Name: Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica In Vivo Lesposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Scopri come misurare il danno al DNA e la riparazione negli splenociti di topo dopo esposizione cronica a basse dosi di radiazioni beta e gamma. Questo metodo utilizza la citometria a flusso per quantificare l'H2AX fosforilato.

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Gli autori desiderano ringraziare i nostri colleghi Sandrine Roch-Lefevre ed Eric Gregoire dell'Istituto di Radioprotezione e Sicurezza Nucleare (Parigi, Francia). Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di Scienza e Tecnologia del Governo del Canada presso i Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), dal CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), dalla Canadian Nuclear Safety Commission e dall'Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parigi, Francia).

Tutte le procedure di manipolazione e di trattamento del mouse dovrebbero aderire alle regole stabilite dai programmi legislatore e / o la cura degli animali e approvati da un comitato di cura degli animali locale. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, con l&#39;approvazione del comitato di cura degli animali locale. ATTENZIONE: Tutti i lavori con la radioattività (tra cui, ma non solo, il trattamento del trizio, γ-irradiazione esterna, la gestione tessuti animali radioattivi, rifiuti biancheria da letto) deve rispettare le regole stabilite dalle autorità legislatore e / o di protezione dalle radiazioni ed è realizzato da personale autorizzato personale in un laboratorio e / o struttura certificata. 1. Lavoro Animal <ol><li> Raggruppamento degli animali <ol><li> Se i topi sono in arrivo da un organismo esterno, acclimatarsi animali per almeno 10 giorni nella struttura degli animali. Se lo studio include più gruppi di trattamento, in modo che il fornitore di animali in grado di inviare alanimali l come un unico lotto. </li><li> Casualmente allocare topi per gruppi di trattamento di 10 topi per gruppo. Se si utilizzano topi maschi del ceppo C57BL / 6, hanno il fornitore di animali pre-organizzare la randomizzazione di giovanissimi C57BL / 6 maschi nella loro struttura per attenuare i problemi di aggressione. </li></ol></li><li> L&#39;esposizione cronica di topi su Internal β-Radiation <ol><li> Preparare le concentrazioni di lavoro di trizio (10 kBq / L e 1 MBq / L) in acqua potabile del mouse diluendo lo stock originale di HTO e OBT (una miscela di prolina triziata, alanina e glicina acidi amminoacidi) soluzioni. </li><li> Convalidare le concentrazioni finali di trizio nell&#39;acqua potabile misurando la radioattività utilizzando un contatore a scintillazione liquida. Regolare concentrazioni, se necessario. </li><li> Trattare gli animali per un mese, fornendo l&#39;accesso ad libitum all&#39;acqua trizio. Se l&#39;acqua si sta scaricando il trattamento durante il periodo di due settimane, aggiungere più acqua. Altrimenti, modificare bottiglie a due settimane. </li><li> Trattare sham-irradiati controllotopi identico. Tenerli in una stanza separata &quot;pulito&quot; o su un telaio di montaggio &quot;pulito&quot; sotto pressione positiva per evitare trizio contaminazioni dall&#39;aria. </li></ol></li><li> L&#39;esposizione cronica di topi a γ-radiazioni esterne Nota: impianto γ-irraggiamento / attrezzatura varia a seconda della posizione. </li><li> Utilizzando metodi disponibili di dosimetria, determinare le distanze da una fonte γ-radiazioni che hanno campi di radiazione che producono le dosi desiderate. Garantire l&#39;omogeneità dei campi di radiazione all&#39;interno delle aree che coprono le gabbie per gli animali. Nota: 1,7 Gy / h è equivalente ad una dose prodotto da 1 MBq / L trizio nel corpo. </li><li> Esporre topi collocando gabbie topo alle distanze determinati nella fase 1.3.1 per un mese. Minimizzare interruzione giornaliera di γ-irradiazione a 30 min. Utilizzare dosimetri a termoluminescenza per misurare totale dosi assorbite. </li></ol> 2. Sacrifici e campionamento <ol&gt; <li> Preparare strumenti chirurgici sterili, 60 millimetri piastre di Petri con inseriti filtri di cellule di 70 micron, 15 ml e provette da 1,5 ml, i media RPMI integrato con siero fetale bovino 5% (FBS) e posto tutto all&#39;interno di un armadio di sicurezza biologica. Garantire la sterilità del lavoro è cruciale. </li><li> Dispensare 5 ml di media RPMI in ogni 60 millimetri Petri. </li><li> Sacrifica topo, utilizzando un metodo approvato dal comitato cura degli animali locale. Dislocazione cervicale è una buona scelta per il lavoro splenocyte descritto in questo protocollo. Tuttavia, se sono necessari campioni di sangue per gli altri test (ad esempio, per la mFISH, il micronucleo blocco citocalasina o altri dosaggi genetoxicity comune), utilizzare la puntura intra-cardiaca dopo l&#39;anestesia con isoflurano. </li><li> Posto l&#39;animale in decubito dorsale, con la testa rivolta lontano da voi. Spruzzare il mouse verso il basso con il 70% di etanolo. Utilizzando pinze, afferrare la pelle anteriormente all&#39;apertura uretrale e fare una piccola incisione con le forbici nella regione perineale. <ol&gt; <li> Da questa incisione, tagliare lungo la linea mediana ventrale alla cavità toracica, facendo attenzione a tagliare solo la pelle e non il muro muscolo sotto. Sezionare la pelle di distanza dalla linea mediana. </li><li> Afferrare la parete addominale con una pinza e tagliare lungo l&#39;asse mediano della parete muscolare per aprire la cavità addominale. </li></ol></li><li> Accise la milza con una leggera presa con una pinza sterile e delicatamente tirando su di esso e contemporaneamente tagliando via il tessuto connettivo con le forbici. </li><li> Tagliare un piccolo pezzo della milza (circa 1/10 della milza) e posto in una provetta da 1,5 ml. Snap congelare in azoto liquido per la successiva conservazione a -80 ° C per saggi supplementari. </li><li> Mettere il resto della milza in un colino cella all&#39;interno una capsula di Petri 60 mm Con 5 ml di mezzi già erogato RPMI. </li><li> Procedere alla prossima mouse. Nota: Estratto milze possono essere tenuti in 60 millimetri piatti con supporti (fino a 2 ore), mentre il resto dei topi