Un metodo standardizzato per l'analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione
30 aprile 2015
La cellula endoteliale sinusoidale fenestrata del fegato è un sistema di filtraggio biologicamente importante che è altamente influenzato da varie malattie, tossine e stati fisiologici. Questi cambiamenti hanno un impatto significativo sulla funzionalità epatica. Descriviamo i metodi per la standardizzazione della misurazione delle dimensioni e del numero di fenestrazioni in queste celle.
L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'endotelio sinusoidale epatico. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto un fegato e perfundendolo con un fissativo. Successivamente, il fegato viene tagliato in blocchi e disidratato in preparazione per la microscopia elettronica.
Successivamente, i campioni di fegato vengono sputter-coated ed esaminati al microscopio elettronico. Infine, si analizzano le microfotografie elettroniche e si calcolano il diametro e la frequenza delle fenestrature e la percentuale di porosità. In definitiva, la microscopia elettronica viene utilizzata per evidenziare le modifiche dell'endotelio sinusoidale epatico in diverse condizioni.
Questo metodo ci fornisce informazioni sulla struttura ultrafine e sulla morfologia dei vasi sanguigni del fegato nel loro endotelio. Può essere utilizzato anche per esaminare in modo analogo il rene e il cervello. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali vengono eseguite in conformità alla legislazione locale. Questo lavoro è stato approvato dal Comitato per il Benessere degli Animali del Distretto Sanitario Locale di Sydney.
Le procedure consentite sono descritte nella documentazione della licenza del progetto e seguono linee guida che garantiscono il benessere dell'animale in ogni momento. Si tratta di un'intervento chirurgico non di sopravvivenza. Dopo aver preparato il fissativo, secondo il protocollo indicato nel testo, riscaldare il buffer di perfusione e il fissativo a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius.
Dopo aver anestetizzato l'animale con una singola iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina, valutare il livello di sedazione mediante il ritiro dell'arto posteriore e una pinzatura della coda. Successivamente, con forbici a punta arrotondata, praticare un'incisione a forma di Y sull'addome dell'animale per esporre il fegato e la vena porta. Quindi posizionare due legature molto lente intorno alla vena porta, una prossimale rispetto al fegato e l'altra più distale rispetto al fegato.
Cannulare la vena porta con un'apposita cannula endovenosa. Quindi stringere i punti per fissare la cannula. A questo punto, utilizzando da cinque a 20 millilitri di PBS riscaldato a 37 gradi Celsius, iniziare la perfusione a una pressione di 10 centimetri di H2O.
Evitare che bolle d'aria entrino nel fegato, poiché potrebbero generare artefatti e una pressione eccessiva che danneggerebbe il fegato; recidere la vena cava addominale e toracica (CVA) per consentire al tampone di uscire liberamente dal fegato. Questo previene un'elevata pressione retrograda, danni al fegato, alle cellule sinusoidali ed endoteliali o alle LCC. Una volta che il fegato è privo di sangue, sostituire il PBS con un fissativo per microscopia elettronica (em) e procedere alla perfusione fino a quando il fegato non risulta indurito e molto pallido.
Circa cinque minuti. Quindi, con il bisturi, tagliare il fegato in blocchi di uno-due millimetri cubi. Utilizzare fissativo EM per la post-fissazione.
Fissare il tessuto a quattro gradi Celsius per 24-72 ore. Successivamente, trasferire il tessuto in tampone al catecolato di sodio 0,1 M e conservare a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di 12 mesi prima del montaggio dei campioni per la microscopia elettronica a scansione o SEM. Dopo aver disidratato i campioni secondo il protocollo descritto nel testo, etichettare la base dei supporti metallici per SEM e applicare del nastro di carbonio bifacciale sulla parte superiore dei supporti sotto un microscopio stereoscopico, quindi visualizzare i campioni per identificare la superficie con i sinusoidi migliori per la SEM.
Posizionare il campione su un nastro di carbonio con la superficie scelta rivolta verso l'alto e fissarlo saldamente sul supporto. Dopo aver eseguito la metallizzazione a spruzzo e l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) secondo il protocollo descritto nel testo, aprire un'immagine in ImageJ e utilizzare una barra di scala presente nell'immagine per impostare l'ingrandimento. Tramite lo strumento poligono in ImageJ, tracciare attorno all'intera area piatta delle LSEC, inclusi i settori fenestrati e non fenestrati, escludendo eventuali grandi frammenti di detriti presenti sulla superficie cellulare che potrebbero oscurare le fenestrature. Per misurare il diametro delle fenestrature, tracciare una linea lungo il diametro maggiore di ciascuna fenestratura selezionando lo strumento linea.
