Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dimostrare un semplice protocollo per isolare neutrofili, trappole extracellulari o reti dal sangue intero umano utilizzando reagenti prontamente disponibili. Ciò si ottiene isolando prima i neutrofili dal sangue intero umano, utilizzando una tecnica di centrifugazione differenziale come seconda fase. I neutrofili isolati vengono stimolati con PMA per indurre la formazione di rete, chiamata anche NETosi.

Successivamente, viene preparata una piastra con un isolato di rete privo di cellule e vengono aggiunte cellule tumorali per dimostrare come le reti influenzano l'adesione delle cellule. I risultati mostrano che l'aggiunta di un monostrato di rete migliora l'adesione di 5 49 cellule tumorali e che questa adesione si riduce quando le reti vengono degradate. Utilizzando DNAS one La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Data la novità di questa tecnica, la gestione delle trappole neutrofile xor cellulari è estremamente difficile a causa della fragilità di queste strutture. Per iniziare, procurati 80 millilitri di sangue intero umano fresco in 14 provette verdi eparinizzate come descritto nel protocollo di testo. Apri ogni provetta e aggiungi cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio in ogni provetta.

Quindi, aggiungere 15 millilitri di terreno di separazione linfocitaria o LSM in ciascuna delle quattro provette coniche da 50 millilitri a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un ago calibro 18 montato su una siringa da 60 millilitri per stratificare accuratamente il sangue diluito sull'LSM, creando un'interfaccia sangue LSM affilata, centrifugare le provette a 800 volte G per 30 minuti a 21 gradi Celsius senza rompersi per fermare la centrifuga, aspirare con cura e scartare i due strati liquidi superiori e l'interfaccia tra di loro, lasciando solo lo strato rosso inferiore. Questo pellet contiene eritrociti e neutrofili.

Aggiungere 20 millilitri di PBS e 20 millilitri di soluzione di destrano al 6% in ogni provetta. Capovolgere delicatamente ogni tubo e lasciarli riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. I globuli rossi sedimenteranno sul fondo della provetta.

Quindi, trasferire i surnatanti in tubi freschi e scartare i pallet. Centrifugare i surnatanti a 450 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il surnatante, lasciando il pellet ricco di neutrofili. Preparare una soluzione di lisi con 0,5 millilitri di tampone di lisi in 4,5 millilitri di acqua sterile.

Aggiungere un totale di cinque millilitri di soluzione lisalante a ciascun tubo e riunire tutti i pellet in un unico pallone. Mettere il pallone al buio per 10 minuti a temperatura ambiente per eliminare i pidocchi dei globuli rossi rimasti. Centrifugare i neutrofili a 450 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il surnatante e lavare il pellet con cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio. Quindi centrifugare nuovamente il campione a 450 volte G a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante contenente la soluzione di lisi rimanente. Risospendere il pellet di neutrofili in 30 millilitri di terreno RPMI freddo integrato con siero bovino fetale al 3% e mettere il tubo su ghiaccio per stimolare la formazione di trappole o reti extracellulari di neutrofili.

Aggiungere 500 nanomolari di PMA a 30 litri di sospensione neutrofila in una piastra di coltura tissutale piatta di 150 mm per 25 millimetri. Con una griglia di 20 millimetri, incubare le cellule per quattro ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, aspirare delicatamente e scartare il terreno, facendo attenzione a non rompere lo strato di reti e neutrofili che aderiscono al fondo della capsula.

Quindi utilizzare una pipetta per lavare il fondo di ogni piatto con 15 millilitri di PBS freddo senza calcio e magnesio, tutto il materiale aderente deve essere rimosso dal fondo. Raccogliere la sospensione di lavaggio in una provetta conica da 15 millilitri e quindi centrifugare a 450 volte G per 10 minuti. A quattro gradi Celsius i neutrofili e le cellule rimanenti si riempiono sul fondo.