sono Sacrificed. A seconda del numero di persone che partecipano, tra 5 e 15 topi possono essere elaborati in un giorno. </li></ol> 3. Preparazione delle Culture splenocyte <ol><li> Omogeneizzare la milza tritando dentro un colino cella con una pinza sterile con una estremità ricurva. </li><li> Rimuovere il filtro cellulare e raccogliere la sospensione cellulare filtrato dalla parabola di 60 mm nel tubo 15 ml. </li><li> Risciacquare il filtro cellule con 5 ml di media per raccogliere il resto delle cellule. </li><li> Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di RPMI. </li><li> Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di RPMI. </li><li> Trasferimento 4 ml di sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale da 25 ml e trasportarlo in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2, 80% di umidità) </li></ol> 4. Sfidare irradiazione e di fissaggio <ol><li> Trasferire ilrestante 1 ml di sospensione cellulare dal punto 3.8 in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Danno al DNA misurata in questo campione rappresentare sia un danno indotto dal trattamento e t = 0 dati punti per la costruzione di una curva di riparazione del DNA. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 300 ml di TBS. </li><li> Mentre miscelazione su un vortex a bassa velocità, aggiungere 700 ml di -20 ° C 100% di etanolo. Chiudere il coperchio e capovolgere un paio di volte per mescolare. </li><li> Conservare i campioni a -20 ° C. Splenociti fissati in etanolo possono essere conservati a -20 ° C per almeno 12 mesi senza alcuna perdita evidente nel segnale γH2AX. </li><li> Irradiare la cultura splenocyte dal punto 3.8 con un impegnativo γ-rad<html> Dose iation di 2 Gy in un dosaggio ≥ 200 mGy / min utilizzando disponibili dispositivo di irradiazione. Nota: Lo scopo di questo irradiazione è indurre DSB DNA per tentare la riparazione macchinari. I raggi X possono anche essere utilizzati per questo scopo. </li><li> Restituire immediatamente le culture per un incubatore CO 2. </li><li> 1 ora dopo la sfida 2 Gy di irradiazione, rimuovere le culture dal termostato di una cappa di sicurezza biologica. Per raccogliere un campione rappresentativo un&#39;aliquota, delicatamente risospendere cellule usando una pipetta e trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio. Riportare le colture cellulari di un incubatore CO 2. </li><li> Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5. </li><li> 24 ore dopo la sfida 2 Gy γ-irradiazione, raccolta e fissare a = campione 24 ore come descritto al punto 4,8-4,10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. immunofluorescente Etichettatura con Anti-γH2AX anticorpo Nota: in genere, 15-30 campioni al giorno possono essere immunofluorescently etichettati e dosati con citometria a flusso in un unico passaggio. Al fine di garantire un confronto accurato tra i gruppi di trattamento, includere campione (s) per ogni gruppo. Riferimenti 16 per ulteriori dettagli. <ol><li> Preparare una serie etichetta di tubi per il numero di campioni da processare e posto sul ghiaccio. Utilizzare 12 x 75 mm tubi di vetro senza cappuccio. La sterilità non è necessario per questo lavoro. Includere un campione di controllo storico aggiuntivo per l&#39;etichettatura con anticorpo secondario solo (&quot;solo 2 ° Ab&quot;). Utilizzare questo esempio di controllo storico in ogni citometria a flusso eseguito all&#39;interno di uno studio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di TBS ghiacciata a ciascuna provetta. </li><li> Rimuovere splenociti fissi da -20 ° C, vortex per 5 secondi e trasferire 0,5 ml aliquota da provette preparate con TBS. Mettere il resto dei campioni di nuovo in -20 ° C e stoccaggiomantenere come campione di backup. </li><li> Splenociti centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di ghiacciata TBS contenente 1% FBS </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TST (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Incubare per 20 min in ghiaccio. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di anticorpo anti-γH2AX primario diluito 1: 150 in tampone TST. Utilizzare 200 ml di TST per il &quot;solo 2 ° Ab&quot; campione di controllo. </li><li> Tubi posizione su un agitatore rotante a un angolo di 45 - 60 ° e agitare per 1,5 ore a 300 xg a RT. </li><li> Mentre tubi sono incubazione preparare un volume sufficiente (200 pl / campione) di capra anti-topo coniugato con anticorpo secondario Alexa-488 ad una diluizione 1: 200 in tampone TST. Nota: Tutti i lavori che coinvolgono Alexa-488anticorpo coniugato (passi 5,10-5,16 sotto) dovrebbe essere fatto in condizioni di luce fioca e campioni etichettati deve essere protetto dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio. </li><li> Una volta che il 1,5 ore di incubazione è completato, aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 2% FBS a ciascuna provetta e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS contenente 2% FBS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di soluzione di anticorpo secondario dal punto 5.8. </li><li> Incubare i campioni su una piattaforma che agita per 1 ora come al punto 5.7. </li><li> Aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 1% FBS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS ghiacciata. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 0,5 ml di TBS contenente 50 mg / mlpropidio ioduro. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. </li><li> Analizzare i campioni su un citofluorimetro utilizzando protocolli specifici dello strumento 16. Leggere almeno 10.000 cellule per campione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che non sono noti interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo presentato in questo documento è utile per lo svolgimento di grandi dimensioni del mouse scala studi in vivo che esaminano gli effetti genotossici di bassi livelli di vari agenti chimici e fisici, incluse le radiazioni ionizzanti. La nostra struttura unica specifica senza germe patogeno animale dotato di una GammaBeam 150 irradiatore e una sala lunga irradiazione 30 metro permette la conduzione di studi per tutta la vita che coinvolgono irradiazioni rateo di dose bassa o molto bassa su centinaia o...

