Name: Diffuse spettroscopia ottica per la valutazione quantitativa di acuta radiazioni ionizzanti tossicità cutanee indotte Utilizzando un modello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Scopri la spettroscopia ottica diffusa per valutare quantitativamente l'eritema acuto da radiazioni in un modello murino. Questa tecnica non invasiva fornisce biomarcatori oggettivi per prevedere la tossicità cutanea nei pazienti sottoposti a radioterapia.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di ricerca assegnate a SKL da Abbott, CARO (Canadian Association of Radiation Oncologists), Uro-Oncologic Radiation Awards e dalla Alan E. Tiffin Foundation. EK è stato supportato dalla borsa di studio per laureati Frederick Banting e Charles Best Canada, dalla borsa di studio per laureati Scace in ricerca sul cancro alla prostata e dalla borsa di studio per studenti laureati Paul Starita.

I seguenti metodi sono in accordo con le linee guida del Animal Care Comitato Etico Sunnybrook Research Institute. Sistema 1. riflettanza diffusa Spettroscopia <ol><li> Raccogliere diffusa spettri di riflettanza utilizzando un palmare, sonda in fibra ottica e sistema di acquisizione spettroscopica portatile che è stato descritto in precedenza (Kim et al. 2010) e viene brevemente valutata in figura 1 (e relative didascalie) per completezza 1,2. </li></ol> 2. Preparazione del modello murino di acuta radiazioni danni alla pelle <ol><li> Ordine 6 settimane di età topi (preferibilmente senza peli, come atimici o SKH-1) e consentire loro di ambientarsi nella struttura animale per una settimana prima di iniziare gli esperimenti. Riserva almeno 3 topi per un gruppo di controllo non irradiato e 5 topi per un gruppo irradiato. </li><li> Prima di base misurazioni DOS e irradiazione, etichettare i topi utilizzando punzoni per le orecchie o permanente marcatore markings sulla coda. Se i topi non sono nudo, rimuovere i peli su un 2 cm di 2 cm zona di pelle fianco, ma questo può causare irritazione alla pelle. </li></ol> 3. diffusa Spettroscopia Ottica Acquisizione Dati <ol><li> Accendere l&#39;alimentazione dell&#39;elettronica. </li><li> Per la pelle del mouse, impostare i parametri del segnale per il software di acquisizione digitando in 25 msec per tempo di raccolta, 25 per la media dei segnali e 1 per la larghezza del filtro Boxcar. Questi parametri offrono un ragionevole equilibrio tra tempo di acquisizione e il segnale al rumore. </li><li> Utilizzando il software di acquisizione programmata personalizzato, acquisire automaticamente una lettura di fondo, R bg (LED spento) e riflettanza diffusa a due distanze di separazione sorgente-detector, di misura R (260 micron, 520 micron) facendo clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot;. Il tempo totale di acquisizione è ~ 2 sec. </li><li> Spegnere tutte le luci fluorescenti camera premendo l&#39;interruttore della luce camera prima di effettuare misurazioni. NOTA: flent luce della stanza interferisca con il segnale rilevato (queste luci producono una intensità luminosa variabile nel tempo e quindi è difficile per sottrarre un segnale di fondo). Sebbene lampadine ad incandescenza possono essere impiegati mantengono le luci ad una distanza dalla sonda DOS per evitare livelli di fondo elevati (e poveri segnale rumore). </li></ol> 4. anestesia degli animali e della linea di base DOS Misure <ol><li> Preparare la macchina per anestesia, assicurando che tutti i collegamenti siano livello isoflurano intatti e liquido è sufficiente. Utilizzare una camera di induzione dell&#39;anestesia con un tubo attaccato e cono che può essere registrato fino ad una superficie sterilizzato, morbidamente imbottito posizione comoda per raggiungere la sonda DOS. </li><li> Anaesthetize gabbie di topi alla volta nella camera di induzione inducendo con 4% isoflurano per 30 sec. Minore è la quantità isoflurano al 