Lasciando un surnatante ricco di cellule libere e nette, decantare il surnatante in più provette da 1,5 millilitri e centrifugare a otto volte 18.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per pellettare il DNA, scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS in modo tale che la concentrazione corrisponda a due volte 10 al settimo neutrofilo per 100 microlitri di PBS. Questo stock di rete privo di cellule può essere utilizzato per esperimenti successivi.

Misurare la concentrazione di DNA del campione utilizzando la spettrofotometria. Una concentrazione adeguata dovrebbe variare tra 140 e 180 nanogrammi per microlitro a 100 microlitri di stock netto in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e incubare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius al buio per rivestire i pozzetti da 12 a 20 ore dopo, utilizzare un microscopio per verificare la formazione di un monostrato uniforme di reti prive di cellule sul fondo dei pozzetti. Una volta verificato il monostrato, aspirare delicatamente tutto il materiale non aderente fuori dai pozzetti.

Facendo attenzione a non interrompere il monostrato nella parte inferiore. Questo è l'aspetto più impegnativo di questa procedura. Per mantenere un adeguato monostrato di rete, è necessario maneggiare la lastra con molta attenzione.

Aggiungere lentamente tutti i reagenti e le cellule sul lato dei pozzetti, aspirare molto delicatamente ed evitare di toccare il fondo del pozzetto con una punta di aspirazione. Con il materiale non aderente rimosso, aggiungere delicatamente 100 microlitri di una soluzione bloccante dell'albumina sierica bovina all'1% in ciascun pozzetto e lasciare agire per un'ora a temperatura ambiente. Non agitare o scuotere la piastra in quanto ciò potrebbe interrompere lo strato mono della rete.

Successivamente, preparare 5 49 cellule tumorali raccogliendole quando sono confluenti al 70-80%. Utilizzando tecniche standard, risospendere le cellule in terreno a una concentrazione di due volte 10 per la quarta cellula per 100 microlitri. Colorare le cellule aggiungendo un microlitro di CFS e per millilitro di terreno e lasciarle a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi, centrifugare le celle a 450 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel volume iniziale del terreno per mantenere una concentrazione di due volte 10 al quarto tumore per 100 microlitri di terreno. Prendere la piastra rivestita in rete e aspirare delicatamente la soluzione bloccante.

Quindi aggiungere 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali a ciascun pozzetto e lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per 90 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, aspirare completamente il liquido e aggiungere 1000 unità di DNA, una ad alcuni pozzetti per 10 minuti per degradare le reti in altri pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di acqua sterile per pozzetto per 10 minuti come controllo del veicolo. Successivamente, aspirare delicatamente il liquido da ogni pozzetto e lavare con 100 microlitri di PBS per rimuovere eventuali non aderenti.

A 5 49 cellule aspirano e scartano tutta la soluzione nei pozzetti, lasciando sul fondo solo le reti e le cellule tumorali aderenti. Quindi aggiungere 100 microlitri di una soluzione di formaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule, trasferire immediatamente la piastra su un microscopio a fluorescenza per leggere il test e quindi tracciare e analizzare i risultati. Utilizzando il software di analisi dei dati.

Le reti prive di cellule sono state utilizzate in saggi di adesione statica con 5 49 cellule tumorali. La microscopia ottica ha mostrato che le cellule tumorali aderiscono fortemente al monostrato netto. In vitro.

Questa adesione è diminuita dopo che il monostrato netto è stato degradato dal DNA, una microscopia a fluorescenza di 5 49 cellule tumorali ha confermato questi risultati. Il legame di 5-49 celle al monostrato netto è stato quantificato contando il numero di cellule per campo ad alta potenza. Come mostrato qui, non c'è stato alcun cambiamento nell'adesione delle cellule tumorali alle reti nel controllo del veicolo.

Tuttavia, c'è stata una significativa diminuzione dell'adesione delle cellule tumorali alle reti in presenza di DNA uno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come isolare e maneggiare le zanzariere dal sangue umano intero. Questi isolati netti privi di cellule possono quindi essere utilizzati in una varietà di tecniche, tra cui l'immunofluorescenza, la microscopia confocale, la microscopia elettronica e il western blotting.