Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All'interno della Atlas proteina umana
31 maggio 2012
Microarray di tessuto permette un metodo efficace per ottenere informazioni contemporaneamente da una moltitudine di tessuti. Parti rappresentativi di tessuti sono assemblate in un singolo blocco di paraffina. Sezioni dal blocco sono utilizzati per immunoistochimica e analisi di schemi di espressione della proteina. Scansione digitale genera immagini corrispondenti per la distribuzione dei dati.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un metodo efficiente per ottenere contemporaneamente informazioni da diversi tessuti riguardo all'espressione proteica in un progetto ad alto rendimento come l'atlante delle proteine umane. Questo risultato si ottiene innanzitutto selezionando aree rappresentative di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Successivamente, le aree marcate vengono perforate e i core selezionati vengono assemblati in un unico blocco di paraffina, costituendo così una matrice di microtessuti.
Successivamente, vengono effettuati tagli dal TMA e viene eseguita l'immunohistochimica. Infine, viene analizzato il profilo di espressione proteica e i dati vengono pubblicati sull'atlante delle proteine umane. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione proteica nei tessuti e nelle cellule mediante microarray di tessuti e immunohistochimica.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'esecuzione di immunohistochemica da singoli blocchi di tessuto paraffinato, è che si può conservare materiale biologico prezioso e gli esperimenti risultano più riproducibili. Un altro vantaggio di questa tecnica è che è possibile ridurre i costi di reperimento del materiale (ENT) e i tempi di lavorazione in laboratorio. A dimostrare questa procedura sarà Ian Call Bay, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio, per ottenere una lunghezza standardizzata dei core di tessuto.
Contrassegnare lo stiletto. Si raccomanda di lasciare margini di 2,5-3,0 millimetri su ciascun lato del blocco di paraffina per evitare crepe nella paraffina durante il montaggio dei punzoni appropriati. Allentare le viti a testa esagonale che fissano il punzone e posizionare il punzone in modo che la scanalatura nel mozzo del punzone sia ben appoggiata contro la barra metallica nel blocco a V in plastica.
Fissare le viti, assicurandosi che il bordo della clip metallica sia orizzontale. Inserire il punzone ricevente a sinistra e il punzone donatore a destra. Utilizzare le manopole di regolazione XY e i relativi indicatori digitali micrometrici per spostare i punzoni lungo gli assi X e Y.
Per ripristinare l'apparecchio, premere il pulsante zero a BS per passare da pollici a millimetri, premere il pulsante pollici-millimetri. Quando si utilizza una punta da un millimetro per un modello 9×8, la distanza tra i fori deve essere di due millimetri misurata tra i centri dei fori, per evitare di spingere troppo in profondità la punta ricevente e danneggiarla; impostare la profondità massima di avanzamento della punta posizionando una cassetta vuota nel supporto e utilizzando la vite di arresto della profondità situata nell'angolo in alto a sinistra della guida Z, regolando la posizione inferiore della punta ricevente a un millimetro sopra il fondo della cassetta. Dopo aver selezionato e marcato l'area di interesse su una sezione di tessuto e progettato un modello per la produzione di microarray tissutali, inserire il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il cacciavite più piccolo per serrare le viti.
Evitare di stringere eccessivamente le viti per prevenire il distacco del paraffina dalla cassetta. Spingere verso il basso il punzone ricevente di circa cinque millimetri all'interno del blocco ricevente e utilizzare la manopola del punzone per ruotarlo avanti e indietro. Successivamente, rilasciare lentamente la pressione verso il basso in modo che le molle possano sollevare il punzone.
Utilizzare lo stilo per svuotare il punzone e scartare il nucleo di paraffina. Successivamente, spostare la torretta per passare al punzone donatore. Quindi, posizionare il ponte del blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente.
Utilizzare un vetrino colorato con ematossilina ed eosina corrispondente, in cui la regione di interesse è stata marcata, per individuare il tessuto da campionare. Tenere manualmente il blocco donatore in posizione con la mano sinistra e spingere la punta con la mano destra. Non spingere sullo stiletto. Il fermo di profondità non blocca il movimento della punta nella posizione corretta per il blocco donatore, quindi è importante smettere di spingere quando il secondo segno è visibile sullo stiletto.
Ruotare lentamente una volta la manopola sul punzone. Rilasciare la pressione verso il basso mantenendo ancora il blocco donatore sul ponte del blocco donatore. Rimuovere il ponte e il blocco donatore.
