Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio in risposta ad agenti farmacologici. Stimare i livelli basali di calcio e valutare l'attività dei singoli canali nei podociti come parte del glomerulo frescamente isolato. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il sangue dai reni del ratto mediante lavaggio attraverso l'aorta addominale.

Successivamente, i reni vengono prelevati e la corteccia renale viene isolata e tritata con una lametta. Nel terzo passaggio, i glomeruli corticali vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Successivamente, i glomeruli decapitati isolati possono essere sottoposti a esperimenti elettrofisiologici oppure caricati con coloranti fluorescenti e utilizzati per misurazioni confocali della concentrazione di calcio.

In definitiva, queste procedure consentono ai ricercatori di risolvere i cambiamenti acuti nella gestione del calcio intracellulare in risposta all'applicazione di vari agenti e di valutare e manipolare la conduttanza del calcio a livello di singoli canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che permette di studiare i podociti come parte del glomerulo isolato nella sua interezza. Il nostro preparato mantiene il potenziale funzionale dei podociti.

Rimangono attaccati ai capillari e partecipano all'omeostasi nell'ambiente che effettivamente può conservare le parti principali dell'apparato di filtrazione dei glomeruli. Le implicazioni di questa tecnica ampliano il nostro screening farmacologico. In condizioni normali e patologiche, il meccanismo di gestione del calcio da parte dei podociti svolge un ruolo regolatorio essenziale nello sviluppo e nella prevenzione di complicanze renali in malattie come la nefropatia diabetica, la sclerosi focale segmentale o l'ipertensione. È di grande importanza osservare la risposta dell'afflusso di calcio in queste cellule ai farmaci, che possono essere facilmente sottoposti a screening.

In questa preparazione, VLA Hunka dimostrerà come eseguire il lavaggio del rene per le procedure seguenti. Mostrerò l'isolamento dei glomeruli e la tecnica di elettrofisiologia con clamp a V, mentre il dottor GaN vi guiderà nell'imaging confocale del calcio. Per iniziare questa procedura, posizionare un ratto anestetizzato su un tavolo operatorio con temperatura controllata. Sotto il microscopio, praticare un'incisione mediana sull'addome per esporre la vena CVA e l'aorta.

Successivamente, inserire la ligatura intorno alle arterie celiaca e mesenterica superiore e all'aorta addominale al di sopra di esse. Dissezionare in modo ottuso l'aorta addominale al di sotto delle arterie renali. Quindi posizionare due ligature intorno ad essa, ma non legarle.

Clampare l'aorta sopra le legature e annodare il filo inferiore. Successivamente, cateterizzare l'aorta con un tubo in polietilene collegato a una pompa a siringa riempita con PBS al di sotto del clamp e fissare il catetere con una seconda legatura. Quindi rimuovere il clamp e legare.

Me arterie mesenteriche e celiache. Infondere l'aorta con PBS preraffreddato per tre minuti a una velocità di sei millilitri al minuto. Allo stesso tempo, praticare un'incisione nella vena cava vicino alle vene renali per alleviare la pressione.

Dopo tre minuti, interrompere la perfusione, escindere e incapsulare i reni. Posizionarli in soluzione di PBS su ghiaccio. Preparare ora 30 millilitri di BSA al 5% appena preparata nel mezzo RPMI 1640.

Utilizzando una lametta e delle forbici, isolare la corteccia di entrambi i reni, quindi omogeneizzarla con il MIT fino a ottenere una consistenza uniforme. Successivamente, far passare il tessuto tritato attraverso un setaccio in acciaio inossidabile da 100 maglie, precedentemente immerso in soluzione al 5% di P-S-A-R-P-M-I. Raccogliere il filtrato e lasciarlo passare attraverso un setaccio da 140 maglie.

Successivamente, filtrare il flusso raccolto dal setaccio da 140 mesh utilizzando un setaccio da 200 mesh preventivamente saturato. Scartare il filtrato e lavare il setaccio superiore con 10-15 millilitri della soluzione B-S-A-R-P-M-I preparata, raccogliendo i glomeruli dalla superficie del setaccio. Successivamente, trasferire la soluzione B-S-A-R-P-M-I contenente i glomeruli G in un tubo da 15 millilitri e metterlo su ghiaccio; lasciare sedimentare i glomeruli sul fondo del tubo per un massimo di 20 minuti.

In questo procedimento, rivestire chip di vetro coprioggetti di cinque millimetri per cinque millimetri con polilisina di peso molecolare compreso tra 70.000 e 150.000 e farli essiccare su una piastra riscaldata. Successivamente, portare le soluzioni sperimentali alla temperatura ambiente e riempire la camera per patch clamp e la pipetta. Mescolare delicatamente la soluzione contenente i glomeruli. Quindi applicare circa 50 microlitri di tale soluzione su ciascun chip di vetro coprioggetti rivestito con polilisina.