Polemiche significativo sopra i potenziali effetti dannosi di una dosi basse o molto basse di radiazioni e la paura del pubblico delle radiazioni, guidata da immagini dei bombardamenti atomici di Hiroshima e Nagasaki e di incidenti impianti nucleari rari ionizzanti (aggravato dai mass media), ha portato a molto regolamento sulla radioprotezione rigorosa e standard che non sono potenzialmente scientificamente giustificata. Negli ultimi tre decenni, numerosi studi hanno documentato sia la mancanza di nocivo e la presenza di effetti biologici potenzialmente benefici indotti da radiazioni a basso dosaggio 1-4. Il principale fattore di rischio per la salute di radiazioni è la probabilità di cancro, stimato sulla base di studi epidemiologici di sopravvissuti alla bomba atomica che ricevono dosi medio-alti di radiazioni. Estrapolazione lineare di questi dati (cosiddetti lineare senza soglia o il modello LNT) viene utilizzato per stimare i rischi di cancro a basse dosi. Tuttavia, questo approccio non ha ricevuto l&#39;accettazione scientifica a livello mondialeed è fortemente dibattuto 5. E &#39;evidente che sono necessari ulteriori studi per chiarire questo punto e possibilmente migliorare gli standard di protezione dalle radiazioni. Tali studi dovrebbero coinvolgere trattamenti cronici (meglio ravvicinamento delle esposizioni ambientali e professionali), in modelli animali in vivo (migliore per gli effetti per la salute umana estrapolando) e tali end-point come la frequenza dei danni del DNA, riparazione del DNA e mutagenesi. E &#39;noto che il DNA è l&#39;obiettivo primario per danneggiare gli effetti delle radiazioni e incomplete o mis-riparazione può portare a mutagenesi e cancro sviluppo 6. DNA rotture del doppio filamento (DSB) sono uno dei tipi più deleteri di lesioni del DNA e possono portare a morte cellulare e tumorigenesi 7. È quindi importante poter affidabile e preciso misurare il livello di DSB dopo esposizione a radiazioni dose bassa e / o di altri fattori di stress, come le sostanze chimiche. Uno dei marcatori più sensibili e specificidi DSB DNA è fosforilata istone H2AX, chiamato γH2AX 8, ma altri indicatori e metodi sono stati suggeriti 9,10. Si stima che migliaia di molecole H2AX, in prossimità di un DSB indotto, sono coinvolti nella formazione del γH2AX consentire l&#39;individuazione dei singoli DSB, mediante l&#39;etichettatura immunofluorescenza con un anti-γH2AX anticorpi e microscopia a fluorescenza 11. La risposta è molto rapida, raggiungendo il massimo tra 30 e 60 min. Esistono prove che γH2AX facilita la riparazione del DNA DSB, attirando altri fattori di riparazione per i siti di pause e modificando la struttura della cromatina per ancorare le estremità del DNA rotto e l&#39;accesso di altre proteine ​​di riparazione (recensito in 12). Al termine della riparazione di DSB DNA, γH2AX viene de-fosforilata e / o subisce il degrado, e le molecole di nuova sintesi H2AX sostituire γH2AX nelle zone colpite della cromatina 10. Formazione e la perdita di γH2AX monitoraggio può,di conseguenza, fornire una stima accurata dei DSB DNA cinetica di riparazione. Questo approccio è stato utilizzato per studiare la riparazione di DSB in varie linee cellulari tumorali umane irradiate con dosi elevate di radiazioni e il suo tasso e livelli DSB residui hanno dimostrato di correlazione con radiosensibilità 13-15. Abbiamo modificato questo approccio sperimentale e applicata a un studio sui topi in vivo per esaminare gli effetti di basse dosi di γ- cronica e β-irradiazione sui livelli e di riparazione (Figura 1) DSB DNA. In primo luogo, abbiamo dimostrato un metodo per eseguire un lungo periodo di esposizione cronica di topi di β-radiante emessa da trizio (idrogeno-3) in forma di acqua triziata (HTO) o trizio organicamente (OBT) disciolto in acqua potabile . Le due forme dovrebbero accumulo e / o distribuire diverso nel corpo e, quindi, produrre diversi effetti biologici. Entrambe le forme sono potenziali rischi nel settore nucleare. Questo trattamentoè affiancata da esposizione cronica a γ-radiazioni ad una dose equivalente di consentire un corretto confronto tra i due tipi di radiazione, che è cruciale per la valutazione della loro efficacia biologica relativa. Beta-radiazioni è composto di elettroni, il che rende molto diversa dalla γ-radiazioni, fotoni ad alta energia. A causa di questa differenza, Β-radiazioni rappresenta pericolo per la salute principalmente interno e può produrre effetti biologici diversi rispetto a γ-radiazioni. Questa complicanza provocato controversie significativi rispetto alla regolazione di esposizione a β-radiazione emessa da HTO. Pertanto, i livelli di regolamentazione degli HTO in acqua potabile per il pubblico variano da 100 Bq / L in Europa a 75.000 Bq / L in Australia. È, quindi, importante confrontare gli effetti biologici di HTO a dosi equivalenti di γ-radiazioni. In secondo luogo, il tasso di DSB DNA viene misurata in splenociti isolati al completamento delle esposizioni croniche utilizzando immunofluorescently etichettato γH2AX rilevarecato mediante citometria di flusso. Ciò permette di valutare l&#39;entità del danno al DNA inflitto dalle esposizioni in vivo. Tuttavia, è ragionevole aspettarsi che tali esposizioni di basso livello non può produrre alcun tasso rilevabili di DNA DSB; invece, alcune modifiche nascosti / risposte si può aspettare che interesserebbe la capacità delle cellule per riparare i danni del DNA. Questi cambiamenti, se trovato, possono essere sia stimolante (producendo un effetto benefico) o inibitoria (producendo un effetto deleterio). Il protocollo proposto permette di rivelare tali cambiamenti sfidando i splenociti estratti con una dose elevata di radiazioni che produce una notevole quantità di danni (per esempio, 2 Gy producendo circa il 50 DNA DSB per cellula o un 3 -. Aumento di 5 volte del livello γH2AX totale) . Successivamente, la formazione e la perdita di γH2AX, che riflette l&#39;avvio e il completamento della riparazione DSB, è monitorato mediante citometria a flusso. In questo modo, non solo basale e livelli indotte dal trattamento di DSB DNA possono essere misurate, maanche il suo potenziale effetto sulla capacità delle cellule di rispondere e riparare i danni al DNA indotti da livelli molto più alti stressanti.

