Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio in risposta agli agenti farmacologici. Stimare i livelli basali di calcio e valutare l'attività dei singoli canali nei podociti come parte dell'intero glomerulo appena isolato. Ciò si ottiene eliminando prima il sangue dai reni di ratto mediante lavaggio attraverso l'aorta addominale.

Successivamente, i reni vengono prelevati e la corteccia renale viene isolata e tritata con una lama di rasoio. Nella terza fase, i glomeruli corticali vengono isolati mediante cingo differenziale. Successivamente, i glomeruli decapitati isolati possono essere sottoposti a esperimenti elettrofisiologici o caricati con coloranti fluorescenti e prelevati per misurazioni confocali della concentrazione di calcio.

In definitiva, queste procedure consentono ai ricercatori di risolvere i cambiamenti acuti nella gestione intracellulare del calcio in risposta alle applicazioni di vari agenti e di valutare e manipolare la conduttanza del calcio a livello dei singoli canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che ci permette di studiare i podociti come parte dell'intero glomerulo isolato. Il nostro preparato conserva il potenziale funzionale dei podociti.

Rimangono attaccati ai capillari e partecipano all'omeostasi nell'ambiente che in realtà può conservare la maggior parte dell'apparato di filtrazione dei glomeruli. Le implicazioni di questa tecnica estendono il nostro screening farmacologico In stati normali e patologici, il meccanismo di manipolazione del calcio da parte dei podociti svolge un ruolo regolatorio essenziale nello sviluppo e nella prevenzione delle complicanze renali in malattie come la nefropatia diabetica, la sclerosi omero del segmento focale o l'ipertensione. È di grande importanza osservare la reattività dell'afflusso di calcio in queste cellule ai farmaci, che possono essere facilmente sottoposti a screening.

In questa preparazione, VLA Hunka dimostrerà come lavare il rene per le seguenti procedure. Mostrerò l'isolamento dei glomeruli e l'elettrofisiologia del V clamp e il Dr.GaN ti guiderà attraverso l'imaging confocale del calcio. Per iniziare questa procedura, posizionare un ratto anestetizzato sul tavolo operatorio a temperatura controllata Sotto il microscopio, praticare un'incisione sulla linea mediana sull'addome per scoprire la CVA venosa e l'aorta.

Successivamente, inserire la legatura attorno alle arterie celiache e mesenteriche superiori e all'aorta addominale sopra di esse. Smussato, sezionare l'aorta addominale sotto le arterie renali. Quindi posiziona due legature attorno ad esso, ma non legare.

Bloccare l'aorta sopra le legature e legare il filo inferiore. Successivamente, cateterizzare l'aorta con un tubo di polietilene collegato a una pompa a siringa riempita di PBS sotto il morsetto e fissare il catetere con una seconda legatura. Quindi rimuovere il morsetto e fissarli.

Arterie enteriche e celiache. Infondere l'aorta con PBS pre-raffreddato per tre minuti a una velocità di sei millilitri al minuto. Allo stesso tempo, praticare un'incisione nella vena della cava vicino alle vene renali per alleviare la pressione.

Dopo tre minuti, fermare la perfusione, asportare e incapsulare i reni. Metterli in una soluzione PBS con ghiaccio. Ora prepara 30 millilitri di fresco 5%BSA in RPMI 1640 medium.

Usando una lama di rasoio e delle forbici, isolare la corteccia di entrambi i reni, quindi MIT fino a renderli omogenei. Successivamente, spingere il fazzoletto tritato attraverso un setaccio in acciaio inossidabile da 100 maglie che è stato pre-imbevuto di soluzione al 5% P-S-A-R-P-M-I. Raccogli il flusso e lascialo passare attraverso un siv da 140 mesh.

Successivamente, filtrare il flusso raccolto dal setaccio da 140 mesh utilizzando un siv da 200 mesh pre-imbevuto. Scartare il filtrato e lavare il setaccio superiore con 10-15 millilitri della soluzione B-S-A-R-P-M-I preparata e raccogliere i glomeruli dalla parte superiore del setaccio. Posizionare quindi la soluzione B-S-A-R-P-M-I contenente G Glomeruli in 15 millilitri, due bon ice e lasciare sedimentare i glomeruli sul fondo della provetta per un massimo di 20 minuti.

In questa procedura, rivestire cinque per cinque millimetri coprire le schegge di vetro con peso molecolare, da 70.000 a 150.000 polilisina e asciugarle su una piastra riscaldata. Quindi, riscaldare le soluzioni sperimentali a temperatura ambiente e riempire la camera di bloccaggio del cerotto e la pipetta Mescolare delicatamente la soluzione contenente glomeruli. Quindi applicarne circa 50 microlitri su ogni truciolo di vetro di copertura rivestito in polilisina.