Premere M per misurare la linea e D per disegnare definitivamente la linea sull'immagine. Questa linea è definita come diametro della fenestrazione e sarà ora disponibile nella casella dei risultati di Image J. Misurare tutti gli intervalli che corrispondono ai fori più grandi nel citoplasma delle LSEC superiori a 250 nanometri, oltre alle fenestrazioni. Calcolare l'area degli intervalli non circolari tracciandone il contorno e utilizzando Image J per calcolarne l'area; trasferire quindi i dati dalla casella dei risultati di Image J in un foglio di calcolo Excel.
Per ulteriori analisi, utilizzare le seguenti formule per eseguire i calcoli relativi alle fenestrature. Il diametro medio delle fenestrature corrisponde alla media di tutti i diametri delle fenestrature. L'area della fenestrazione è uguale a pi greco r quadro, dove R viene calcolato dai singoli diametri delle fenestrature.
La percentuale di porosità equivale a sigma pi greco R quadro diviso per l'area totale analizzata in micron, moltiplicato per 100; escludere dall'analisi la somma delle aree dei gap. Per presentare i dati nelle pubblicazioni, includere il diametro delle fenestrature con una dichiarazione che confermi l'uso dei diametri di confine per definire le fenestrature, la frequenza delle fenestrature e la porosità; includere inoltre una dichiarazione che specifichi se i gap sono stati inclusi nell'analisi, un grafico della distribuzione di frequenza del diametro delle fenestrature, il numero di blocchi di fegato e le immagini. A bassa magnificazione, la microscopia elettronica a scansione (SEM) rivela una superficie piatta del campione epatico con un'area esposta sufficientemente ampia da permettere l'osservazione di numerosi vasi epatici e sinusoidi di grandi dimensioni, compreso il dotto portale e il centro ES, come mostrato qui.
Assicurarsi un corretto posizionamento del blocco di fegato sulla staffa di montaggio è essenziale per ottenere immagini chiare dei senoidi e della capsula glistens, che copre tutti i dettagli dei senoidi del fegato, deve essere evitata. Per questo motivo, come mostrato qui, un ingrandimento maggiore permette l'osservazione delle fenestrature delle LSEC. Le lamine di epatociti possono apparire simili a vasi sanguigni, ma caratteristiche come il BLI aiutano nell'orientamento.
Questa figura dimostra che un'elevata pressione di perfusione può causare artefatti come ampie lacune nell'endotelio, ritenute causate dalla coalescenza delle placche SIV delle LSEC, facilmente identificabili mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), evitando la membrana cellulare direttamente sopra i nuclei, che può apparire come una protuberanza sotto la superficie delle LSEC, migliorando l'accuratezza dei calcoli della densità e della porosità delle fenestrazioni. Infine, la quantificazione del diametro, della densità e della frequenza delle fenestrazioni delle LSEC fornisce una misura empirica delle fenestrazioni e consente di valutare le modifiche indotte dall'invecchiamento, da malattie, tossine o terapie. Dopo la procedura di perfusione, il tessuto può essere processato per altre tecniche, come la microscopia elettronica a trasmissione, per osservare l'ultrastruttura cellulare e la struttura mitocondriale.
È inoltre possibile utilizzarlo per l'istologia.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo standardizzato per l'analisi della morfologia delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Il metodo consente una misurazione accurata della dimensione, frequenza e porosità delle fenestrature, parametri fondamentali per comprendere in che modo fattori fisiologici, patologici e farmacologici influenzano la funzione epatica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia del fegato
- Morfologia cellulare
- Microscopia elettronica
Sfondo
- Le LSEC possiedono fenestrature transcellulari che facilitano il trasferimento di sostanze dal sangue al parenchima epatico.
- Le fenestrature sono dinamiche e possono variare in dimensione e numero in risposta a malattie, farmaci o stati fisiologici.
- Una quantificazione accurata delle fenestrature è essenziale per lo studio della funzione epatica e della patologia.