Assicurarsi che la punta donatrice sia allineata con il foro realizzato in precedenza. Regolare la posizione della punta mediante le viti di regolazione. Se la punta donatrice e il foro nel blocco ricevente non sono allineati, spingere con attenzione la punta verso il basso finché la sua estremità non raggiunge la sommità del foro nel blocco ricevente.
Mantenendo questa posizione, utilizzare lo stiletto per svuotare il campione di tessuto nel foro. La superficie del campione deve essere allineata con la superficie del blocco. Riportare la torretta alla punta per il punch ricevente.
Spostarsi sulla posizione successiva utilizzando le manopole di regolazione XY e ripetere nuovamente il processo prelevando un campione dal blocco ricevente fino al completamento della matrice. Per rimuovere il blocco ricevente, allentare le viti nel supporto. Posizionare il blocco con la faccia verso il basso su un vetrino appoggiato su un rack appropriato e cuocere il blocco a 42 gradi Celsius per 40 minuti.
Rimuovere la lamella e il blocco dal forno e appiattire la superficie del blocco passando delicatamente la lamella di vetro. Posizionare il blocco con la lamella di vetro su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Rimuovere la lamella di vetro dal blocco.
Il blocco è ora completato e pronto per essere sezionato. Dopo la sezionatura, colorare e digitalizzare la microscaglia di tessuto con un anticorpo specifico per una proteina di interesse. Cercare la proteina nell'atlante delle proteine umane visitando il sito web www.proteinatlas.org.
Inserire il nome di un insieme di proteine di interesse, l'identificativo di accesso UniProt o il nome HGNC, ad esempio, insulina. Fare clic sulla proteina di interesse e scorrere verso il basso fino al riepilogo dei tessuti e organi normali. La panoramica mostra l'espressione proteica nel pancreas.
Fare clic sulla scheda. Altri dati sui tessuti. Verrà visualizzata la vista dei tessuti normali ordinata per organo.
Fare clic sul pancreas per visualizzare i risultati dell'immunoistochimica (IHC) per tre anticorpi diretti contro la stessa proteina. Fare clic su un'immagine per visualizzare un'immagine ad alta risoluzione del pancreas. In questa figura, vengono mostrati esempi della qualità delle matrici microtissutali: un array dritto e correttamente allineato, con spazio sufficiente tra le righe, le colonne e il bordo del paraffina. In questo caso, alcuni dei core sono troppo vicini al bordo, il che probabilmente causerà problemi durante il taglio delle sezioni.
Questo microarray di tessuto è stato cotto troppo a lungo ed è collassato per mancanza del corretto stampo. Qui, una sezione correttamente tagliata con colonne dritte e allineate è colorata con ematossilina, eosina e tricromia. Una lama difettosa o sporca potrebbe causare fenomeni di sdoppiamento come mostrato qui o sezioni compresse come questa.
Le cellule del centro germinale nei linfonodi mostrano una titolazione ottimale dell'anticorpo, che determina una colorazione citoplasmatica specifica senza sfondo, come mostrato qui. Una colorazione negativa o debole si osserva quando la concentrazione dell'anticorpo primario è troppo bassa o quando la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunoistochimici. Questa sezione di tessuto è sovra-colorata a causa di una concentrazione eccessiva dell'anticorpo primario.
Il colore scuro provoca difficoltà nella determinazione della localizzazione subcellulare a causa di spillover, reattività crociata e falsi positivi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre un array di marcatori tissutali e di come utilizzarlo nell'analisi dell'espressione proteica mediante immunohistochimica. Si dovrebbe inoltre avere una buona conoscenza su come navigare nell'atlante delle proteine umane per studiare l'espressione proteica nei tessuti e nelle cellule umane.
Panoramica
Le matrici microtissutali forniscono un metodo efficiente per raccogliere contemporaneamente informazioni da diversi tessuti per l'analisi dell'espressione proteica. Questa tecnica prevede l'assemblaggio di campioni rappresentativi di tessuto in un singolo blocco di paraffina, che viene successivamente sezionato per l'immunohistochimica e l'analisi mediante imaging digitale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Istologia
Sfondo
- Le microscaglie di tessuto permettono l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica.
- Questo metodo conserva il materiale biologico rispetto ai tradizionali metodi basati su singoli blocchi di tessuto.
- Migliora la riproducibilità e riduce i costi e i tempi di lavorazione.
