Name: Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione Allinterno della Atlas proteina umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Impara a produrre microarrays tessuto per l'analisi dell'espressione proteica mediante immunoistochimica e digitalizzazione. Questo metodo consente studi ad alto rendimento preservando il materiale biologico.

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Questo lavoro è stato sostenuto anche da finanziamenti della Knut e Alice Wallenberg fondazione. Il personale dei centri di intere proteina umana Atlas a Uppsala, Stoccolma e India sono riconosciuti per i loro sforzi per generare l&#39;Atlante proteina umana. Gli autori desiderano ringraziare in particolare Frank Hammar e Sofie Gustafsson per l&#39;assistenza con la foto e Elene Karlberg per l&#39;assistenza con la produzione TMA durante le riprese.

1. Come preparare i tessuti per la produzione Tissue Microarray (Animazione 1) <ol><li> Selezionare rilevante materiale paraffina fissato in formalina incorporato (campioni di tessuto o cellula), compresa la corrispondente sezione di tessuto tinto ematossilina. </li><li> Segna un&#39;area rilevante del sezione di tessuto. Si raccomanda di avere una sezione appena tagliata tinto ematossilina corrispondente al blocco di paraffina. </li><li> Progettare il modello utilizzato per la produzione di TMA. Randomize i campioni all&#39;interno del modello al fine di evitare artefatti causati da problemi tecnici come la copertura degli anticorpi sull&#39;intera sezione TMA e problemi di sezionamento. Aggiungere marcatori di orientamento aggiuntivi al modello per l&#39;orientamento. </li><li> Organizzare i tessuti in base al modello. </li></ol> 2. Manuale di produzione Tissue Microarray (essenziale per le riprese) <ol><li> Per poter ottenere una lunghezza standardizzata dei nuclei di tessuto, segnare il mandrino ad esempio 4,5 mm (Figura 2). Guidelines per la distanza tra i centri di esempio: nucleo dimensioni 0,6 mm - 0,8-1,0 mm nucleo formato da 1,0 mm - 1,8-2,0 mm nucleo formato 1.5 mm - 2,0-3,0 mm nucleo dimensioni 2,0 millimetri - 2,5-4,0 millimetri Si raccomanda di lasciare margini 2,5-3,0 mm su ciascun lato del blocco paraffina per evitare la rottura della paraffina. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montare le punzoni selezionati da utilizzare. Inizia allentando le viti a testa esagonale che tiene il pugno al suo posto. Il punzone è posizionato correttamente quando la scanalatura nel mozzo punzone viene saldamente appoggiato l&#39;asta di metallo in plastica v-blocco. Fissare le viti e fare in modo che il bordo della clip in metallo è orizzontale. </li><li> Il punzone destinatario (contrassegnati in verde e rosso, specifico per il distributore) deve essere posizionato a sinistra. Il punzone donatore (contrassegnati in verde e blu, specifico per il distributore), che ha un diametro leggermente maggiore, dovrebbe essere collocato a destra (figura 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Spostare i pugni lungo i x e y assi utilizzando le manopole di regolazione XY. La manopola di regolazione destra sposta i punzoni lungo l&#39;asse x e la manopola di regolazione sinistra sposta i punzoni lungo l&#39;asse y. Vi è una lettura micrometro digitale su entrambe le manopole di regolazione. Questi vengono attivati ​​quando si spostano le manopole. </li><li> Ripristinare → premere il tasto ZERO / ABS pulsante. Spostamento tra i pollici e mm → premere il tasto IN / mm pulsante. Lo spazio tra i fori devono essere mm 2,0 (misurata tra i centri dei fori) quando si utilizza un punzone 1 mm per un modello 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Per assicurarsi di non spingere il pugno troppo in basso nel blocco, colpendo la cassetta e distruggendo il punzone, mettere una cassetta senza paraffina nel supporto e impostare la posizione di fondo del recipiente punzone a 1 mm sopra il fondo della cassetta utilizzando la vite di arresto di profondità alnell&#39;angolo in alto a sinistra della Z-guida (Figura 3). </li><li> Mettere il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il più piccolo cacciavite per serrare le viti. Non fissare le viti a stretto o la paraffina potrebbero staccarsi dalla cassetta. </li><li> Premere il punzone ricevente verso il basso di circa 5 mm nel blocco ricevente e utilizzare la maniglia in pugno per ruotare il pugno avanti e indietro una volta (Figura 3). Il buco sarà di 5 mm di profondità quando si spinge il punzone fino giù in blocco il più possibile. </li><li> Alleviare la pressione verso il basso spingendo lentamente, in modo che le molle può spostare il pugno alto. Utilizzare il mandrino per svuotare il punzone ed eliminare il nucleo di paraffina. </li></ol></li><li> Spostare il torretta per passare il punzone donatore (Figura 3). </li><li> Posizionare il ponte blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente (Figura 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Spingere la puntura donatoreh nella zona selezionata del blocco donatore. Utilizzare un corrispondente ematossilina ed eosina scivolo colorato in cui la regione di interesse è stato contrassegnato per individuare il tessuto che deve essere campionata. Manualmente tenere il blocco dei donatori in posizione con la mano