<table><tbody><tr><td>HTO: acqua triziata, [3H]</td><td>ottenuta localmente da un reattore nucleare&nbsp;</td><td></td><td>attività stock 3,7 GBq/mL;&nbsp; può essere sostituito con HTO di Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanina, L-[3-3H]: trizio legato organicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glicina, [2-3H]: trizio legato organicamente</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: trizio legato organicamente (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>acqua tritiata, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>sostituto dell'HTO di origine locale&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>L'irradiatore GammaBeam 150</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>prodotto localmente</td><td>può essere sostituito con un'altra sorgente di radiazioni g di attività sufficientemente bassa.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 con L-Glutammina e HEPES 500mL</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-gH2AX, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 capra anti-topo anticorpo</td><td>Life Technologies (precedentemente Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>iodio propidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P006-EAAN</td><td>Flaconi da 500 ml Etanolo assoluto</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 ml</td> Fisher <td>Scientific 2682550</td><td></td><td>provette per microcentrifuga</td></tr> da <tr><td>15 ml</td> Fisher <td>Scientific</td><td>05-539-5</td><td>provette sterili per centrifuga in polipropilene</td></tr><tr><td>azoto liquido</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm tubi di vetro senza tappo</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>tubi monouso in vetro borosilicato con estremità liscia</td></tr><tr><td>Palloni T25</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture 25ml pallone (fornitore n. 156340)</td></tr><tr><td>forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Forbici Wagner 12 cm pinze affilate/affilate</td></tr><tr><td>, dritto</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Pinza Semken 13 cm, pinza diritta</td></tr><tr><td>, curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Forcipe a schema stretto 12 cm, piastre</td></tr><tr><td>di Petri curve da 60 mm</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon piastra per coltura tissutale 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Filtri per cellule Falcon 50/caso</td></tr><tr><td>Ricetta PBS: 1 compressa sciolta in 200 ml di acqua deionizzata, regolare il pH a 7,4 se necessario.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>Ricetta TBS: per fare 10x brodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma cloridrato</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Cloruro di sodio</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Cloruro</td></tr> <tr><td>di potassioSciogliere in 1 L di acqua deionizzata, regolare il pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione danno al dna e ripristina in mouse splenociti dopo cronica<em&gt; in vivo</em&gt; l&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma radiazioni

