sottostante e il dialogo cellulare tra i componenti epidermici e dermici. Per iniziare, sciogliere il collagene con acido acetico allo 0,1% fino a una concentrazione finale di sei milligrammi per millilitro. Preparare la soluzione di neutralizzazione del gel mescolando 232,5 millilitri di DMM 2X, 7,5 millilitri di FCS, 7,5 millilitri di HEPES 3 M e 2,5 millilitri di soluzione di cinque milligrammi per millilitro.

Inserire inserti di solfato di condroitina nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti per staccare i fibroblasti dermici umani o HDFS e centrifugare le sospensioni cellulari per cinque minuti a 270 G. Contare le cellule e centrifugare un'eliquota di 1.200.000 HDF per cinque minuti a 270 G. Rimuovere il soprannatante e utilizzare quattro millilitri di soluzione di neutralizzazione del gel fredda per risospendere con attenzione gli HDF senza formare bolle d'aria.

Quindi risospendere la soluzione con otto millilitri di soluzione di collagene. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale e aggiungere 500 microlitri di miscela cellulare di collagene in ciascun inserto. Incubare i gel nella piastra a 24 pozzetti per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire ai gel di solidificare.

Quindi utilizzare due millilitri di DMM più 10% di FCS per pozzetto. Per immergere i gel, incubare i gel per 24 ore. Utilizzare acqua ultrapura per sciogliere la proteina fibronectina umana fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.

Dopo aver incubato i gel equivalenti al derma per 24 ore, rimuovere il mezzo. Utilizzare 25 microlitri di soluzione di fibronectina per ricoprire ciascun equivalente dermico e incubare i gel per 30 minuti. Nel frattempo, risospendere i cheratinociti epidermici umani o gli HKS con kgm due più 5% FCS fino a una concentrazione finale di un milione di cellule per litro e seminare 100.000 cellule su ciascun gel.

Quindi incubare i gel per 45 minuti per consentire l'adesione delle cellule utilizzando KGM Two Ready Plus con FCS al 5%, immergendo le cellule e proseguendo l'incubazione. Dopo aver incubato per due o tre giorni, sostituire il mezzo con FCS al 2%, quindi sostituire nuovamente il mezzo senza FCS, due o tre giorni dopo. Al settimo giorno, rimuovere completamente il mezzo.

Utilizzare pinze sterili per posizionare ciascun inserto in una pozzetta di una piastra a sei pozzette. Aggiungere quindi 1,5 millilitri di mezzo di airlift per ogni pozzetta. Avere cura di non bagnare la superficie del FTSC.

Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni per ulteriori 14 giorni. Preparare il dispositivo automatizzato per la ferita disinfettando l'area di lavoro con etanolo al 70% e luce ultravioletta, utilizzando pinze sterili. Posizionare gli equivalenti di pelle nelle aree designate della piastra portacampioni per autoclave.

Posizionare una piastra portacampioni nella sede al di sotto della testa di perforazione. Utilizzare il software di controllo per impostare i parametri di lesione come segue: velocità di rotazione 15.000 giri/min, penetrazione di 1,5 millimetri.

Propulsione 100 hertz. Trasferire i parametri di lesione al dispositivo automatizzato di lesione. Iniziare la procedura di lesione al termine.

Rimuovere la piastra portacampioni dalla presa ed utilizzare pinze sterili per trasferire il FTSE ferito nuovamente nell'inserzione utilizzata per la coltura. Incubare il FTSE ferito fino alla valutazione sperimentale. Utilizzare i modelli per la sua analisi istologica in qualunque momento.

I HDFS e HKS isolati sono stati caratterizzati mediante colorazione immunoistochimica prima di essere utilizzati per la FTSE. Gli HDF sono positivi per la mentonina, un marcatore dei fibroblasti; gli HEK primari esprimono in modo elevato la proteina della differenziazione precoce CITOCHERATINA 14, ma quasi nessuna proteina della differenziazione tardiva dei cheratinociti CITOCHERATINA 10. Le FTSE sono state coltivate per sette giorni in condizioni di mezzo sommerso, seguite da 14 giorni all'interfaccia aria-liquido.

Durante questo processo, il FTSC si contrae notevolmente entro 21 giorni. Le cellule HEK proliferano modificando il livello del mezzo in modo tale che la superficie dei modelli sia esposta all'aria. Aumentando la concentrazione di calcio, le cellule HKS vengono stimolate a differenziarsi in un epidermide multiculturale composta da diversi strati vitali di cheratinociti.

In diversi stati di differenziazione di D e dell'atrio cornea. Confrontando la colorazione ematossilina ed eosina del FTSE con quella della pelle umana nativa, risulta evidente che il FTSE riproduce l'architettura istologica della pelle. I HDF nel gel idrogel di collagene possono essere colorati con anticorpi primari contro la vimentina.

Inoltre, i cheratinociti formano uno strato epidermico composto da cellule positive per la citocheratina 14 e per il marcatore della differenziazione tardiva. La CITOCHERATINA 10 viene espressa negli strati sovra-basali. Inoltre, lo strato corneo è positivo per RIN dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della dermatologia per esplorare la guarigione delle ferite cutanee e un allestimento standardizzato in vitro che riproduce da vicino la pelle umana.