sinistra e spingere il pugno con la mano destra. Si noti che non si dovrebbe spingere il mandrino. L&#39;arresto di profondità non blocca il movimento pugno nella posizione corretta per il blocco dei donatori, quindi è importante che si smette di spingere quando il secondo marchio è visibile sul mandrino. </li><li> Ruotare la maniglia sul punzone una volta (Figura 3). Rilasciare lentamente la pressione verso il basso tenendo premuto il blocco dei donatori sul ponte blocco donatore. </li><li> Il tessuto del donatore viene preferibilmente perforato 0,5 millimetri più corto del nucleo destinatario. Questo processo assicurare un allineamento regolabile dei nuclei sulla superficie blocco ricevente, evitando la perdita di tessuto valore rappresentativo. </li></ol></li><li> Rimuovere il ponte e il blocco donatore. FareAssicurarsi che il punzone donatore viene allineato con il foro che è stato fatto in precedenza (punto 4). È necessario regolare la posizione di perforazione utilizzando le viti, se il punzone donatore e il foro nel blocco destinatario non sono allineati. </li><li> Spingere con cautela il pugno verso il basso fino alla sua punta raggiunge la parte superiore del foro nel blocco destinatario. Mantenendo questa posizione, utilizzare il mandrino per svuotare il nucleo tessuto nel foro. La superficie di base deve essere in allineamento con la superficie del blocco. </li><li> Spostare la parte posteriore della torretta al punzone destinatario. </li><li> Passare alla posizione successiva, con le manopole di regolazione XY. </li><li> Ripetere dal 4c precedente punto fino a quando la matrice è completa. </li><li> Quando il blocco ricevente tutto è finito, allentare le viti del supporto blocco destinatario. Cuocere il blocco in 42 ° C per 40 minuti. Mettere il blocco con l&#39;area di sezionamento rivolta verso il basso su un vetrino. Posizionare il vetrino con il blocco sopra di un supporto provetta (o altra costruzione appropriati) e posto in tha forno. Dopo cottura, togliere il portaprovettoni dal forno e appiattire la superficie del blocco accarezzando delicatamente il vetrino. </li><li> Posizionare il blocco con il vetrino su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Per garantire tessuto rappresentante tutta la TMA un controllo di qualità su ogni sezione 50 ° viene eseguita. </li></ol> 3. Come TMAs Sezione (Animation 2) <ol><li> Tagliare 4 sezioni micron di spessore utilizzando un microtomo con sistema sezione di trasferimento (HM 355S, Microm). Il sistema può essere utilizzato con tutti microtomi correnti rotanti. Il sistema è costituito da un vettore lama con ponte integrato di trasferimento, un bagno di acqua riscaldata e una unità di controllo. Dalla lama le sezioni scivolare sulla superficie di trasferimento bagnata tramite un ponte di trasferimento in bagno d&#39;acqua. </li><li> Le sezioni devono essere prelevati da bagno d&#39;acqua subito dopo aver steso, per evitare la fusione dei punti sensibili del tessuto (es. tessuti lipidici ricchi come al seno e al cervello). Place la sezione su un vetrino SuperFrost. Il tempo le sezioni possono essere lasciate in acqua dipende dal tipo di paraffina e cera utilizzata la temperatura dell&#39;acqua. Il nostro laboratorio paraffina uso da HistoLab Products AB, che hanno un punto di fusione di 56-58 ° C e si consiglia una temperatura del bagno d&#39;acqua di 37-39 ° C. </li><li> Porre i vetrini in un portavetrini per l&#39;essiccazione a temperatura ambiente (RT) per tutta la notte. </li><li> I vetrini vengono cotti in 50 ° C per 12-24 ore. Utilizzando un microtomo senza STS si devono trasportare la sezione dalla lama di un bagno d&#39;acqua manualmente utilizzando ad esempio un pennello. </li></ol> 4. Test e procedura di titolazione per immunoistochimica (animazione 3) Ciascun anticorpo è stato sottoposto ad una procedura di prova standardizzata utilizzando appositamente progettati TMAs contenenti una miscela di tessuti e tipi di cellule differenti. L&#39;obiettivo è quello di valutare un protocollo immunostaining individuale e ottimizzata per ciascun anticorpo. Inizialmente una diluizione, sulla base formicamagazzino concentrazione ibody dell&#39;anticorpo primario viene testato. Il risultato di questa prova colorazione viene utilizzato per guidare ulteriori diluizioni e ottimizzazione del protocollo. <ol><li> Deparaffinizzazione e idratazione in etanolo xilene e graduale di acqua distillata vengono eseguite prima dell&#39;immunocolorazione. </li><li> Un passo di blocco per estinguere perossidasi endogena viene eseguita in 0,3% H 2 O 2 in etanolo al 95% per 5 minuti. </li><li> Indotto dal calore (Recupero di epitopi) viene eseguita in un tampone pH recupero 6, utilizzando una caldaia in pressione (camera Decloaking, Biocare Medical) come fonte di calore per 4 minuti a 125 ° C. Dopo aver completato ebollizione, vetrini rimangono nella caldaia pressione e vengono lasciate raffreddare a 90 ° C. Il tempo di elaborazione totale per HIER è di circa 45 minuti. </li><li> Se nessun risultato conclusivo è ottenuto nel test iniziale, ulteriori prove sono fatte in base al pattern di colorazione osservata 5 6. Uno studio pilota, nel HPA ad elevata capacità set-up, ha mostratoche il recupero antigene più utile dove HIER pH 6, ma altri metodi di