Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica In Vivo L'esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Viene presentato un protocollo per valutare i cambiamenti nei livelli di danno al DNA e nella capacità di riparazione del DNA che possono essere indotti dall'irradiazione cronica in vivo a basse dosi nei linfociti della milza di topo, misurando l'istone fosforilato H2AX, un marcatore di rotture del doppio filamento del DNA, utilizzando la citometria a flusso.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il danno e la riparazione del DNA indotti nelle cellule della milza di topo dall'esposizione cronica in vivo a basse dosi di radiazioni beta o gamma. Ciò si ottiene esponendo prima i topi all'irradiazione beta interna o gamma esterna per innescare potenziali cambiamenti nel danno e nella riparazione del DNA. In una seconda fase, i citi PLE vengono isolati e irradiati con un'elevata dose di radiazioni gamma che induce danni al DNA rilevabili per consentire il monitoraggio della riparazione del DNA.

Nel corso del tempo, le cellule della milza vengono quindi immunomarcate in modo fluorescente contro il gamma H due A x per consentire la quantificazione del danno al DNA. In definitiva, il danno al DNA prodotto da dosi di radiazioni gamma acute fino a 10 gradi centigradi può essere misurato mediante citometria a flusso. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della radioprotezione, come ad esempio se basse dosi di radiazioni tipicamente incontrate in un ambiente lavorativo, medico o pubblico aumentano effettivamente la probabilità di effetti dannosi per la salute come il cancro.

I principali vantaggi della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio dei focolai di gamma H e due A X con la microscopia a immunofluorescenza, sono che la nostra tecnica richiede molto meno tempo per l'analisi, il che la rende adatta per studi su animali su larga scala, e riduce le distorsioni correlate all'operatore nella quantificazione di gamma H e due A X. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la personalizzazione della medicina e della radioterapia del cancro e che la sensibilità radiofonica del singolo paziente può essere determinata utilizzando i linfociti del sangue periferico per regolare il regime posologico del paziente della radioterapia. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla tossicità delle radiazioni, può essere applicato anche ad altri studi come lo studio della tossicità degli inquinanti chimici ambientali o dei meccanismi fondamentali della formazione e della riparazione del danno al DNA nei topi in vivo.

Per l'irradiazione beta interna, trattare gli animali per un mese mediante accesso AD libitum all'acqua di trizio per l'irradiazione gamma esterna. Posizionare l'intera gabbia di topi alla distanza appropriata da una sorgente di radiazioni gamma in modo che corrisponda al tasso di dose dell'esposizione al trizio. Iniziare e mantenere l'esposizione per un mese.

Utilizzare dosimetri a termoluminescenza per misurare le dosi totali di assorbimento al termine dell'esposizione. Il giorno della raccolta della milza, posizionare un colino cellulare all'interno di una piccola capsula di Petri vuota per animale e aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI a ciascuna piastra. Quindi, metti un topo soppresso in posizione supina e spruzza il pelo con etanolo al 70% quando l'animale è stato completamente bagnato.

Usa una pinza per afferrare la pelle anteriormente all'apertura uretrale e praticare una piccola incisione nella regione perineale da questa incisione. Tagliare lungo la linea mediana ventrale fino alla cavità toracica, avendo cura di tagliare solo la pelle e non la parete muscolare sottostante. Sezionare la pelle lontano dalla linea mediana.

Quindi afferrare la parete addominale con una pinza. Tagliare lungo l'accesso mediano del muscolo per aprire la cavità addominale. Individua la milza e afferrala leggermente con una pinza sterile.

Quindi tirare delicatamente il tessuto e contemporaneamente imprecare via il tessuto connettivo. Rimuovere circa un decimo della milza per le analisi a valle. Quindi trasferire il resto del tessuto in uno dei filtri cellulari per un massimo di due ore dopo che tutte le milze sono state raccolte.

Utilizzare una pinza curva sterile per tritare ciascuno dei tessuti all'interno dei singoli filtri cellulari. Quando la milza è stata sufficientemente omogeneizzata, rimuovere i filtri e trasferire la sospensione cellulare filtrata in provette da 15 millilitri. Sciacquare ciascuno dei filtri con altri cinque millilitri di terreno, tirando i lavaggi con il resto delle sospensioni cellulari e centrifugare le celle due volte Resus, sospendendo i pellet in 10 millilitri di RPMI freschi ciascuno dopo la prima centrifuga.

Dopo il secondo giro. Risospendere i pellet in cinque millilitri di RPMI e trasferire quattro millilitri delle sospensioni cellulari risultanti in fiasche di coltura tissutale da 25 millilitri per l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con 80% di umidità. Trasferire il resto delle sospensioni cellulari in nuove provette da 1,5 millilitri e centrifugare celle a quattro gradi Celsius.

Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare con cura i surnatanti e risospendere delicatamente i pellet in un millilitro di tampone TBS e far girare nuovamente le celle dopo aver aspirato nuovamente il supinato. Reese sospende i pellet in 300 microlitri di TBS ciascuno. Quindi, mentre si vortica a bassa velocità, a 700 microlitri di meno 20 gradi Celsius, etanolo al 100% in ogni tubo.

