Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale
October 19th, 2017
Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.
L'obiettivo generale di questo metodo è dimostrare come le trappole extracellulari dei macrofagi possano essere visualizzate e studiate utilizzando la microscopia confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione, come le risposte alle infezioni e ad altri stimoli immunitari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una modifica di un metodo ben consolidato che è stato utilizzato per studiare le trappole extracellulari dei neutrofili.
A dimostrare questa procedura sarà Roleen Sharma. Dopo aver ottenuto macrofagi polmonari da esseri umani e topi mediante lavaggio broncoalveolare, o BAL, secondo il protocollo di testo, utilizzare il blu di tripano e un emocitometro per eseguire una conta cellulare vitale sulla soluzione BAL. Pipettare da uno a quattro macrofagi da 10 a 500 microlitri di terreno di coltura su vetrini coprioggetti nei pozzetti di piastre da 24 pozzetti, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte per far aderire le cellule.
Rimuovere il terreno di coltura e utilizzare il PBS per lavare le cellule una volta. Quindi aggiungere il 2% di paraformaldeide-periodato-lisina, o fissativo PLP, e incubare i campioni per 10 minuti. Dopo aver utilizzato il PBS per lavare brevemente le cellule, aggiungere lo 0,2% di TWEEN 20 in PBS e incubare le cellule per 20 minuti.
Successivamente, per bloccare le cellule, aggiungere il 10% di siero di pollo al 5% di BSA, diluito in PBS e incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi sostituire la soluzione in blocco con una concentrazione da uno a 100 di anticorpi primari e di controllo isotopico e incubare le cellule a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, utilizzare il PBS per lavare le cellule prima di aggiungere gli anticorpi secondari corrispondenti.
Quindi incubare i campioni per 40 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule in PBS, montare i campioni con un mezzo di montaggio a base DAPI, quindi visualizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale. Per pretrattare i campioni FFPE con una soluzione di recupero dell'antigene, asciugare i vetrini in forno a 60 gradi Celsius per 60 minuti.
Quindi trasferire i vetrini in una soluzione di xilene per 30 minuti prima di trasferire i campioni in etanolo al 70% a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver usato l'acqua del rubinetto per sciacquare i vetrini, metterli in un involucro di plastica resistente al calore e sottoporli a un recupero dell'antigene più elevato mettendoli in una pentola a pressione in Tris-EDTA pH 9.0 per 10 minuti. Raffreddare i campioni per 20 minuti e trasferirli in acqua corrente.
Quindi posizionarli su un bilanciere per cinque minuti. Ripetere il lavaggio con acqua del rubinetto e poi lavare le diapositive una volta in PBS sul bilanciere. Per bloccare i campioni, aggiungere il 10% di siero di pollo al 5% di BSA PBS e incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi, per definire le trappole extracellulari dei macrofagi, o MET nei macrofagi, aggiungere una diluizione da uno a 100 di anticorpi primari in PBS all'1% di BSA e incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per 16 ore. Utilizzare PBS per lavare i campioni due volte su un bilanciere per cinque minuti ciascuno. Aggiungere gli anticorpi secondari fluorescenti corrispondenti in PBS BSA all'1% e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 40 minuti.
Dopo i lavaggi PBS, utilizzare il mezzo di montaggio contenente DAPI per colorare la cromatina e montare i campioni. Utilizzando una testa di scansione laser confocale collegata a un microscopio invertito, è possibile acquisire immagini fluorescenti utilizzando obiettivi 20X 0,1 NA in aria e 40X 1,0 NA in olio. Cattura immagini su un singolo piano da 512 x 512 pixel facendo clic sul pulsante di livellamento sequenziale lineare.
Ottieni almeno 10 campi visivi per sezione per l'analisi e i dati per ogni risultato. Per colorare le sezioni in provette da microcentrifuga, aggiungere gli anticorpi primari pertinenti in volumi da 200 microlitri e incubare i campioni a quattro gradi Celsius per 16 ore. Lavare le sezioni in PBS tre volte per 10 minuti prima di aggiungere gli anticorpi secondari appropriati e incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora.
