Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un equivalente cutaneo tridimensionale a tutto spessore, che assomigli alla pelle naturale e di generare ferite precise e riproducibili in condizioni sterili utilizzando un dispositivo di ferita automatizzato. Ciò si ottiene incorporando prima i fibroblasti dermici umani primari in un idrogel di collagene. Successivamente, i cheratinociti epidermici umani primari sono posizionati sulla parte superiore dell'idrogel rivestito di fibronectina.

Quindi il modello viene coltivato in condizioni sommerse e quindi sotto un'interfaccia aria-liquido, si forma un equivalente cutaneo tridimensionale a tutto spessore, composto da una componente dermica e da un'epidermide multistrato. Infine, una ferita standardizzata viene generata in un ambiente sterile. Infine, la colorazione immunoistochimica e la microscopia vengono utilizzate per valutare la struttura istologica dell'equivalente cutaneo a tutto spessore ferito.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli animali, ad esempio, è che l'equivalente cutaneo a tutto spessore è composto da cellule umane primarie. Quindi, insieme al dispositivo di ferita automatizzato, possiamo generare ferite standardizzate, quindi il dispositivo di ferita automatizzato può fornire informazioni sui processi di guarigione delle ferite cutanee in un ambiente umanizzato. Può essere applicato anche ai nostri sistemi come l'ingegneria del tessuto osseo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla guarigione delle ferite, come i processi biologici, la riparazione della pelle sottostante e il crosstalk cellulare tra la componente epidermica e quella dermica. Per iniziare, sciogliere il collagene con lo 0,1% di acido acetico fino a una concentrazione finale di sei milligrammi per millilitro. Preparare la soluzione di neutralizzazione del gel mescolando 232,5 millilitri di due X dmm, 7,5 millilitri di FCS, 7,5, millilitri di tre molari e 2,5 millilitri di cinque milligrammi per millilitro.

Il solfato di condroitina, posizionare gli inserti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, staccare i fibroblasti dermici umani o HDFS e centrifugare le sospensioni cellulari per cinque minuti. A 270 g, contare le cellule e centrifugare un Eloqua da 1.200.000 HDF per cinque minuti. A 270 g, rimuovere il laccio e utilizzare quattro millilitri di soluzione di neutralizzazione del gel raffreddata per risospendere accuratamente l'HDF senza causare bolle d'aria.

Quindi risospendere la soluzione con otto millilitri di soluzione di collagene. Successivamente, utilizzare una pipetta multifase e aggiungere 500 microlitri di miscela di cellule di collagene a ciascun inserto. Nella piastra a 24 pozzetti, incubare i gel per 20 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire ai gel di solidificarsi.

Quindi utilizzare due millilitri di DMM più il 10% di FCS per pozzetto. Per immergere i gel, incubare i gel per 24 ore. Utilizzare acqua ultrapura per sciogliere la proteina fibronectina umana a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.

Dopo aver incubato i gel dermici equivalenti per 24 ore, rimuovere il terreno. Utilizzare 25 microlitri di soluzione di fibronectina per coprire ogni equivalente dermico e incubare i gel per 30 minuti. Nel frattempo, risospendere l'epidermide umano, i cheratinociti o HKS con kgm due più 5% di FCS a una concentrazione finale di 1 milione di cellule per litro di seme, 100.000 guance sopra ogni gel.

Quindi incubare i gel per 45 minuti per consentire alle cellule di aderire utilizzando kgm due pronti più il 5% di FCS immerso le cellule e continuare l'incubazione. Dopo l'incubazione per due o tre giorni, sostituire il terreno con FCS al 2% seguito da una sostituzione del terreno senza FCS, due o tre giorni dopo. Settimo giorno, rimuovere completamente il mezzo.

Utilizzare una pinza sterile per posizionare ciascun inserto in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di terreno di trasporto aereo per pozzetto. Facendo attenzione a non bagnare la superficie dell'FTSC.

Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni per altri 14 giorni. Preparare il dispositivo di avvolgimento automatizzato utilizzando etanolo al 70% e luce ultravioletta per disinfettare l'area di lavoro utilizzando una pinza sterile. Posizionare gli equivalenti cutanei nelle aree designate della piastra portacampioni dell'autoclave.

Posizionare una piastra di supporto del campione nella presa sotto la testa di perforazione. Utilizzare il software di controllo per impostare i parametri di avvolgimento come segue. Velocità di rotazione 15, 000 giri/min di penetrazione, 1,5 millimetri.

Propulsione 100 hertz. Trasferire i parametri di avvolgimento al dispositivo di avvolgimento automatizzato. Al termine, iniziare la procedura di ferita.

Rimuovere la piastra di supporto del campione dall'alveolo e utilizzare una pinza sterile per trasferire nuovamente il FTSE ferito nell'inserto utilizzato per la coltura. Incubare il FTSE ferito fino alla valutazione sperimentale. Utilizzare i modelli per la sua analisi istologica in qualsiasi momento.

L'HDFS e l'HKS isolati sono stati caratterizzati mediante colorazione immunoistochimica prima di utilizzarli per FTSE. Gli HDF sono positivi per mentone, un marcatore per i fibroblasti HEK primario esprimono altamente la proteina di differenziazione precoce CITOCHERATINA 14, ma quasi nessuna proteina di differenziazione tardiva dei cheratinociti CITOCHERATINA 10. I FTSE sono stati coltivati per sette giorni in condizioni di mezzo sommerso, seguiti da 14 giorni all'interfaccia aria-liquido.

Durante questo processo, la FTSC stipula contratti in modo significativo entro 21 giorni. Gli HEK proliferano modificando il livello del mezzo in modo tale che la superficie dei modelli sia esposta all'aria. E aumentando la concentrazione di calcio, gli HKS sono stimolati a differenziarsi in un'epidermide multicellulare composta da diversi strati cellulari vitali di cheratinociti.

In diversi stati di differenziazione D e cornea atriale. Confrontando la colorazione con ematina ed eosina di FTSE con la pelle umana nativa, diventa ovvio che FTSE imita l'architettura istologica della pelle. L'HDF nell'idrogel di collagene può essere colorato con anticorpi primari contro la vimentina.

Inoltre, i cheratinociti formano uno strato epidermico composto da cellule positive alla citocheratina 14 e dal marcatore di differenziazione tardiva. La CITOCHERATINA 10 è espressa negli strati super basali. Inoltre, il St.Stratum cornium è positivo per RIN dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della dermatologia per esplorare la guarigione delle ferite cutanee e una configurazione standardizzata in vitro che imita da vicino la pelle umana.