Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire con successo una perfusione epatica di topo per facilitare la purificazione di specifiche popolazioni di cellule epatiche di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epatologia su come assistere le funzioni di specifiche popolazioni di cellule epatiche all'interno di saggi in vitro o in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata quantità di epatociti nelle cellule endoteliali sinusoidali che possono essere ottenute da ciascun fegato.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è essenziale vedere il colore e la forma di un fegato digerito in modo ottimale per preservare la vitalità cellulare. Per posizionare il catetere della vena porta, utilizzare prima la parte posteriore di una pinza per spostare l'intestino sul lato destro della cavità addominale del topo, esponendo la vena porta, e utilizzare una pinza curva per far scorrere un pezzo di filo da cucito di poliestere di 20 centimetri sotto la vena porta tra il fegato e la vena duodenale pancreato superiore. Usa la pinza per tirare con cautela il filo dall'altra parte dell'animale, in modo che sia centrato sotto la vena porta.

E fai un nodo sciolto intorno alla vena porta. Posiziona la pinza curva sotto la vena e tira delicatamente tutto il materiale tissutale verso la coda per raddrizzare la vena. Quindi, posizionare lo smusso di un ago del catetere rivolto verso l'alto e parallelo alla parte inferiore della vena porta vicino alla pinza e perforare delicatamente la vena con l'ago.

Quando lo smusso si trova nel lume della vena, ritrarre l'ago caricato a molla e continuare a spingere il catetere palmare attraverso la vena, fino a quando lo smusso non si trova vicino all'area ramificata della venere. Dopo aver fissato il nodo attorno al catetere, impostare immediatamente la pompa peristaltica a quattro millimetri al minuto e collegare l'estremità maschio del tubo all'estremità femmina del catetere, a quel punto si dovrebbe iniziare a vedere il ramo del fegato. Tagliare l'aorta addominale per il drenaggio.

Utilizzare del nastro adesivo per immobilizzare il tubo sul cuscinetto inferiore. Utilizzare le forbici per tagliare verticalmente la pelle addominale, per consentire il drenaggio del sangue e del liquido di perfusione. Quindi spremere il vaso sanguigno dell'effluente alcune volte con la pinza dritta per gonfiare il fegato, assicurandosi che tutto il sangue sia stato drenato, e perfondere il fegato con PBS fino a quando il tessuto epatico non sbianca.

Per raccogliere gli epatociti, prima cambiare il tubo di deflusso dal pallone da un litro di PBS a un pallone da 125 millilitri, contenente il tampone due, integrato con collagenasi-4. Quando la collagenasi raggiunge il fegato, spremere brevemente ma strettamente il vaso sanguigno dell'effluente per aumentare la pressione e consentire al tampone di digestione di riempire tutti i lobi del fegato. Rilasciare il vaso prima che il tampone scoppi attraverso il tessuto connettivo che circonda il fegato.

E lasciare che il tampone persi attraverso il fegato fino a quando l'intero volume non è fluito attraverso il tessuto. Quindi, posiziona un piatto di cristallizzazione contenente 10 millilitri di tampone accanto al topo e usa una pinza e forbici dritte per trasferire il fegato nel piatto. Trasferire la piastra in una cappa di coltura tissutale sterile e, utilizzando una tecnica sterile, afferrare il fegato per staccare la capsula.

Scuotere delicatamente le cellule dal tessuto epatico e versare la soluzione cellulare risultante attraverso un filtro da 100 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi sciacquare i resti di fegato dal filtro con altro tampone. Quando il fegato sembra essere privo di cellule, filtrare il filtrato estratto attraverso un filtro da 40 micron in una seconda provetta da 50 millilitri e raccogliere le cellule per centrifugazione.

Versare la cellula non parenchimale e l'epatocita morto contenente surnatante in una nuova provetta da 50 millilitri su ghiaccio in un solo movimento, per preservare il pellet e risospendere il pellet in 40 millilitri di tampone fresco uno per la centrifugazione successiva. Per isolare le cellule endoteliali sinusoidali, centrifugare i surnatanti contenenti cellule non parenchimali. Estrarre le sospensioni cellulari in un unico nuovo tubo conico da 50 millilitri e portare il volume totale fino a 35 millilitri.

Raccogliere le cellule estratte mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire con cura i 25 millilitri superiori della cellula non parenchimale contenente surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri su ghiaccio. Aggiungere 25 millilitri di terreno fresco alla provetta e risospendere il pellet per una seconda centrifugazione e la rimozione del surnatante. Quindi centrifugare il surnatante e aggiungere 15 millilitri di una soluzione di Percoll al 50% a una nuova provetta da 50 millilitri.

Utilizzando un pipettatore impostato sulla velocità di espulsione più bassa, sovrapporre 20 millilitri di Percoll al 25% sulla soluzione di Percoll al 50% e risospendere le cellule non parenchimali in 10 millilitri di terreno a quattro gradi Celsius. Sovrapporre accuratamente le cellule sulla soluzione di Percoll. E separare le celle mediante centrifugazione in gradiente di densità.

Quindi, aspirare i primi 30 millilitri di soluzione e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica da cinque millilitri per raccogliere le cellule endoteliali sinusoidali e di Kupffer situate nell'interfase della soluzione a gradiente di densità dal 25 al 50% in una nuova provetta conica da 50 millilitri. Lavare le celle con 50 millilitri di terreno e risospendere il pellet risciacquando i lati del fondo del tubo in 12 millilitri di terreno caldo. Per separare le cellule endoteliali sinusoidali dalle cellule di Kupffer, trasferire la sospensione cellulare in una piastra di Petri di polistirene in un incubatore di coltura tissutale umidificato per otto minuti.

Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per aspirare il surnatante e utilizzare il surnatante per sciacquare la piastra con il pipettatore impostato alla velocità più bassa per raccogliere le restanti cellule endoteliali sinusoidali. Quindi trasferire le cellule endoteliali sinusoidali in una nuova provetta da 50 millilitri. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione per la loro risospensione e la piastratura in piastre di coltura cellulare rivestite di collagene.

La microscopia elettronica a scansione di un fegato di topo dopo perfusione infissativa PBS in modo simile a quanto appena dimostrato, rivela una visione chiara della microanatomia del fegato e dei microvilli tra gli epatociti. Gli epatociti raccolti durante le centrifughe a bassa velocità all'inizio della procedura, dimostrano un'elevata purezza dopo quattro lavaggi in tampone contenenti albumina sierica bovina. La separazione delle cellule endoteliali sinusoidali mediante adesione selettiva su una piastra di Petri in polistirene rivestita di collagene si traduce in una purezza dall'83 al 90% che dipende in gran parte dall'efficacia complessiva della digestione della collagenasi.

Le misurazioni quantitative utilizzando la microscopia ottica da una procedura di separazione rappresentativa, come appena dimostrato, rivelano risultati di isolamento tipici di una popolazione di epatociti puri quasi al 100%. E una popolazione di cellule endoteliali sinusoidali pure di poco più dell'89%. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catetizzare una vena porta di topo e di come purificare sia gli epatociti che le cellule endoteliali sinusoidali dal fegato di topo.

Questa procedura può essere utilizzata anche per purificare le cellule satelliti dalla frazione non parenchimale dopo l'isolamento degli epatociti utilizzando diversi gradienti di densità e velocità di centrifugazione.