recupero, come pre-incubazione con proteinasi, microonde e punto in tampone con pH maggiore o minore può naturalmente essere utilizzato. Modificando la condizione di IHC ad esempio cambiando i tempi di incubazione di anticorpi, le diluizioni degli anticorpi e diaminobenzidina (DAB) tempi di incubazione del pattern di colorazione può dare risultati più conclusivi. </li></ol> 5. Colorazione Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Tutte le incubazioni vengono eseguite a temperatura ambiente e questo protocollo può anche essere utilizzato in una configurazione manuale con gli stessi reagenti. <ol><li> Sciacquare in tampone di lavaggio. </li><li> Incubazione con Ultra V blocco per 5 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio. </li><li> L&#39;incubazione con anticorpo primario per 30 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Incubazione con rafano-perossidasi polimero marcato per 30 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Sviluppare in soluzione DABper 10 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Controcolorazione in Mayers ematossilina * per 5 minuti. Quando si utilizza un metodo progressivo di colorazione (ad esempio Mayers ematossilina) l&#39;intensità dipende dal tempo e non è necessaria differenziazione. Un metodo di colorazione regressiva esempio ematossilina di Harris richiede differenziazione per rimuovere il colorante in eccesso dai tessuti al fine di accentuare una struttura. </li><li> Sciacquare con acqua di rubinetto *. </li><li> Sciacquare con acqua di litio carbonato, diluito 1:5 dalla soluzione satura per 1 minuto *. </li><li> Sciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti *. </li><li> Le diapositive sono disidratati in etanolo graded e le diapositive sono coprioggetto (PeRtex, Histolab) </li></ol> Tutti i reagenti sono applicati ad un volume di 300 pl per vetrino. * I passi 10-14 sono fatte in uno strumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e coprivetrino è inoltre fatto in un sistema montavetrini (montavetrini Automated CV5030, Leica). 6. Come effettuare la scansioneuna diapositiva Il metodo di scansione di diapositive dipende dal scanner digitale viene utilizzato, questo protocollo definisce solo come eseguire la scansione di una diapositiva con il sistema di scansione automatica Aperio XT (Aperio Technologies). Nella proteina umana Atlas set-up 20x per il tessuto e 40x per le cellule vengono utilizzati. Scansione automatica potrebbe incontrare problemi di fuoco dovuti alla eterogeneità del tessuto e il numero di diversi tessuti inclusi in un TMA. <ol><li> Pulire il vetrino da polvere, colla e verificare la presenza di bolle d&#39;aria tra il vetrino e la sezione. In caso di rimontare bolle d&#39;aria della diapositiva. </li><li> Mettere il vetrino in un rack e posizionare il cestello nello scanner digitale. Il tempo per la scansione di un TMA a 20x è di circa 6 minuti. Un software di Aperio viene utilizzato per selezionare l&#39;area di interesse. Selezione del punto di messa a fuoco viene effettuata automaticamente all&#39;interno del software. Manualmente la selezione dell&#39;area di scansione e punti di messa a fuoco è inoltre possibile. </li><li> Dopo che l&#39;immagine hcome stato generato può essere utilizzato per la valutazione e la annotazione della colorazione immunoistochimica. Le immagini rimangono come un file risultato dell&#39;esperimento e può essere distribuito ai colleghi per le discussioni e ulteriormente utilizzati per la pubblicazione dei dati. Le immagini possono essere visualizzate in un software liberamente disponibile da Aperio. </li></ol> 7. Come per cercare il tuo Protein Favorite nell&#39;Atlante proteine ​​umane <ol><li> Sfoglia per <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Immettere il nome del vostro preferito proteine, Ensembl id, numero di accesso UniProt o insulina nome HGNC es. </li><li> Entrare nella pagina di riepilogo e scorrere verso il basso al tessuto normale e sintesi organo. La panoramica mostra l&#39;espressione della proteina nel pancreas. </li><li> Clicca su &quot;dati di tessuto più&quot;. Si entra nei tessuti normali visualizzare dove si possono vedere tutti i tessuti incluso ordinati per organo. </li><li> Clicca sul pancreas per visualizzare i risultati IHC per 3 anticorpi diretti verso la stessa proteina. Per visualizzare un high-risoluzione del pancreas click sull&#39;immagine. </li><li> Ulteriori informazioni espressione della proteina nel tessuto del cancro, le cellule e altri dati di convalida all&#39;interno del Atlas proteina umana può essere trovato navigando Human Protein sito Atlas. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Animazione 1. Come preparare i tessuti per la produzione di tissue microarray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animazione 1</a> . Animation 2. Come TMAs sezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animation 2</a> . Animazione 3. La tecnica immunoistochimica è descritta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animation 3</a> .<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale del processo all&#39;interno della proteina umana Atlas Uppsala. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figura 2. Stiletto donatori segnato per la lunghezza standardizzata di nuclei di tessuto, ad esempio 4,5 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figura 3. Micro-distributore tessuto manuale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di diversa qualità di TMA prodotte. (A) A diritta e correttamente allineata con TMA spazio sufficiente tra le righe e colonne, nonché al bordo della paraffina. (B) Un TMA con alcuni dei nuclei troppo vicino al bordo conseguente difficoltà probabili Durante il taglio. (C) Un TMA che sono stati cotti per too lunga con un conseguente crollo TMA senza il modello corretto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figura 5. Ematossilina e eosina TMAs macchiati. (A) una sezione opportunamente tagliato con colonne diritte e allineate e righe. Utilizzando una lama brutto o sporco potrebbe dar luogo alla suddivisione (B) o sezioni compressi (C). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figura 6. Titolazione di anticorpi. (A) Reazione cellule del centro in linfonodo mostra un anticorpo ottimale titolato con un conseguente colorazione citoplasmatica specifica (mostrata in marrone) senza fondo. (B) La sezione di tessuto presenta una debole colorazione. Colorazione negativa o debole si trova quando la concentrazione di anticorpo primario è troppo basso o se la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunocolorate. (C) La sezione di tessuto è overstained dovuto all&#39;uso di concentrazione troppo elevata di anticorpo primario. Il drisultati cromatici arca in difficoltà che determinano la localizzazione subcellulare per traboccare, attraversare reattività e falsa positività.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;immunoistochimica è di gran lunga l&#39;applicazione più comunemente utilizzato per TMA. La combinazione di IHC TMA e può essere utilizzato in diverse impostazioni, ad esempio alto throughput screening dei pattern proteici di espressione in tessuti 7 8 9 10 e cellule, studi biomarker basato su campioni di tessuto di grandi gruppi di pazienti 11 12 e più biologia tumorale base studi, tra cui diversi fenotipi / genotipi, stadi di differenziazione, la progressione e metastasi 13. Uno dei vantaggi di TMA è che il materiale da coorti di grandi dimensioni possono essere analizzati in una sola volta, entrambi gli esperimenti di risparmio prezioso materiale biologico e garantire più riproducibili. Inoltre, l&#39;uso di TMA tecnologia consente di risparmiare sui costi dei reagenti e dei tempi di elaborazione di laboratorio. Come TMA contiene solo una limitata quantità di tessuto, tessuto eterogeneità è un problema. A seconda del tipo di tessuto e domande da affrontare, diversi campioni possono essere necessarie dalla stessa specimen. Per i tessuti tumorali, l&#39;utilizzo di due a quattro nuclei da ciascun campione è raccomandato come è stato dimostrato di produrre un elevato grado di precisione nella rappresentazione di intere sezioni di tessuto 13 14. A seconda della composizione del tessuto diametro dei punzoni (da 0,6 mm a 2 mm) può essere regolata. I tessuti sono complessi e composto da due diversi tipi di cellule diverse, strutture e matrice extracellulare. La composizione di ogni tipo di tessuto diverso contenente una quantità variabile di grasso, vasi sanguigni, tessuto connettivo, cartilagine ecc influenzerà la pressione necessaria per la punzonatura e la raccolta core distinti. E &#39;quindi importante mettere in pratica tutte le fasi della procedura su materiale che non è di alcun valore, prima di produrre un TMA con i tessuti definiti per gli esperimenti previsti. Quando sezionamento una varietà di differenti tessuti entro un blocco TMA la composizione del blocco potrebbe influenzare la capacità di acquisire sezioni di alta qualità. Certain tessuti, ad esempio pelle, midollo osseo, grasso, cervello e del seno, render sezionamento del blocco TMA difficile per effetto delle differenze nella struttura effettuano come sezioni estendono nel bagno d&#39;acqua e come durezza differente è tagliato dalla lama ecc Si raccomanda pertanto ai tessuti di gruppo con caratteristiche simili, ad esempio il tessuto ricco di lipidi in una TMA, quando applicabile. La maggior parte dei tessuti tumorali sono in questo senso omogenea, che facilita il sezionamento di TMA cancro. Un metodo alternativo sezionamento per stabilizzare i nuclei microarray può essere impiegato nel maneggiare una TMA eterogenei con tipi di tessuti. L&#39;uso di un nastro adesivo può essere utile per evitare la perdita delle anime e ricaduta nella sezionata TMA. L&#39;uso di nastro adesivo dovrebbe essere impiegato con cautela, dato che il nastro può influenzare lo spessore dei nuclei sezionati e successivamente anche il risultato della colorazione IHC 15. Nella proteina umana Atlas set-up un modello di TMA di 9x8 (escluso marcatori) ar coree usato. È di fondamentale importanza per ottenere il massimo numero di sezioni e mantenere tutti i tessuti rappresentati in tutto il blocco. Per risparmiare reagenti e tempo di scansione, 2 sezioni sono posti su un vetrino consentendo un modello massimo di 9x8. Il repository principale per le informazioni di proteine, Universal Resource Protein 16 comprende circa 20,300 voci recensione proteina umana, di cui solo circa il 66% hanno le prove a livello della proteina. Anche per la maggior