Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All'interno della Atlas proteina umana
31 maggio 2012
Microarray di tessuto permette un metodo efficace per ottenere informazioni contemporaneamente da una moltitudine di tessuti. Parti rappresentativi di tessuti sono assemblate in un singolo blocco di paraffina. Sezioni dal blocco sono utilizzati per immunoistochimica e analisi di schemi di espressione della proteina. Scansione digitale genera immagini corrispondenti per la distribuzione dei dati.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un metodo efficiente per ottenere informazioni concomitanti da più tessuti per l'espressione proteica in un progetto ad alto rendimento come l'atlante proteico umano. Ciò si ottiene selezionando prima le aree rappresentative dei tessuti formali e fissati inclusi in paraffina. Successivamente, le aree contrassegnate vengono perforate e i nuclei selezionati vengono assemblati in un unico blocco di paraffina, un microarray tissutale.
Quindi le sezioni vengono tagliate dalla TMA e viene eseguita l'immunoistochimica. Infine, viene analizzato il pattern di espressione proteica e i dati vengono pubblicati sull'atlante proteico umano. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione proteica nei tessuti e nelle cellule attraverso microarray tissutali e immunoistochimica.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'esecuzione dell'immunoistochimica da blocchi di paren di un singolo tessuto, è che è possibile risparmiare prezioso materiale biologico e gli esperimenti sono più riproducibili. Un altro vantaggio di questa tecnica è che è possibile ridurre i costi di otorinolaringoiatria e i tempi di elaborazione in laboratorio. A dimostrare questa procedura sarà Ian Call Bay, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio per ottenere una lunghezza standardizzata delle anime di tessuto.
Segna lo stiletto. Si consiglia di lasciare margini da 2,5 a 3,0 millimetri su ciascun lato del blocco di paraffina per evitare di rompere la paraffina per montare i punzoni adeguati. Allentare le viti a esagono incassato che tengono il punzone in posizione e posizionare il punzone in modo che la scanalatura nel mozzo del punzone sia saldamente posizionata contro l'asta di metallo nel blocco a V di plastica.
Fissare le viti, assicurandosi che il bordo della clip metallica sia orizzontale. Inserire il punzone ricevente a sinistra e il punzone donatore a destra. Utilizzare le manopole di regolazione XY e le loro letture micrometriche digitali per spostare i punzoni lungo gli assi X e Y.
Per resettare la macchina, premere il pulsante zero a BS per alternare tra pollici e millimetri, premere il pulsante pollici millimetri. Quando si utilizza un punzone da un millimetro per un modello nove per otto, lo spazio tra i fori deve essere di due millimetri misurato tra i centri dei fori per evitare di spingere troppo in basso il punzone ricevente e danneggiare il punzone, impostare la profondità massima per spingere il punzone posizionando una cassetta vuota nel supporto e utilizzando la vite di arresto di profondità nell'angolo in alto a sinistra della guida Z, Impostare la posizione inferiore del punzone ricevente a un millimetro sopra la parte inferiore della cassetta. Dopo aver selezionato e contrassegnato l'area pertinente su una sezione di tessuto e aver progettato un modello per la produzione di microarray di tessuti, inserire il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il cacciavite più piccolo per fissare le viti.
Evitare di serrare eccessivamente le viti per evitare che la paraffina si stacchi dalla cassetta. Spingere il punzone ricevente verso il basso di circa cinque millimetri nel blocco ricevente e utilizzare la maniglia sul punzone per ruotare il punzone avanti e indietro. Una volta, scaricare lentamente la pressione di spinta verso il basso in modo che le molle possano spostare il punzone verso l'alto.
Usa lo stilo per svuotare il punzone e scartare il nucleo di paraffina. Quindi sposta la torretta per passare al punzone donatore. Quindi, posiziona il ponte del blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente.
Utilizzare un vetrino di colorazione per ematina ed eosina corrispondente in cui è stata contrassegnata la regione di interesse per individuare il tessuto da campionare Tenere manualmente il blocco donatore in posizione con la mano sinistra e spingere il punzone con la mano destra. Non spingere sullo stiletto. L'arresto di profondità non blocca il movimento del punzone nella posizione corretta per il blocco donatore, quindi è importante smettere di spingere quando il secondo segno è visibile sullo stiletto.