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Esposizione radiazione bassa dose può produrre una varietà di effetti biologici che sono diversi nella quantità e qualità degli effetti prodotti dalle alte dosi di radiazioni. Affrontare le questioni relative alla sicurezza della salute ambientale, occupazionale e del pubblico in modo adeguato e scientificamente giustificata pesantemente si basa sulla capacità di misurare con precisione gli effetti biologici degli inquinanti a basso dosaggio, come ad esempio le sostanze ionizzanti radiazioni e chimiche. Danno al DNA e riparazione sono i più importanti indicatori precoci di rischi per la salute a causa delle loro potenziali conseguenze a lungo termine, come il cancro. Qui si descrive un protocollo per studiare l&#39;effetto di cronica esposizione vivo a basse dosi di γ- e β-radiazione sul danno e riparazione del DNA nelle cellule del mouse milza. Con un pennarello comunemente accettata di DNA rotture del doppio filamento, fosforilata H2AX istone chiamato γH2AX, dimostriamo come può essere utilizzato per valutare non solo i livelli di danno al DNA, ma cambia anchenella capacità di riparazione del DNA potenzialmente prodotto da basse dosi di esposizione in vivo. Citometria a flusso consente la misurazione veloce, precisa e affidabile di immunofluorescently etichettato γH2AX in un gran numero di campioni. DNA a doppio filamento break riparazione può essere valutata esponendo splenociti estratte ad una dose di 2 Gy impegnativo per produrre un numero sufficiente di DNA rompe per innescare riparazione e misurando l&#39;indotto (1 hr post-irradiazione) e danno al DNA residuo (24 ore post-irraggiamento). Danno al DNA residuo sarebbe indicativo di riparazione incompleta e il rischio di instabilità genomica a lungo termine e il cancro. In combinazione con altri metodi e punti finali che possono essere facilmente misurati in tali studi in vivo (ad esempio, aberrazioni cromosomiche, frequenze micronuclei in reticolociti midollo osseo, l&#39;espressione genica, ecc), questo approccio consente una valutazione accurata e contestuale degli effetti biologici dei fattori di stress di basso livello.