parte dei geni per le quali vi sono prove di esistenza a livello proteico, vi è scarsa o nessuna informazione sulla funzione della proteina e la distribuzione di espressione. Una sfida importante per il futuro è quello di analizzare il modello di distribuzione e l&#39;abbondanza relativa di queste proteine ​​sconosciute in vari tipi di tessuto umano. Le informazioni da banche dati come UniProt, ENSEMBL, i dati pubblicati da PubMed può essere utilizzato come guida per stabilire se i modelli di colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpireparti proteine ​​sconosciute rappresentano profili proteici effettivi della proteina bersaglio designato. Inoltre, diverse strategie di validazione altri sono necessari per garantire la funzionalità degli anticorpi, per la funzionalità degli anticorpi ad esempio in un array di proteine, Western blot, immunofluorescenza, immunoprecipitazione e pull-down esperimenti. Forse lo strumento più importante per la convalida di funzionalità anticorpo è quello di utilizzare anticorpi associati, cioè due differenti anticorpi sollevati contro separati, non sovrapponibili epitopi sulla proteina bersaglio stesso, per confrontare dosaggio specifico risultato 17. Sulla base delle informazioni raccolte, gli anticorpi sono testati e titolati secondo le norme IHC e l&#39;esperienza da testare e convalidare oltre 35.000 anticorpi nel progetto proteina umana Atlas. Per oltre 20% di tutti i geni con profili proteine, anticorpi dati appaiati (2 o più anticorpi diretti contro epitopi non sovrapposte sulla stessa proteina) è stata usata per determinare uno migliore stimacompagno del corrispondente modello di espressione della proteina. Anticorpi associati di fornire una strategia definitiva per la convalida specifiche tecniche immunoistochimiche basate su pattern di espressione delle proteine. Questa strategia è importante perché la moltitudine di differenti tessuti inclusi nel screening di base aumenta il rischio per la cross-reattività. Va inoltre notato che alcuni tessuti sono in generale più inclini a mostrare colorazione di fondo macrofagi esempio, muscolo liscio, tubuli distali nel rene e nel fegato epatociti. Ulteriori problemi da considerare includono variazioni nelle tecniche di lavorazione dei tessuti nel tempo per i tessuti prelevati da materiale d&#39;archivio, che possono causare falsi negativi o inappropriati positivi modelli di marcatura IHC. Questo fenomeno si riscontra anche in analisi ampia sezione. Sia i controlli negativi e positivi sono di vitale importanza e devono essere utilizzati quando possibile. Per studi più approfonditi comprese le analisi funzionali, linee di cellule con espressione forzata e specifica knock-down di tr corrispondentianscripts (tecnologia siRNA) può essere utilizzato per creare i controlli. Per ottenere risultati ottimali in IHC, è importante testare e utilizzare sistemi di recupero di antigene, poiché la fissazione in formalina induce modificazioni chimiche diverse, ad esempio reticolazione, idrolisi di basi di Schiff mascheramento l&#39;antigene 18. In conclusione, basate su anticorpi proteomica impiegano la tecnologia TMA e IHC è una potente strategia per generare dati di espressione di proteine ​​su larga scala. Il progetto Human Protein Atlas è stato istituito per creare una mappa di espressione della proteina umana in tessuti umani normali e tumorali. Lo scopo di questo progetto è quello di presentare una prima bozza di un Atlante completo proteina umana entro il 2015. Oltre a fornire profili proteici di organi e tessuti normali, questo sforzo fornisce anche un punto di partenza per progetti di ricerca biomedica, compresi gli sforzi clinici scoperta di biomarcatori. L&#39;obiettivo finale è quello di aggiungere uno strato successivo informazioni sulla sommità della sequenza del genoma umano che will essere cruciale per una più profonda comprensione della biologia sottostante vari stati di malattia, e fornire una base per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapeutici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampone citrato pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Anticorpo diluente </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP polimero HRP </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB più substrato del sistema </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Anticorpo primario Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers ematossilina </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PeRtex </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Manuale del tessuto micro Arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrument </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Waterfall microtomo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Immagine scanner automatico </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Sistema di colorazione automatizzato slitta </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Sistema di colorazione automatico scivolo per deparafinization e disidratazione </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Vetro montavetrini automatizzato </td><td> Leica BiosISTEMI </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking camera </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