Ruotare lentamente l'impugnatura del punzone una volta. Rilasciare la pressione verso il basso tenendo ancora premuto il blocco donatore sul ponte del blocco donatore. Rimuovere il ponte e il blocco donatore.
Assicurarsi che il punzone donatore sia allineato con il foro praticato in precedenza. Regolare la posizione del punzone utilizzando le viti di fermo. Se il punzone donatore e il foro nel blocco ricevente non sono allineati, spingere con cautela il punzone verso il basso fino a quando la sua punta non raggiunge la parte superiore del foro nel blocco ricevente.
Mantenendo questa posizione, utilizzare lo stiletto per svuotare il nucleo del tessuto nel foro. La superficie del nucleo deve essere allineata con la superficie del blocco. Sposta la torretta di nuovo sul punzone ricevente.
Passare alla posizione successiva con le manopole di regolazione XY e ripetere nuovamente il processo perforando un campione dal blocco ricevente fino al completamento dell'array. Per rimuovere il blocco ricevente, allentare le viti nel supporto. Mettere il blocco a faccia in giù su un vetrino, posizionarlo su un'apposita griglia e cuocere il blocco a 42 gradi per 40 minuti.
Rimuovere il vetrino e il blocco dal forno e appiattire la superficie del blocco accarezzando delicatamente il vetrino. Posizionare il blocco con il vetrino su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Rimuovere il vetrino dal blocco.
Il blocco è ora finito e pronto per il sezionamento. Dopo il sezionamento, la colorazione e la digitalizzazione del microarray tissutale con un anticorpo contro una proteina di interesse. Cerca la proteina nell'atlante proteico umano visitando il sito web www.proteinatlas.org.
Inserire il nome di una proteina di interesse, l'ID dell'ensemble, il numero di accesso all'uni prote o il nome HGNC, ad esempio insulina. Fare clic sulla proteina di interesse e scorrere verso il basso fino al riepilogo dei tessuti e degli organi normali. La panoramica mostra l'espressione proteica nel pancreas.
Fare clic sulla scheda. Altri dati sui tessuti. Verrà visualizzata la vista dei tessuti normali ordinati per organo.
Fare clic su pancreas per visualizzare i risultati IHC per tre anticorpi diretti verso la stessa proteina. Clicca su un'immagine per visualizzare un'immagine ad alta risoluzione del pancreas In questa figura, sono mostrati esempi della qualità dei microarray tissutali, un array dritto e correttamente allineato con spazio sufficiente tra le righe e le colonne e il bordo della paraffina. In questo caso, alcune carote sono troppo vicine al bordo, causando probabilmente problemi durante il sezionamento.
Questo microarray di tessuto è stato cotto troppo a lungo ed è collassato senza il modello corretto. Qui, una sezione correttamente tagliata con colonne diritte e allineate viene colorata con emato, toina ed eosina. Una lama difettosa o sporca potrebbe causare spaccature come mostrato qui o sezioni compresse come questa.
Le cellule del centro germinale nei linfonodi mostrano un anticorpo titolato in modo ottimale che determina una colorazione citoplasmatica specifica senza sfondo, come si vede qui. La colorazione negativa o debole si riscontra quando la concentrazione dell'anticorpo primario è troppo bassa o se la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunocolorati. Questa sezione di tessuto è sovracolorata a partire da una concentrazione troppo alta di anticorpi primari.
Il colore scuro provoca difficoltà nel determinare la posizione subcellulare a causa di spillover, reattività crociata e falsa positività. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un array di marcatori tissutali e come usarlo quando si analizza l'espressione proteica eseguendo l'immunoistochimica. Dovresti anche avere una buona comprensione di come sfogliare l'atlante delle proteine umane per l'espressione delle proteine nei tessuti e nelle cellule umane.
Panoramica
Le matrici microtissutali forniscono un metodo efficiente per raccogliere contemporaneamente informazioni da diversi tessuti per l'analisi dell'espressione proteica. Questa tecnica prevede l'assemblaggio di campioni rappresentativi di tessuto in un singolo blocco di paraffina, che viene successivamente sezionato per l'immunohistochimica e l'analisi mediante imaging digitale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Istologia
Sfondo
- Le microscaglie di tessuto permettono l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica.
- Questo metodo conserva il materiale biologico rispetto ai tradizionali metodi basati su singoli blocchi di tessuto.
- Migliora la riproducibilità e riduce i costi e i tempi di lavorazione.