Successivamente, sposta i trucioli di vetro con i glomeruli nella camera del morsetto del cerotto. Preriempito con la soluzione Beth. Perfondere la camera a una velocità di tre millilitri al minuto per un minuto per rimuovere eventuali glomeruli non attaccati prima di eseguire la registrazione convenzionale con patch clamp in modalità collegata alla cella.

Ora metti 500 microlitri della frazione di glomeruli in ogni tubo conico da 0,5 millilitri e aggiungi coloranti di calcio rosso puro am e influenza oh 4:00 AM. Quindi, posizionare le provette su uno shaker rotante per un massimo di un'ora a temperatura ambiente. Quindi preparare i vetrini di copertura con polilisina e lasciarli asciugare sulla piastra riscaldata a 70 gradi Celsius. Una volta completato il caricamento delle matrici di calcio, applicare 100 microlitri di soluzione contenente glomeruli sui vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina e lasciarli aderire alla superficie per circa cinque minuti.

Quindi montare i vetrini coprioggetti attaccati ai glomeruli su una camera di imaging e perfonderli con la soluzione del bagno a una velocità di tre millilitri al minuto per rimuovere i glomeruli non attaccati e i coloranti rimanenti. Successivamente, impostare il microscopio a scansione laser confocale su una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Quindi impostare il software di imaging sulla frequenza e la risoluzione desiderate.

Quindi, trova i glomeruli in campo chiaro. Successivamente attivare il rilevamento del segnale di fluorescenza. Successivamente, selezionare il piano focale desiderato e controllare l'intensità della fluorescenza sui canali dell'influenza a quattro e del rosso firo.

Assicurati che il glomerulo sia chiaramente visibile in campo chiaro. Quindi registrare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza per l'influenza oh quattro e i segnali rossi furor. Per importare la sequenza di immagini, dividi i canali e usa la modalità scala di grigi hyper stack.

Nel software Image J, aprire una finestra di gestione del ROI seguendo il percorso degli strumenti di analisi, ROI Manager. Seleziona una o più regioni di interesse utilizzando uno strumento di selezione ovale e la funzione di aggiunta T nel gestore ROI. Quindi seleziona l'area sullo sfondo e salva le ROI selezionate.

Quindi, contrassegna la casella di una riga per sezione nella finestra di dialogo e fai clic su OK nei risultati delle opzioni del menu. Imposta le misure. Seleziona il valore medio di grigio e calcola i valori di intensità dei pixel per ogni ROI, che verranno visualizzati nella finestra dei risultati in colonne separate.

Per ogni ROI, copiare i valori di intensità del ROI misurati per ciascun canale nel software di analisi dei dati preferito e sottrarre i valori di intensità di fondo da ciascun punto dati per ogni punto temporale. Calcola il rapporto tra le intensità dell'influenza oh quattro e i canali rossi URA dopo quel grafico, le variazioni puntuali temporali del calcio transitorio per ogni ROI. Questa immagine mostra la pipetta patch clamp attaccata al corpo dell'ossido sulla superficie del glomerulo di ratto.

Durante una registrazione elettrofisiologica, una parte del glomerulo incapsulato può essere vista nell'angolo inferiore destro dell'immagine. Ecco una traccia corrente rappresentativa dell'attività dei canali tripy like da un cerotto attaccato alla cellula realizzato sul podocita per misurare la concentrazione intracellulare di calcio. I glomeruli sono caricati con l'influenza oh 4:00 AM per marcare il calcio intracellulare.

Questo video illustra gli effetti del CIN e del cloruro di manganese sull'afflusso di calcio nei glomeruli. Questo grafico quantifica le variazioni dell'intensità del segnale dell'influenza o quattro registrate da un singolo podocita in risposta a CIN e cloruro di manganese. Come previsto, il CIN produce il massimo della fluorescenza e il cloruro di manganese estingue il colorante e si traduce nella più bassa intensità di fluorescenza.

L'applicazione di questi farmaci consente al ricercatore di definire successivamente l'esatta concentrazione di calcio all'interno della cellula. Questo video mostra l'effetto di 10 micromoli a TP sulla concentrazione di calcio nei glomeruli. Si noti che c'è un aumento della fluorescenza verde O quattro e un calo della fluorescenza rossa fu rossa, che rappresentano un aumento della concentrazione intracellulare di calcio.

Questa tecnica offre un'opportunità unica per monitorare i cambiamenti nell'afflusso di calcio a livello di singolo canale ionico e di singole cellule dopo trattamenti farmacologici o altre manipolazioni. Pertanto, questo approccio rappresenta uno strumento molto potente considerando i molteplici modelli di roditori geneticamente modificati disponibili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le misurazioni della calcio nei podociti del, così come gli esperimenti elettrofisiologici, che clamp utilizzati insieme da soli.

Queste tecniche forniscono una visione approfondita e meccanicistica della regolazione della manipolazione del calcio con i podociti in condizioni normali e patologiche.