2% per il prossimo 2 min. Verifica che il mouse è anestetizzato osservando alcuna risposta da pizzicare un dito del piede della arti posteriori. </li><li> Velocementemuovere un mouse sull&#39;area tastatura DOS sterilizzato, posizionarlo su un fianco, fissare il muso nel cono naso e aprire il tubo naso cono al flusso di anestesia (2% isoflurano). NOTA: Se la procedura richiede più di 1 - 2 min, applicare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza. </li><li> Prima di acquisire misurazioni della pelle del mouse, sterilizzare la sonda strofinando con etanolo al 70%. Non sterilizzare la pelle. </li><li> Posizionare la sonda delicatamente sulla pelle del fianco avendo cura di evitare di disperdere la vascolarizzazione locale. Tenere la sonda a mano per la durata della misurazione. </li><li> Acquisire dati di riflettanza sondando una superficie cutanea fianco di circa 2 cm da 2 cm (zona da irraggiare) seguendo la formazione 5-dot su un dado. Mantenere questo sondaggio modello, zona, la pressione della sonda e laterale del corpo (sinistra o destra) coerente per tutte le misure successive. NOTA: La scansione completa richiede circa 60 sec. pressione sonda dovrebbe essere sufficiente per ottenere una scansione senza disperdere lOcal vascolare. </li><li> Spostare il mouse in una gabbia di recupero, e spostare il mouse vicino sopra alla zona di sondare DOS. Ripetere i passaggi 4,2-4,6 fino a quando tutti i topi sono stati misurati. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. </li></ol> 5. irraggiamento degli animali NOTA: Questo protocollo richiede l&#39;uso di un irradiatore, e preparazione animale può essere necessario regolare per soddisfare le esigenze del dispositivo irradiatore. Durante l&#39;irradiazione, solo la piccola zona di pelle del fianco deve essere esposto al fascio di radiazioni. L&#39;irradiatore deve essere collocato in una struttura sterile e appropriata sterilizzazione gabbia dovrebbe essere osservato al ritorno topi per la loro zona residenziale sterile. <ol><li> Preparare la macchina per anestesia (come nei passi 4.1 - 4.2) e anestetizzare un mouse alla volta nella camera di induzione prima di preparare per irradiazione. </li><li> Rimuovere il mouse dalla camera di induzione, gently pizzicare la pelle del nastro fianco e posto sopra e sotto la pelle tesa, formando un lembo. </li><li> Posizionare il mouse su un palco plexiglass e coprire il corpo con un giga piombo personalizzato (un disegno di lavoro è una scatola rettangolare con il fondo e almeno una estremità aperta, e una finestra laterale per consentire pelle fianco di essere tirato attraverso). Tirare il lembo cutaneo attraverso la finestra giga e il nastro delicatamente il lembo sul palco. NOTA: La maschera piombo personalizzato è abbastanza piccolo per immobilizzare il mouse. Se la dima personalizzato non immobilizzare completamente il mouse, quindi utilizzare la limitazione aggiuntivi e / o somministrare ketamina (80 - 100 mg / kg) e xilazina (10 - 12,5 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale di mantenere il mouse immobilizzato tutta la irradiazione procedura. </li><li> Posizionare la fase di plexiglass con la maschera e il mouse nella irradiatore. Determinare le impostazioni (pelle distanza dalla sorgente di raggi X, la tensione, la durata e l&#39;amperaggio) e consegnare la dose desiderata (ad esempio, 11 cm da un kVp X 160ray fonte per 2.5 minuti con 6,3 mA). NOTA: prestare attenzione con la sorgente di raggi X, seguendo le linee guida di utilizzo della macchina per evitare ustioni e danni al DNA. NOTA: topi nudi atimici sviluppano desquamazione umida circa 14 giorni dopo l&#39;irradiazione in risposta a 35 Gy, ma solo desquamazione a chiazze minore con 17 Gy. </li><li> Prendere l&#39;apparato e il mouse fuori dal irradiatore, rimuovere la schermatura, rimuovere il nastro e metterlo in una gabbia di recupero individuale. Ritorna il mouse per il suo normale gabbia condiviso dopo aver recuperato dal anestesia. Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per tutti i mouse, ed eseguire un&#39;operazione simulata su topi di controllo. </li><li> Dopo l&#39;irradiazione, ospitare gli animali nel loro condizioni normali. Se il comportamento anomalo sviluppa (ad esempio, la postura ingobbita, che può significare il dolore), consultare un veterinario per diagnosticare il problema. Alleviare il dolore può includere la somministrazione di 0,1 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina o come indicato dal veterinario. Se la perdita di peso supera il 20% del normale Body di massa, casa separatamente nella sua gabbia e di fornire alimenti di alta nutrienti. </li></ol> 6. Misure DOS di follow-up <ol><li> Monitorare e misurare l&#39;intensità reazione cutanea con la tecnica quantitativa DOS. Controllo visivo di cambiamenti della pelle e dei lavori precedenti suggeriscono che i grandi cambiamenti nei parametri DOS si può aspettare (rispetto al basale) a circa 6 - 12 giorni dopo l&#39;irradiazione 3,4. Tuttavia, dal momento che i cambiamenti apprezzabili possono avvenire anche prima o dopo a seconda del modello, altri punti di tempo di misura può essere utile per indagare. </li><li> Impostare attrezzature DOS e tarature come descritto nella sezione 3.Prepare la macchina per anestesia e acquisire misurazioni DOS come descritto nel paragrafo 4. </li></ol> 7. post-acquisizione Processing NOTA: Tutte le fasi di sezione seguente vengono eseguiti utilizzando un programma personalizzato creato in un ambiente software ad alte prestazioni. Standardizzata convento di denominazioneioni per ogni file di acquisizione spettrale sono impiegati per consentire l&#39;elaborazione in batch. Tutti i passaggi sono illustrati in Figura 2. <ol><li> Sottrarre la linea di base (rumore di fondo) da tutti gli spettri misurati tra cui la lettura di sfondo. </li><li> Sottrarre la lettura di fondo, R bg (LED spento), ottenuta al punto 3.3 dallo spettro di misura, di misura R. NOTA: Per il resto di questo articolo tutti gli spettri sono assunto come rumore di fondo e di fondo sottratti e utilizzati per R corr. </li><li> Convertire R corr di riflessione assoluto, R abs, come descritto nei riferimenti 1,2 nella sezione 1. <ol><li> Ottenere misure di riflettanza relativi, Rrel, in Intralipid-20% fantasmi (Fresenius Kabi, Svezia) fantasmi con l&#39;aumentare del 3% le frazioni aliquote fino al 48% (vale a dire, il 3%, 6%, 9%, ..., 48%) e creare di trama di Rrel funzione della concentrazione di Intralipid. </li><li> Generare una trama assoluto di abs R &amp; contro# 956; s &#39;utilizzando l&#39;equazione di diffusione per riflettanza 14. </li><li> Abbinare il picco di entrambe le curve e regolare la Rrel asse x per abbinare la R abs asse x. </li><li> Ad una data lunghezza d&#39;onda e la separazione sorgente-rivelatore, scalare l&#39;asse y utilizzando: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq2.jpg" /> NOTA: Nella sezione seguente, tutto il montaggio delle misurazioni farà riferimento a R abs. </li></ol></li></ol> Montaggio 8. spettrale dei dati NOTA: La sezione seguente delinea la teoria e l&#39;algoritmo raccordo utilizzato per estrarre i parametri funzionali della pelle topi. Per tutta la teoria impiegati, fare riferimento ai seguenti articoli 14-18 e riferimenti ivi. Tutte le equazioni sono assunte da programmare in un ambiente software scientifico di fascia alta (contenente moduli pre-programmata) comunemente usato in fisica o ingegneria laboratori. <ol><li> Programmare una funzione che descrive l&#39;unaspettro bsorption, μ un (λ) della pelle come la somma dei relativi cromofori individuali nella gamma spettrale di interesse utilizzando l&#39;equazione: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq4.jpg" /> Qui, H b è la