produzione di microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione all&#39;interno della atlas proteina umana

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Il tessuto microarray (TMA) fornisce i mezzi per analisi ad alta produttività dei diversi tessuti e cellule. La tecnica viene utilizzata nell&#39;ambito del progetto proteina umana Atlas per l&#39;analisi globale dei modelli di espressione della proteina in tessuti umani normali, il cancro e linee cellulari. Qui vi presentiamo il montaggio di 1 core mm, recuperate dai tessuti al microscopio rappresentativi selezionati, in un unico blocco destinatario TMA. Il numero e la dimensione dei nuclei in un blocco TMA può variare da circa 40 mm a 2 conduttori centinaia di 0,6 mm core. Il vantaggio di utilizzare TMA tecnologia è quella grande quantità di dati può rapidamente essere ottenuti utilizzando un unico protocollo immunocolorazione per evitare variabilità sperimentale. È importante sottolineare che, solo quantità limitata di tessuto scarsa è necessario, che permette l&#39;analisi di grandi gruppi di pazienti 1 2. Circa 250 sezioni consecutive (4 um di spessore) può essere tagliato da un blocco di TMA e utilizzati per immunoistochimico staining per determinare specifici pattern di espressione di proteine ​​per 250 differenti anticorpi. Nel progetto proteina umana Atlas, anticorpi sono generati verso tutte le proteine ​​umane e utilizzato per acquisire profili proteici corrispondenti in entrambi i tessuti umani normali da 144 individui e tessuti tumorali di 216 pazienti diversi, rappresentano le 20 più comuni forme di cancro umano. Immunoistochimiche sezioni colorate TMA su vetrini vengono analizzati per creare immagini ad alta risoluzione da cui patologi in grado di interpretare e commentare il risultato di immunoistochimica. Le immagini, insieme con i corrispondenti patologia basati su dati di annotazione sono resi disponibili al pubblico per la comunità di ricerca attraverso la proteina umana Atlas portale ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figura 1) 3 4. La proteina umana Atlas fornisce una mappa che mostra la distribuzione e l&#39;abbondanza relativa di proteine ​​nel corpo umano. La versione attualesione contiene oltre 11 milioni di immagini con i dati per l&#39;espressione della proteina 12.238 proteine ​​uniche, corrispondenti a oltre il 61% di tutte le proteine ​​codificate dal genoma umano.

