SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire uno strumento per aiutare l'identificazione dei tessuti in blocchi di paraffina multitessuto. Ciò si ottiene combinando prima HistoGel con il colorante per la marcatura dei tessuti per formare un tappo di gel dai colori vivaci. Il secondo passo consiste nel processare e incorporare i tappi colorati HistoGel seguendo le tecniche standard di lavorazione e inclusione dei tessuti.

Successivamente, viene utilizzato un punzone per biopsia per rimuovere i piccoli cilindri. Si tratta di etichette o punti di orientamento del campione. Il passaggio finale consiste nell'incorporare lo spot in un blocco multi-tessuto con la posizione dello spot e ogni campione accuratamente documentato per una facile consultazione.

In definitiva, lo spot fornisce un chiaro segnale visivo per l'orientamento e l'identificazione del campione in microarray di tessuti e blocchi multi-tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le suture o i nuclei asimmetrici, è che lo spot non altera il tessuto e consente flessibilità nella disposizione dei campioni per un'analisi ottimale. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo ricevuto richieste da parte degli investigatori di combinare campioni di tessuto di più animali in un unico blocco di paraffina per risparmiare denaro e semplificare l'analisi: Per preparare gli spot, iniziare con l'aggiunta di 50 milligrammi di BSA di grado biochimico a un millilitro di colorante per la marcatura dei tessuti in un tubo conico da 15 millilitri.

Agitare il composto per almeno un minuto fino a quando non si sarà completamente sciolto. Successivamente, caricare nove millilitri di gel di lavorazione dell'idrossietilaros in un tubo conico da 15 millilitri e riscaldarlo in un forno a microonde al 30% di potenza. Frullare il calore con incrementi di dieci secondi fino a quando il gel non si sarà completamente sciolto.

Unire ora il gel di lavorazione fuso e la soluzione di colorante BSA in un'unica provetta conica da 15 millilitri e mescolarla accuratamente con una pipetta. Quindi agitare la soluzione e trasferirla in frigorifero per qualche ora a solidificare. Una volta indurito, rimuovere il solido dilatato nel gel rilasciandolo delicatamente con una spatola stretta.

Taglia il plug in sezioni spesse cinque millimetri. Non utilizzare le estremità arrotondate. Trasferire da tre a sei sezioni in una cassetta istologica e immergerle in etanolo al 70%, cambiare la soluzione di etanolo al 70% ogni due o quattro ore e almeno tre volte nell'arco di 24 ore fino a quando i tappi non sono completamente disidratati.

Faranno lisciviare parte del colorante di marcatura nella soluzione di etanolo. L'uso di cambi di etanolo fresco inizialmente aiuta a eliminare parte del colorante in eccesso, ottenendo un tappo più pulito che ha meno probabilità di lisciviare il colore. Quindi, trasferire le cassette all'80% di etanolo e poi al 95% di etanolo per un'ora in ogni bagno.

Il colorante può fuoriuscire dal tappo del gel, il che potrebbe influenzare altri tessuti e i reagenti liquidi in un processore di tessuti automatizzato. Pertanto, la disidratazione manuale è altamente raccomandata. Tuttavia, l'elaborazione automatizzata è altrettanto efficace.

Completare la disidratazione con tre lavaggi in etanolo al 100% per un'ora ciascuno. Eliminare i campioni immergendoli in idrocarburi atici o xileni tre volte per un'ora in ogni bagno. Ora infiltrati nelle sezioni con tre bagni di un'ora.

In paraffina fusa. Incorporare le sezioni lavorate come al solito e, quando il blocco è a temperatura ambiente, utilizzare un ago da punzone dermico per creare nuclei spot. Un blocco può produrre nuclei da 22 millimetri o anche più nuclei da 1,5 millimetri.

Inizia creando un diagramma per indicare le posizioni e le identità desiderate di tutti i singoli pezzi di tessuto da incorporare insieme e la posizione del punto. Prepara una copia da tenere a portata di mano. L'uso efficace delle etichette di orientamento dei campioni richiede una mappa dei campioni biologici chiara e facile da seguire, che descriva accuratamente tutti i campioni biologici, la loro posizione e la loro posizione rispetto al luogo.

Dopo aver lavorato i pezzi di tessuto, disporli sulla stazione di inclusione. Secondo il diagramma di orientamento dei tessuti, il corretto orientamento è assolutamente fondamentale. È anche fondamentale che il nucleo spot sia più alto di tutti i pezzi di tessuto che verranno incorporati nel blocco.

Dopo aver completato la disposizione dei tessuti, incorporare le macchie. Tieni ogni punto in posizione verticale con una pinza fino a quando la paraffina non si è solidificata in modo che non si ribalti. Un minuto o due dovrebbero essere sufficienti.

Per un kit TMA manuale, riempire lo stampo TMA con paraffina fusa. Mentre lo stampo si sta raffreddando, attaccare i punti in modo simile ai margini dell'array. Ora seziona e macchia le sezioni con la macchia.

Utilizzando un approccio standard, qui vengono realizzate sezioni di cinque micron. Per posizionare le sezioni sui vetrini, farli galleggiare in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius, quindi trasferirli su vetrini caricati positivamente. Una volta attaccati ai vetrini, asciugarli a 60 gradi Celsius per almeno 20 minuti.

I vetrini possono ora essere colorati manualmente o su un sistema di colorazione automatizzato. Per la colorazione h e d di routine, le macchie speciali o le macchie immunoistochimiche apparivano come un tondo dai colori vivaci. nel blocco di paraffina e in tutte le sezioni di paraffina.

Gli spot hanno permesso un facile orientamento e l'identificazione dei tessuti in blocchi multi-tessuto contenenti tessuti dall'aspetto simile di diversi individui e gruppi di trattamento. Quando utilizzati in un tessuto, gli spot di microarray consentivano di utilizzare ogni nucleo per campioni di tessuto di valore e gli spot potevano essere facilmente individuati adiacenti a un nucleo di microarray di tessuti. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che una documentazione accurata e chiara del campione biologico e del punto nel blocco è fondamentale per il suo utilizzo di successo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare e utilizzare facilmente l'etichetta di orientamento del campione come ausilio per l'identificazione dei tessuti in blocchi di paraffina multitessuto.