In seguito, trasferire i frammenti di vetro con i glomeruli nella camera per il patch clamp, pre-riempita con la soluzione di Beth. Perfundere la camera a una velocità di tre millilitri al minuto per un minuto, al fine di rimuovere eventuali glomeruli non aderenti, prima di effettuare la registrazione standard con il patch clamp in modalità cella attaccata.

Ora posizionare 500 microlitri della frazione di glomeruli in ciascun tubo conico da 0,5 millilitri e aggiungere i coloranti per il calcio pure red am e flu oh 4:00 AM. Successivamente, posizionare i tubi su uno shaker rotante per un massimo di un'ora a temperatura ambiente. Poi preparare le lamelle di vetro con polilisina e lasciarle asciugare sulla piastra riscaldata a 70 gradi Celsius. Una volta completato il caricamento dei coloranti per il calcio, applicare 100 microlitri della soluzione contenente i glomeruli sulle lamelle ricoperte di polilisina e lasciarle aderire alla superficie per circa cinque minuti.

Quindi montare le coprioggetti con i glomeruli attaccati su una camera per imaging e perfondere con soluzione da bagno a un flusso di tre millilitri al minuto per rimuovere i glomeruli non attaccati e i coloranti residui. Successivamente, impostare il microscopio confocale a scansione laser sulla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Impostare quindi il software di acquisizione immagini sulla frequenza e risoluzione desiderate.

Successivamente, individuare i glomeruli in campo chiaro. Accendere poi il rilevamento del segnale di fluorescenza. Dopodiché, selezionare un piano focale desiderato e verificare l'intensità della fluorescenza nei canali flu oh four e firo red.

Assicurarsi che il glomerulo sia chiaramente visibile in campo chiaro. Quindi registrare le variazioni dell'intensità di fluorescenza dei segnali flu oh four e furor red. Per importare la sequenza di immagini, separare i canali e utilizzare la modalità scala di grigi hyper stack.

Nel software Image J, aprire una finestra del gestore delle aree di interesse (ROI) seguendo il percorso strumenti di analisi, Gestore ROI. Selezionare una o più aree di interesse utilizzando lo strumento di selezione ellittica e la funzione aggiungi T nel gestore ROI. Quindi selezionare l'area nello sfondo e salvare le ROI selezionate.

Successivamente, selezionare una riga per ogni box della sezione nella finestra di dialogo e fare clic su OK nelle opzioni del menu. Impostare le misurazioni. Selezionare il valore medio di grigio e calcolare i valori di intensità dei pixel per ciascuna ROI, che verranno visualizzati nella finestra dei risultati in colonne separate.

Per ogni ROI, copiare quindi i valori di intensità misurati del ROI per ogni canale nel software di analisi dati preferito e sottrarre i valori di intensità del fondo scala da ciascun punto dati per ogni punto temporale. Calcolare il rapporto tra le intensità del canale flu oh four e quello del canale URA red; successivamente, tracciare le variazioni nel tempo del transiente di calcio per ciascun ROI. Questa immagine mostra la pipetta per il patch clamp attaccata al corpo ossidato sulla superficie del glomerulo di ratto.

Durante una registrazione elettrofisiologica, una parte del glomerulo incapsulato può essere osservata nell'angolo inferiore destro dell'immagine. Di seguito è riportata una traccia di corrente rappresentativa dell'attività di canali di tipo tripy, ottenuta mediante un'acquisizione in configurazione cell-attached effettuata sul podocita per misurare la concentrazione intracellulare di calcio. I glomeruli vengono caricati con flu oh 4:00 AM per etichettare il calcio intracellulare.

Questo video illustra gli effetti del CIN e del cloruro di manganese sull'ingresso di calcio nei glomeruli. Questo grafico quantifica i cambiamenti nell'intensità del segnale flu oh four registrati da un singolo podocita in risposta al CIN e al cloruro di manganese. Come previsto, il CIN produce il massimo della fluorescenza, mentre il cloruro di manganese quencha il colorante e determina l'intensità di fluorescenza più bassa.

L'applicazione di questi farmaci consente al ricercatore di definire successivamente la concentrazione esatta di calcio all'interno della cellula. Questo video dimostra l'effetto di 10 micromoli di TP sulla concentrazione di calcio nei glomeruli. Si noti l'aumento della fluorescenza verde del fluo-4 e la diminuzione della fluorescenza rossa del fu-red, che indicano un aumento della concentrazione di calcio intracellulare.

Questa tecnica offre un'opportunità unica per monitorare i cambiamenti nell'afflusso di calcio a livello di singoli canali ionici e di cellule singole dopo trattamenti farmacologici o altre manipolazioni. Pertanto, questo approccio rappresenta uno strumento molto potente, soprattutto alla luce dei numerosi modelli di roditori geneticamente modificati disponibili. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire misurazioni del calcio nei podociti, nonché degli esperimenti di clamping elettrofisiologici, utilizzati sia in combinazione che autonomamente.

Queste tecniche forniscono un'analisi approfondita e un'interpretazione meccanicistica della regolazione del maneggiamento del calcio nei podociti in condizioni normali e patologiche.