- Sono necessari protocolli standardizzati di imaging e analisi per garantire riproducibilità e confrontabilità tra diversi studi.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo riproducibile per la fissazione, l'elaborazione e l'analisi al SEM dei LSEC.
- Permettere la misurazione accurata del diametro, della frequenza e della porosità delle fenestrature.
- Favorire lo studio dei cambiamenti morfologici dei LSEC in diverse condizioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Fissazione per perfusione del fegato mediante tamponi e fissativi riscaldati.
- Dissezione e sezionamento del tessuto epatico in piccoli blocchi.
- Disidratazione, montaggio e rivestimento con sputtering dei campioni per microscopia elettronica a scansione (SEM).
- Acquisizione di immagini SEM a diverse ingrandimenti per visualizzare le fenestrature dei LSEC.
- Analisi quantitativa delle immagini mediante ImageJ per misurare il diametro delle fenestrature, la frequenza e la porosità percentuale.
Risultati principali
- La MEA consente una chiara visualizzazione delle fenestrature dei CELS e delle strutture sinusoidali epatiche.
- Una corretta pressione di perfusione e un accurato trattamento del tessuto sono fondamentali per evitare artefatti come lacune artificiali.
- L'analisi quantitativa fornisce dati sperimentali sul diametro, densità e porosità delle fenestrature.
- Il protocollo permette di rilevare le modificazioni morfologiche dei CELS indotte dall'invecchiamento, malattie, tossine o terapie.
Conclusioni
- Questo protocollo standardizzato di microscopia elettronica a scansione fornisce misurazioni affidabili e riproducibili delle fenestrature dei LSEC.
- Un'analisi morfologica accurata supporta gli studi sulla funzione epatica e sulla patologia.
- Il metodo può essere adattato per l'analisi di altri organi come il rene e il cervello.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Una quantificazione accurata delle fenestrature delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per epatotossicità e malattie metaboliche. L'analisi standardizzata basata su MEB fornisce un'elevata affidabilità predittiva per la valutazione delle alterazioni endoteliali indotte da composti, sostenendo decisioni precoci di tipo go/no-go nei percorsi di scoperta. Questo metodo migliora la continuità traslazionale collegando fenotipi ultrastrutturali agli esiti funzionali del fegato in modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando il diametro, la frequenza e la porosità delle fenestrazioni come letture funzionali del fenotipo delle LSEC.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante una valutazione riproducibile dell'ultrastruttura dei meccanismi di permeabilità endoteliale.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi collegando la dinamica delle fenestrazioni a stati fisiologici rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo metriche di base per la fenestrazione.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso protocolli fissati di perfusione, fissazione e analisi delle immagini.
- Valore strategico: Evidenzia la prontezza allo screening mediante output quantitativi derivati da SEM, adatti a un fenotipaggio endoteliale ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Illustra la rilevanza clinica consentendo il rilevamento di alterazioni delle fenestrature in risposta a tossine, all'invecchiamento o a stati patologici.
- Valore operativo: Descrive un percorso continuo dallo stadio di scoperta alla validazione preclinica mediante un'analisi morfometrica coerente dei LSEC.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento ponderate rispetto al rischio fornendo dati empirici sull'integrità endoteliale in condizioni sperimentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posiziona il metodo all'interno del percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, in cui l'integrità endoteliale fornisce indicazioni per la valutazione di composti basata sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti il test delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico tramite la morfometria delle fenestrature.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative quando supportate dall'articolo.
- Analisi: Evidenzia misurazioni, letture o uscite statistiche che aiutano i gruppi a confrontare le condizioni tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento dei biomarcatori solo quando sostenuto dalla fonte.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella valutazione della funzione endoteliale.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro per il fenotipaggio delle LSEC.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci di avvio/cessazione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi mirati al fegato.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, basate su modifiche endoteliali quantificabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Esperienza scientifica richiesta nella preparazione dei campioni per microscopia elettronica e nell'analisi morfometrica.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi SEM, sputter coater e software per l'analisi delle immagini.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per le procedure di fissazione, disidratazione e acquisizione delle immagini tra diversi laboratori.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come l'endotelio renale e cerebrale, come indicato nella fonte.
- Limitazioni pratiche supportate dal materiale di riferimento, incluse l'evitare artefatti dovuti alla pressione di perfusione e un corretto orientamento del campione.