Microarray di tessuto permette un metodo efficace per ottenere informazioni contemporaneamente da una moltitudine di tessuti. Parti rappresentativi di tessuti sono assemblate in un singolo blocco di paraffina. Sezioni dal blocco sono utilizzati per immunoistochimica e analisi di schemi di espressione della proteina. Scansione digitale genera immagini corrispondenti per la distribuzione dei dati.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All&#39;interno della Atlas proteina umana

La tecnologia dei microarray tissutali (TMA) fornisce i mezzi per l'analisi ad alto rendimento di molteplici tessuti e cellule. La tecnica viene utilizzata all'interno della...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un metodo efficiente per ottenere contemporaneamente informazioni da diversi tessuti riguardo all'espressione proteica in un progetto ad alto rendimento come l'atlante delle proteine umane. Questo risultato si ottiene innanzitutto selezionando aree rappresentative di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Successivamente, le aree marcate vengono perforate e i core selezionati vengono assemblati in un unico blocco di paraffina, costituendo così un microarray di tessuto.Successivamente, vengono effettuati tagli dal TMA e viene eseguita l'immunoeistochimica. Infine, viene analizzato il profilo di espressione proteica e i dati vengono pubblicati sull'atlante delle proteine umane. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione proteica nei tessuti e nelle cellule mediante microarray di tessuti e immunoeistochimica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'esecuzione di immunohistochemia da singoli blocchi di tessuto paraffinato, è che si può conservare materiale biologico prezioso e gli esperimenti risultano più riproducibili. Un altro vantaggio di questa tecnica è che è possibile ridurre i costi di reperimento del materiale (ENT) e i tempi di lavorazione in laboratorio. A dimostrare questa procedura sarà Ian Call Bay, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio, per ottenere una lunghezza standardizzata dei core di tessuto.Contrassegnare lo stiletto. Si raccomanda di lasciare margini di 2,5-3,0 millimetri su ciascun lato del blocco di paraffina per evitare crepe nella paraffina durante il montaggio dei punzoni appropriati. Allentare le viti a testa esagonale che fissano il punzone e posizionare il punzone in modo che la scanalatura presente sul mozzo del punzone sia ben appoggiata contro la barra metallica nel blocco a V in plastica.Fissare le viti, assicurandosi che il bordo della clip metallica sia orizzontale. Inserire il punzone ricevente a sinistra e il punzone donatore a destra. Utilizzare le manopole di regolazione XY e i relativi indicatori digitali micrometrici per spostare i punzoni lungo gli assi X e Y.Per reimpostare la macchina, premere il pulsante zero a BS per passare da pollici a millimetri, premere il pulsante pollici-millimetri. Quando si utilizza un punzone da un millimetro per un modello 9x8, la distanza tra i fori deve essere di due millimetri misurata tra i centri dei fori, per evitare di spingere troppo in profondità il punzone ricevente e danneggiarlo; impostare la profondità massima di avanzamento del punzone posizionando una cassetta vuota nel supporto e utilizzando la vite di arresto della profondità situata nell'angolo in alto a sinistra della guida Z, regolando la posizione inferiore del punzone ricevente a un millimetro sopra il fondo della cassetta. Dopo aver selezionato e marcato l'area di interesse su una sezione di tessuto e progettato un modello per la produzione di microarray di tessuto, inserire il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il cacciavite più piccolo per serrare le viti.Evitare un eccessivo serraggio delle viti per prevenire il distacco del paraffina dalla cassetta. Spingere verso il basso il punzone ricevente di circa cinque millimetri all'interno del blocco ricevente e utilizzare la manopola del punzone per ruotarlo avanti e indietro. Successivamente, rilasciare lentamente la pressione verso il basso in modo che le molle possano sollevare il punzone.Utilizzare lo stilo per svuotare il punzone e scartare il nucleo di paraffina. Successivamente, spostare la torretta per passare al punzone donatore. Poi, posizionare il ponte del blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente.Utilizzare un vetrino colorato con ematossilina ed eosina corrispondente, in cui la regione di interesse è stata marcata, per individuare il tessuto da campionare. Tenere manualmente il blocco donatore in posizione con la mano sinistra e spingere la punta con la mano destra. Non spingere sullo stiletto. Il fermo di profondità non blocca il movimento della punta nella posizione corretta per il blocco donatore, quindi è importante smettere di spingere quando il secondo segno è visibile sullo stiletto.Ruotare lentamente una volta la manopola del punzone. Rilasciare la pressione verso il basso mantenendo ancora il blocco donatore sul ponte del blocco donatore. Rimuovere il ponte e il blocco donatore.Assicurarsi che il punzone donatore sia allineato con il foro realizzato in precedenza. Regolare la posizione del punzone mediante le viti di regolazione. Se il punzone donatore e il foro nel blocco ricevente non sono allineati, spingere con attenzione il punzone verso il basso finché la sua punta raggiunge la sommità del foro nel blocco ricevente.Mantenendo questa posizione, utilizzare lo stiletto per svuotare il campione di tessuto nel foro. La superficie del campione deve essere allineata con la superficie del blocco. Riportare la torretta alla punta per il punch ricevente.Spostarsi sulla posizione successiva utilizzando le manopole di regolazione XY e ripetere nuovamente il processo prelevando un campione dal blocco ricevente fino al completamento della matrice. Per rimuovere il blocco ricevente, allentare le viti nel supporto. Posizionare il blocco con la faccia verso il basso su un vetrino appoggiato su un rack appropriato e cuocere il blocco a 42 gradi Celsius per 40 minuti.Rimuovere la lamella e il blocco dal forno e appiattire la superficie del blocco passando delicatamente la lamella di vetro. Posizionare il blocco con la lamella di vetro su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Rimuovere la lamella di vetro dal blocco.Il blocco è ora completato e pronto per essere sezionato. Dopo la sezionatura, colorare e digitalizzare la matrice di microscaglie di tessuto con un anticorpo contro una proteina di interesse. Cercare la proteina nell'atlante delle proteine umane visitando il sito web www.proteinatlas.org.Inserire il nome di un insieme di proteine di interesse, l'ID di accesso UniProt o il nome HGNC, ad esempio, insulina. Fare clic sulla proteina di interesse e scorrere verso il basso fino al riepilogo dei tessuti e organi normali. La panoramica mostra l'espressione proteica nel pancreas.Fare clic sulla scheda. Altri dati sui tessuti. Verrà visualizzata la vista dei tessuti normali ordinata per organo.Fare clic sul pancreas per visualizzare i risultati dell'immunoistochimica (IHC) per tre anticorpi diretti verso la stessa proteina. Fare clic su un'immagine per visualizzare un'immagine ad alta risoluzione del pancreas. In questa figura, vengono mostrati esempi della qualità delle microscaglie di tessuto: qui si osserva una matrice dritta e correttamente allineata, con spazio sufficiente tra le righe, le colonne e il bordo del paraffina. In questo caso, alcuni dei core sono troppo vicini al bordo, il che probabilmente causerà problemi durante la sezionatura.Questo microarray di tessuto &egrave; stato cotto troppo a lungo ed &egrave; collassato per mancanza del corretto stampo. Qui, una sezione correttamente tagliata con colonne dritte e allineate &egrave; colorata con ematossilina, toina ed eosina. Una lama difettosa o sporca potrebbe causare fenomeni di scollamento come mostrato qui o sezioni compresse come questa.Le cellule del centro germinale nei linfonodi mostrano una titolazione ottimale dell'anticorpo, risultante in una colorazione citoplasmatica specifica senza sfondo, come mostrato qui. Una colorazione negativa o debole si osserva quando la concentrazione dell'anticorpo primario è troppo bassa o se la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunoistochimicamente colorati. Questa sezione di tessuto è sovra-colorata a causa di una concentrazione eccessiva dell'anticorpo primario.Il colore scuro provoca difficoltà nella determinazione della localizzazione subcellulare a causa di spillover, reattività incrociata e falsi positivi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre un array di marcatori tissutali e di come utilizzarlo nell'analisi dell'espressione proteica mediante immunohistochemia. Si dovrebbe inoltre avere una buona conoscenza su come navigare nell'atlante delle proteine umane per studiare l'espressione proteica nei tessuti e nelle cellule umane.

