Un metodo standardizzato per l'analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'endotelio sinusoidale del fegato. Ciò si ottiene isolando prima un fegato e perfondendolo con un fissativo. Successivamente, il fegato viene tagliato in blocchi e disidratato in preparazione per la microscopia elettronica.

Quindi i campioni di fegato vengono rivestiti di cattedra ed esaminati al microscopio elettronico. Infine, vengono analizzate le micrografie elettroniche e vengono calcolati il diametro e la frequenza di fenestrazione e la porosità percentuale. In definitiva, la microscopia elettronica viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nell'endotelio sinusoidale del fegato in varie condizioni.

Questo metodo ci fornisce informazioni sull'ultrastruttura e sulla morfologia dei vasi sanguigni del fegato nel loro endotelio. Può anche essere utilizzato per esaminare i reni e il cervello allo stesso modo Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali vengono eseguite secondo la legislazione locale. Questo lavoro è approvato dal Comitato per il benessere degli animali del distretto sanitario locale di Sydney.

Le procedure consentite sono descritte nella documentazione della licenza del progetto e seguono linee guida che garantiscono il benessere dell'animale in ogni momento. Questo è un intervento chirurgico non di sopravvivenza. Dopo aver preparato il fissativo, secondo il protocollo di testo, riscaldare il tampone di perfusione e il fissativo a 35-37 gradi Celsius.

Una volta che l'animale è stato anestetizzato con una singola iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina, valutare il livello di sedazione mediante ritiro degli arti posteriori e un pizzico della coda. Successivamente, con le forbici smussate, praticare un'incisione a Y nell'addome dell'animale per esporre il fegato e la vena porta. Quindi legare due suture molto larghe attorno alla vena porta, una prossimale al fegato e l'altra più distalmente al fegato.

Incannulare la vena porta con una cannula IV di dimensioni adeguate. Quindi stringere le suture per fissare la cannula. Ora utilizzando da 5 a 20 millilitri di PBS caldi a 37 gradi Celsius, iniziare la perfusione a una pressione di 10 centimetri di H2O.

Evitare che le bolle d'aria entrino nel fegato, che produrrebbero artefatti e una pressione dell'aria troppo alta, che danneggerà il fegato, recidere il CVA della vena addominale e toracica per consentire al tampone di uscire liberamente dal fegato. In questo modo si evitano sovrapressioni e danni alle cellule epatiche, sinusoidali ed endoteliali o LCC. Una volta che il fegato è libero dal sangue, sostituire il PBS con la microscopia elettronica o em, fissativo e perfondere fino a quando il fegato non è indurito e molto pallido.

Circa cinque minuti. Quindi, con il bisturi, tagliare il fegato in blocchi di uno o due millimetri cubi. Usa il fissativo em per postare.

Fissare il fazzoletto a quattro gradi Celsius per 24-72 ore. Quindi trasferire il tessuto in un tampone Cate di sodio 0,1 molare e conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di 12 mesi per montare i campioni per la microscopia elettronica a scansione o SEM. Dopo aver disidratato i campioni secondo il protocollo di testo, etichettare la base dei tronchetti metallici SEM e applicare del nastro biadesivo di carbonio sulla parte superiore dei tronconi sotto un microscopio da dissezione, visualizzare i campioni per identificare la superficie con i migliori sinusoidi per il SEM.

Pizzo, una superficie scelta rivolta verso l'alto sulla superficie del nastro di carbonio del mozzicone e incollarlo saldamente sul tronchetto. Dopo aver eseguito il rivestimento sputter e il SEM secondo il protocollo di testo, aprire un'immagine nell'immagine J e utilizzare una barra di scala incorporata nell'immagine per impostare la scala utilizzando lo strumento poligono nell'immagine J tracciare l'intera area piatta del LSEC, comprese le aree fenestrate e fenestrate, escludere eventuali pezzi di detriti di grandi dimensioni che si trovano sulla superficie della cella che potrebbero oscurare le finestrature. Per misurare il diametro della finestratura, posizionare una linea attraverso il diametro più lungo di ciascuna finestra selezionando lo strumento linea.

Premere M per misurare la linea e D per disegnare permanentemente la linea sull'immagine. Questa linea è definita come il diametro della fenestrazione e sarà ora disponibile nella casella dei risultati dell'immagine J.Measure tutti i gap che sono fori più grandi nel citoplasma LSEC oltre i 250 nanometri, così come le fenestrazioni. Calcola l'area degli spazi che non sono circolari tracciando intorno ad essi e utilizzando l'immagine J per calcolare la loro area oltre i dati dalla casella dei risultati nell'immagine J in un foglio di calcolo Excel.

Per ulteriori analisi, utilizzare le seguenti formule per eseguire i calcoli delle finestre. Il diametro medio delle finestre è uguale alla media di tutti i diametri delle finestre. L'area di fenestrazione è uguale a pi r al quadrato, dove R è calcolato dai singoli diametri di fenestrazione.

La percentuale di porosità è uguale a sigma pi R al quadrato dell'area totale analizzata e i micron moltiplicati per 100 escludono l'area della somma degli spazi vuoti da questo calcolo. Per presentare i dati nelle pubblicazioni, includere il diametro della fenestrazione con una dichiarazione che conferma che i diametri limite sono stati utilizzati per definire le fenestrazioni, la frequenza delle fenestrazioni e la porosità, includere anche una dichiarazione che conferma se le lacune sono state incluse nell'analisi e un grafico della distribuzione della frequenza del diametro della fenestrazione e il numero di blocchi di fegati, nonché immagini. Il basso ingrandimento mediante SEM rivela una superficie piana del campione di fegato con un'area esposta abbastanza grande da osservare molti grandi vasi epatici e sinusoidi, compreso il tratto portale e l'ES centrale, come mostrato qui.

Garantire il corretto posizionamento del blocco epatico sul tronchetto di montaggio è essenziale per ottenere immagini chiare dei sinusoidi e la capsula luccica, che copre tutti i dettagli dei sinusoidi del fegato, dovrebbe essere evitata. Per questo motivo, come mostrato qui, un ingrandimento maggiore consente l'osservazione delle finestre LSEC. Le placche degli epatociti possono apparire come vasi sanguigni, ma caratteristiche come il BLI aiutano con l'orientamento.

Questa figura dimostra che un'elevata pressione di profusione può causare artefatti come grandi spazi vuoti nell'endotelio che si ritiene siano causati dalla coalescenza delle piastre SIV LSEC che sono facilmente identificabili sotto SEM, evitando la membrana cellulare direttamente sopra i nuclei, che può essere vista come un rigonfiamento sotto la superficie del LSEC, aiuterà con l'accuratezza dei calcoli della densità di fenestrazione e della porosità. Infine, la quantificazione della densità e della frequenza del diametro delle fenestrazioni LSEC fornisce una misurazione empirica delle fenestrazioni e consente di misurare i cambiamenti indotti da malattie dell'invecchiamento, tossine o terapie. Dopo la procedura di perfusione, il tessuto può essere elaborato per altre tecniche come la microscopia elettronica a trasmissione per osservare l'ultrastruttura cellulare, la struttura mitocondriale.

Può essere utilizzato anche per l'istologia.