- I dati generati possono essere integrati in risorse come l'Atlante delle Proteine Umane.
Scopo dello studio
- Dimostrare la procedura di creazione di microarray di tessuti.
- Analizzare i modelli di espressione proteica in diversi tessuti.
- Fornire un metodo standardizzato per l'analisi ad alto rendimento dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Selezione e marcatura di aree rappresentative da tessuti inclusi in paraffina.
- Prelievo di core di tessuto e assemblaggio in un blocco di microarray di tessuti.
- Esecuzione di immunohistochimica su sezioni dell'array.
- Analisi dei modelli di espressione proteica e pubblicazione dei risultati.
Risultati principali
- Assemblaggio riuscito di microarray di tessuti per l'analisi delle proteine.
- Dimostrazione di riproducibilità ed efficienza negli studi sull'espressione proteica.
- Integrazione dei risultati nell'Atlante delle Proteine Umane.
- Rappresentazione visiva dei modelli di espressione proteica mediante imaging digitale.
Conclusioni
- Le matrici microtissutali sono uno strumento prezioso per l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica.
- Questo metodo migliora l'efficienza e conserva i campioni biologici.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della distribuzione delle proteine nei tessuti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnologia degli array microtissutali consente l'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica preservando materiale biologico limitato, sostenendo ampi sforzi di validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci. Integrando i dati in risorse pubbliche come l'Atlante delle Proteine Umane, questa tecnologia fornisce una base scalabile per la riduzione del rischio meccanicistico e l'identificazione di biomarcatori traslazionali in diverse aree di patologia. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta generando profili quantitativi riproducibili dell'espressione proteica a partire da campioni paziente limitati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in tessuti normali e patologici per chiarire i modelli di espressione del bersaglio.
- Valore operativo: Riduce il consumo di campioni biologici aumentando al contempo la produttività nelle campagne di screening di anticorpi o bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio fornendo evidenze precoci sulla specificità del bersaglio e sulla sua distribuzione nei tessuti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative standardizzate di immunohistochemica per la valutazione della specificità dei reagenti su centinaia di campioni di tessuto.
- Valore operativo: Permette condizioni di saggio riproducibili utilizzando un singolo protocollo di colorazione, riducendo al minimo la variabilità sperimentale in schermate su larga scala.
- Valore della piattaforma: Crea blocchi microarray riutilizzabili per il profilo longitudinale di pannelli proteici attraverso coorti di malattie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie analizzando l'espressione proteica in tessuti tumorali provenienti da coorti di pazienti ben annotati.
- Valore operativo: Facilita la validazione di biomarcatori mediante un'accurata sezionatura e l'imaging digitale di sezioni di TMA.
- Valore traslazionale: Supporta un avanzamento adeguato al rischio collegando l'espressione del bersaglio a dati di patologia clinica disponibili in database pubblici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La produzione di microarray di tessuti si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica, consentendo un profilo efficiente dell'espressione proteica su larga scala.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'analisi contemporanea dell'espressione proteica in diversi tipi di tessuto e stati patologici.
- Screening: Fornisce sezioni di tessuto pronte per il saggio e riproducibili, adatte a campagne di screening ad alto rendimento mediante immunohistochimica.
- Analisi: Genera dati quantificabili sull'espressione proteica attraverso l'analisi digitale delle immagini, permettendo la valutazione comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica mediante mappe dell'espressione proteica associate a campioni di pazienti annotati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e scalabile per un uso ripetuto in progetti multipli di validazione di anticorpi e caratterizzazione di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante l'analisi multiplex dei tessuti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori riducendo la variabilità da vetrino a vetrino.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale massimizzando il rendimento dei dati ottenuti da campioni clinici o preclinici limitati.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione basata sul rischio degli obiettivi sulla base di un profilo completo dell'espressione nei tessuti normali e malati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, manipolazione dei tessuti e tecniche di assemblaggio di microarray.
- Si basa su strumentazione di precisione per la perforazione dei core, l'allineamento e la sezionatura.
- Necessita di protocolli standardizzati per la colorazione, l'acquisizione delle immagini e l'annotazione dei dati al fine di garantire la comparabilità tra diversi studi.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a diversi sistemi modello o tessuti non umani.
- Comprende limitazioni pratiche relative all'allineamento dei core, all'integrità delle sezioni e all'ottimizzazione della colorazione, come indicato nelle dimostrazioni procedurali.