Capovolgere i tubi un paio di volte per mescolare ulteriormente. Quindi conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un massimo di 12 mesi. Indurre rotture del doppio filamento di DNA per sfidare il macchinario di riparazione.

Irradiatore di coltura con due grigi di radiazioni gamma ad un tasso di dose uguale o inferiore a 200 mini gras al minuto. Subito dopo la sfida, rimettere la coltura nell'incubatore a CO2. Un'ora dopo, trasferire la coltura irradiata in una cabina di sicurezza biologica e utilizzare una pipetta per risospendere delicatamente le cellule.

Trasferire un millilitro della sospensione cellulare risultante in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio, quindi far girare le cellule. Utilizzare la pompa a vuoto per aspirare con cura il supinato e quindi sospendere delicatamente i pellet in un millilitro di TBS. Quindi, dopo un secondo lavaggio TBS, fissare le cellule in etanolo come appena dimostrato per la conservazione a meno 20 gradi Celsius per l'analisi in immunofluorescenza delle cellule.

Innanzitutto, aggiungere 0,5 millilitri di TBS ghiacciato alle provette del campione appropriate. Il prossimo aliquot del vortice Eloqua, un fattore fisso a meno 20 gradi Celsius ha immagazzinato i citi SPL per cinque secondi. Quindi trasferire 0,5 millilitri di celle nelle apposite provette e farle girare delicatamente verso il basso, rimettere in sospensione i pellet in un millilitro di TBS ghiacciato contenente l'1% di FBS e celle centrifughe.

Anche in questo caso, incubare i campioni in un millilitro di tampone TST per provetta su ghiaccio per 20 minuti. Dopo aver fatto girare le cellule, rimettere in sospensione i pellet in 200 microlitri di anticorpo primario anti gamma H a due assi. Quindi posizionare la provetta su un agitatore rotante con un angolo compreso tra 45 e 60 gradi per 1,5 ore a 300 volte G e a temperatura ambiente alla fine dell'incubazione.

Lavare i campioni due volte in un millilitro di TBS ghiacciato contenente il 2% di FBS. Quindi risospendere i pellet in 200 microlitri di anticorpo secondario appena preparato sulla piattaforma di agitazione. Dopo un'ora, lavare le cellule in un millilitro di ghiaccio chiamato TBS contenente l'1% di FBS, seguito da un lavaggio in un millilitro di ghiaccio chiamato TBS da solo.

Infine risospendere i pellet in 0,5 millilitri di TBS contenente ioduro di PROPIDIO In questi grafici vengono mostrati risultati citometrici a flusso rappresentativi Le cellule sono state prima gated in base al loro lato del volume elettronico. La colorazione con iodio propidio diffuso ha confermato che sia il campione di controllo che quello di sfida con le radiazioni hanno mostrato una distribuzione normale del ciclo cellulare. Mentre la misurazione del segnale gamma H a due assi ha dimostrato un aumento maggiore del doppio della rottura del doppio filamento di DNA all'interno delle due cellule grigie irradiate rispetto ai controlli non trattati qui, i livelli relativi di gamma H a due AX nei citi di topo, un'ora dopo l'esposizione ex vivo a basse o alte dosi di radiazioni gamma, sono mostrati come previsto.

Dopo la sfida dei due grigi è stata rilevata una forte triplice induzione di rotture a doppio filamento. Un lieve ma statisticamente significativo aumento è stato osservato dopo l'esposizione a 0,1 gray che indica una sensibilità sufficiente del metodo. Il marcato modello di fluorescenza simile a focolai osservato al microscopio indica che il segnale proviene dalle singole rotture del doppio filamento di DNA all'interno della cromatina CH, convalidando la specificità della colorazione.

Qui viene mostrato il livello di rotture del doppio filamento di DNA esibito dai citi PLE raccolti da topi esposti a un mese di acqua triziata. Sebbene il trattamento abbia comportato un aumento del 10% del livello basale di gamma H di due A X, il cambiamento non è stato statisticamente significativo. Inoltre, nessuna differenza nella formazione e perdita misurata di gamma H due assi.

Dopo la sfida che rappresenta la cinetica del DNA di riparazione del freno a doppio filamento sono stati osservati tra le cellule dei topi trattati con acqua triziata e il controllo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rispettare le regole e i regolamenti stabiliti dall'associazione locale per la protezione dalle radiazioni e di utilizzare un laboratorio o una struttura certificata in cui è possibile realizzare progetti di topi su larga scala utilizzando sorgenti di radiazioni sia interne che esterne. Una volta padroneggiate, queste tecniche richiedono solo circa un giorno e mezzo ogni 10 topi per essere completate se vengono eseguite correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'analisi citofluorimetrica dell'espressione di Gamma H due A X per misurare le rotture e la riparazione del filamento di DNA Doublet indotta in vivo dall'esposizione a basse dosi di trizio o radiazioni gamma. Oltre a questa procedura, altri metodi come la M FISH nei linfociti del sangue, il saggio MICRONUCLEUS del midollo osseo e R-T-Q-P-C-R per misurare l'espressione dei geni di risposta allo stress possono essere eseguiti per valutare i rischi per la salute associati all'esposizione a basse dosi di radiazioni.