- I dati generati possono essere integrati in risorse come l'Atlante delle Proteine Umane.
Scopo dello studio
- Dimostrare la procedura di creazione di microarray di tessuti.
- Analizzare i modelli di espressione proteica in diversi tessuti.
- Fornire un metodo standardizzato per l'analisi ad alto rendimento dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Selezione e marcatura di aree rappresentative da tessuti inclusi in paraffina.
- Prelievo di core di tessuto e assemblaggio in un blocco di microarray di tessuti.
- Esecuzione di immunohistochimica su sezioni dell'array.
- Analisi dei modelli di espressione proteica e pubblicazione dei risultati.
Risultati principali
- Assemblaggio riuscito di microarray di tessuti per l'analisi delle proteine.
- Dimostrazione di riproducibilità ed efficienza negli studi sull'espressione proteica.
- Integrazione dei risultati nell'Atlante delle Proteine Umane.
- Rappresentazione visiva dei modelli di espressione proteica mediante imaging digitale.
Conclusioni
- Le matrici microtissutali sono uno strumento prezioso per l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica.
- Questo metodo migliora l'efficienza e conserva i campioni biologici.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della distribuzione delle proteine nei tessuti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnologia degli array microtissutali consente l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica preservando materiale biologico limitato, sostenendo ampi sforzi di validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci. Integrando i dati in risorse pubbliche come l'Atlante delle Proteine Umane, questa tecnologia fornisce una base scalabile per la riduzione del rischio meccanicistico e l'identificazione di biomarcatori traslazionali in diverse aree di patologia. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta generando profili quantitativi riproducibili dell'espressione proteica a partire da campioni paziente limitati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in tessuti normali e patologici per chiarire i modelli di espressione del bersaglio.
- Valore operativo: Riduce il consumo di campioni biologici aumentando al contempo la produttività nelle campagne di screening di anticorpi o bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio fornendo evidenze precoci sulla specificità del bersaglio e sulla sua distribuzione nei tessuti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative standardizzate di immunohistochemica per la valutazione della specificità dei reagenti su centinaia di campioni di tessuto.
- Valore operativo: Permette condizioni di saggio riproducibili utilizzando un singolo protocollo di colorazione, riducendo al minimo la variabilità sperimentale in schermate su larga scala.
- Valore della piattaforma: Crea blocchi microarray riutilizzabili per il profilo longitudinale di pannelli proteici attraverso coorti di malattie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie analizzando l'espressione proteica in tessuti tumorali provenienti da coorti di pazienti ben annotati.
- Valore operativo: Facilita la validazione di biomarcatori mediante un'accurata sezionatura e l'imaging digitale di sezioni di TMA.
- Valore traslazionale: Supporta un avanzamento adeguato al rischio collegando l'espressione del bersaglio a dati di patologia clinica disponibili in database pubblici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La produzione di microarray di tessuti si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica, consentendo un profilo efficiente dell'espressione proteica su larga scala.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'analisi contemporanea dell'espressione proteica in diversi tipi di tessuto e stati patologici.
- Screening: Fornisce sezioni di tessuto pronte per il saggio e riproducibili, adatte a campagne di screening ad alto rendimento mediante immunohistochimica.
- Analisi: Genera dati quantificabili sull'espressione proteica attraverso l'analisi digitale delle immagini, permettendo la valutazione comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica mediante mappe dell'espressione proteica associate a campioni di pazienti annotati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e scalabile per un uso ripetuto in progetti multipli di validazione di anticorpi e caratterizzazione di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante l'analisi multiplex dei tessuti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori riducendo la variabilità da vetrino a vetrino.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale massimizzando il rendimento dei dati ottenuti da campioni clinici o preclinici limitati.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione basata sul rischio degli obiettivi sulla base di un profilo completo dell'espressione nei tessuti normali e malati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, manipolazione dei tessuti e tecniche di assemblaggio di microarray.
- Si basa su strumentazione di precisione per la perforazione dei core, l'allineamento e la sezionatura.
- Necessita di protocolli standardizzati per la colorazione, l'acquisizione delle immagini e l'annotazione dei dati al fine di garantire la comparabilità tra diversi studi.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a diversi sistemi modello o tessuti non umani.
- Comprende limitazioni pratiche relative all'allineamento dei core, all'integrità delle sezioni e all'ottimizzazione della colorazione, come indicato nelle dimostrazioni procedurali.