Utilizzare DAPI per colorare le sezioni polmonari in soluzione e incubare i campioni per 20 minuti prima di aggiungere vetrini coprioggetti alle sezioni sui vetrini da microscopio in PBS. Utilizzare un microscopio confocale invertito con un obiettivo 40X 1,3 NA, dotato di laser da 405 nanometri, 440 nanometri, 473 nanometri, 543 nanometri e 635 nanometri, per acquisire immagini e registrare pile Z 3D, spesse 0,54 micron, con sezionamento Z ottimale. Infine, analizza le immagini secondo il protocollo di testo.
Di seguito è riportato un esempio di MET in un campione BAL. La prima caratteristica rilevabile è il movimento del nucleo verso il bordo della cellula, come si vede in questa fase precedente del MET che ha una forma approssimativamente sferica. Segue la cromatina extracellulare con altri mediatori co-espressi, come l'H3Cit e le proteasi granulari, come si vede in questo MET più maturo.
La fase precedente MET è in alto a sinistra e la fase successiva MET è al di sotto verso il centro. I MET del tessuto polmonare sono mostrati in questa figura. Quando i polmoni vengono gonfiati con il liquido per definire l'architettura polmonare, i MET verranno spinti contro le pareti alveolari.
La morfologia dei MET varierà anche a seconda del piano in cui è stato tagliato il tessuto. Le sezioni standard utilizzate per i campioni di tessuto polmonare hanno uno spessore da quattro a cinque micron. Le sezioni di tessuto più spesse consentono di scattare più immagini e di visualizzare i MET in 3D.
Di seguito viene presentato un esempio di immagine 3D di tessuto polmonare di topo tagliato in sezioni da 25 a 35 micron. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni di colorazione più imaging se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere delicati con i lavaggi.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la zimografia per rispondere a domande aggiuntive come l'espressione della proteasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada allo studio delle risposte infiammatorie dei macrofagi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare i MET utilizzando la microscopia confocale.
Non dimenticare che lavorare con PLP può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e proteggere gli occhi.
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Panoramica
Questo articolo si concentra sulla visualizzazione delle trappole extracellulari dei macrofagi utilizzando tecniche di microscopia confocale. Discute sia i metodi in vitro che in vivo applicati a campioni polmonari.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- Le trappole extracellulari dei macrofagi sono un'entità recentemente descritta.
- Comprendere il loro ruolo nell'infiammazione è cruciale per la ricerca sulla risposta immunitaria.
- La microscopia confocale è uno strumento potente per visualizzare queste strutture.
- Questo metodo si basa su tecniche consolidate utilizzate per le trappole extracellulari dei neutrofili.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare la visualizzazione delle trappole extracellulari dei macrofagi.
- Esplorare le risposte all'infezione e agli stimoli immunitari.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori nel campo.
Metodi utilizzati
- Isolamento di macrofagi polmonari da umani e topi tramite lavaggio broncoalveolare (BAL).
- Conteggio delle cellule vitali utilizzando blu di tripano e un ematocitometro.
- Coltura cellulare su vetrini in piastre da 24 pozzetti.
- Incubazione delle cellule a 37 gradi Celsius per l'adesione.
Risultati principali
- Vincitrice visualizzazione delle trappole extracellulari dei macrofagi.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo nello studio delle risposte immunitarie.
- Perfezionamento del protocollo per una maggiore chiarezza e riproducibilità.
- Contributo alla comprensione delle funzioni dei macrofagi nell'infiammazione.
Conclusioni
- Il metodo di microscopia confocale è efficace per studiare le trappole extracellulari dei macrofagi.
- Questa tecnica può far progredire la ricerca sull'infiammazione e sulle risposte immunitarie.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per esplorare ulteriori implicazioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