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Biologia

Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l'annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.

Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi

L'immunoistochimica è una potente tecnica di laboratorio per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine all'interno dei tessuti. Gli attuali metodi semi-automatici per la quantificazione introducono soggettività e spesso creano risultati irriproducibili. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'immunoistochimica multiplexata e la quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della co-localizzazione mediante imaging multispettrale.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.

Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

La proteina interagenti della W10 partecipa al checkpoint del mandrino mitotico e alla patogenesi del carcinoma. Qui, introduciamo una metodologia dell'immunostaining della WINT nei tessuti del cancro del polmone umano, seguita dalla scansione digitale di interi diapositive e analisi delle immagini. Questa metodologia può fornire immagini digitali di alta qualità e risultati affidabili.

Analisi digitale dell'immunostaining delle proteine che interagiscono con la W10 nei tessuti polmonari umani

Qui, descriviamo una strategia semplice e accessibile per visualizzare, quantificare e mappare le cellule immunitarie nelle sezioni del tessuto tumorale incorporate con paraffina. Questa metodologia combina le tecniche di imaging e analisi digitale esistenti con lo scopo di espandere la capacità di multiplexing e l'analisi multiparametrica dei saggi di imaging.

Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.

Profilazione spaziale dell'espressione di proteine e RNA nei tessuti: un approccio alla messa a punto della microdissezione virtuale

Questo protocollo delinea il metodo del nastro su come costruire manualmente un microarray di tessuto utilizzando blocchi di donatori FFPE di diverse profondità.

Costruzione manuale di un microarray di tessuti utilizzando il metodo a nastro e un microarrayer portatile

Nell'era dell'immunoterapia del cancro, l'interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un'analisi spaziale altamente multiplexata.

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

In questo articolo viene descritto un protocollo per l'immunofluorescenza multipla (mIF) manuale di amplificazione del segnale di tiramido (TSA) combinato con l'analisi delle immagini e l'analisi spaziale. Questo protocollo può essere utilizzato con sezioni FFPE (paraffina-embedded fissate in formalina) per la colorazione di due o sei antigeni per vetrino a seconda dello scanner di vetrini disponibile in laboratorio.

Immunofluorescenza multipla combinata con analisi di immagini spaziali per la valutazione clinica e biologica del microambiente tumorale

L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule...

Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

Impara a produrre microarrays tessuto per l'analisi dell'espressione proteica mediante immunoistochimica e digitalizzazione. Questo metodo consente studi ad alto rendimento preservando il materiale biologico.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All'interno della Atlas proteina umana

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