La figura 2 mostra esempi di citometria a flusso grafici previsti per splenociti preparate con il metodo descritto qui. Le cellule vengono prima gated in base alla &lt;elettronica scatter volume-side&gt; diagramma a dispersione (Figura 2A e 2D, il volume elettronico equivale a scatter in avanti). FL3 / Propidium istogrammi iodio (figura 2B e 2E) confermano distribuzione normale ciclo cellulare. Media segnale γH2AX calcolato utilizzando ...

Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il danno al DNA e la sua riparazione indotti in cellule della milza di topo da un'esposizione cronica in vivo a basse dosi di radiazioni beta o gamma. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto i topi a radiazioni beta interne o a radiazioni gamma esterne, in modo da innescare potenziali modifiche nel danno e nella riparazione del DNA. Come secondo passaggio, i linfociti PLE vengono isolati e irradiati con un'elevata dose di radiazione gamma, in grado di indurre un danno al DNA rilevabile, consentendo così il monitoraggio della riparazione del DNA.Nel tempo, le cellule della milza vengono quindi marcate immunofluorescentemente contro la gamma H2A.x per consentire la quantificazione del danno al DNA. In definitiva, il danno al DNA prodotto da dosi di radiazione gamma acuta pari a soli 10 centigray può essere misurato mediante citometria a flusso. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della radioprotezione, come ad esempio se basse dosi di radiazioni tipicamente riscontrate in ambienti lavorativi, medici o pubblici aumentino effettivamente la probabilità di effetti avversi sulla salute, q

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La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Qui si descrive in vivo mutagenesi saggio per un piccolo numero di cellule ematopoietiche purificate utilizzando il modello di topo transgenico LacI. Il gene LacI può essere isolato per determinare la frequenza, la posizione ed il tipo di mutanti DNA sorto spontaneamente o dopo l'esposizione a genotossine.

L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

La somministrazione di due analoghi della timidina, EdU e BrdU, nei topi in gravidanza permette l'analisi della progressione del ciclo cellulare in cellule progenitrici neurali e nel cervello embrionale mouse. Questo metodo è utile per determinare gli effetti dello stress genotossico, incluse le radiazioni ionizzanti, durante lo sviluppo del cervello.

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

Mantenere l'integrità del genoma dell'ovocita è necessario per garantire la fedeltà genetica nell'embrione risultante. Qui, presentiamo un protocollo accurato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule germinali femminili dei mammiferi.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Il protocollo descrive uno studio degli effetti sistemici e locali sulla pelle dell'esposizione all'ultravioletto B nei topi.

Studio dell'esposizione cronica dei topi alle radiazioni ultraviolette B 

Scopri come misurare il danno al DNA e la riparazione negli splenociti di topo dopo esposizione cronica a basse dosi di radiazioni beta e gamma. Questo metodo utilizza la citometria a flusso per quantificare l'H2AX fosforilato.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica In Vivo Lesposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni (Video) | JoVE Journal

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica

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