concentrazione di emoglobina totale (g / L), mentre StO 2 è la saturazione dell&#39;ossigeno adimensionale che varia da 0 a 1. </li><li> Ottenere Oxy, <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq5.jpg" /> E deossi, <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq6.jpg" /> , Emoglobina spettri (memorizzati come file di testo) della collezione on-line di Prahl 19. </li><li> Programmare una funzione che descrive lo spettro dispersione di pelle, <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq7.jpg" /> , Utilizzando una dipendenza legge di potenza, dove A (cm -1) è il valore di μ s &#39;a λ o = 1 nm e k è un fattore di potenza dipende medio16. </li><li> Programmazione di una funzione matematica per il modello in avanti di riflettanza diffusa basato sulle equazioni di riferimento 14 che incorporano le equazioni spettrali da Piazza di 8,2-8,3 in funzione del modello in avanti (ad esempio, R (R, μ un (λ), μ s &#39;(λ )) = R (r, H b, StO 2, A, k). NOTA: Anche se esistono diversi modelli, l&#39;equazione di teoria della diffusione dello stato stazionario fornisce una descrizione semplice e accurata della distribuzione della luce nel tessuto. </li><li> Programmazione di una funzione che le piazze la differenza tra l&#39;attaccante modellata spettri di riflettanza dalla sezione 8.4 e gli spettri di riflettanza misurata. </li><li> Iterativamente cambiare H b, StO 2, A, e k fino al minimo funzione piazze differenza nella sezione 8.5 è più piccolo. lsqcurvefit di MATLAB può essere utilizzato per eseguire automaticamente questa operazione. </li><li> ripett passi 8.5 - 8.6 a ottenere i parametri DOS (H b, StO 2, A, e k) per tutti i set di dati di riflettanza misurati. </li><li> Tracciare la variazione relativa nel parametro DOS con la misura di riferimento unico che corrisponde con la media del set di ogni topo di 3 - 5 misurazioni in loco sonda normalizzati. Questi appezzamenti sono creati usando il comando plot di MatLab. </li></ol> 9. visiva radiazioni Dermatite punteggio Periodo <ol><li> Monitorare e segnare intensità reazione della pelle utilizzando una scala di valutazione qualitativa (vedi Douglas e Fowler scala di valutazione 20) dopo l&#39;irradiazione ogni 48 ore (si può anche osservare i cambiamenti 3 - 24 hr dopo irradiazione). Due investigatori in cieco sono l&#39;ideale. L&#39;acquisizione di fotografie con una macchina fotografica e di riferimento scala tenuto in mano (cioè, righello) può aiutare con le valutazioni. </li><li> NOTA: Scoring la pelle ogni due giorni dopo l&#39;irradiazione può aiutare a determinare ottimali tempi di misura DOS FOr il modello. Più frequente di punteggio può produrre dati importanti a seconda del modello e della ricerca domanda. </li><li> Tracciare la mediana di ogni gruppo in ogni punto. Confronta i gruppi in punti temporali specifici o aree mediana globale sotto ogni curva. </li><li> Dopo topi sono stati seguiti fino a guarigione della pelle che è desiderato (ad esempio, 4 settimane), eutanasia i topi in modo appropriato (approvato). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un approccio DOS per valutare quantitativamente tossicità cutanee radiazioni utilizzando biomarcatori ottici è stato presentato. sistemi di punteggio visivi tossicità cutanea richiedono una formazione di esperti e anche allora sono inclini a inter-osservatore variabilità e la soggettività. Il sistema di analisi e software per DOS è semplice da usare, richiede una formazione minima e restituisce parametri funzionali oggettivi per interpretare i cambiamenti fisiologici in pelle. Inoltre, invece di descrivere l&#39;aspetto di una lesione cutanea come un singolo parametro, DOS fornisce una ricchezza di informazioni in forma spettrale, ottiche e parametri funzionali / microstrutturali che offrono un grado aggiunto di sensibilità e specificità non disponibile nel attuali metodi di punteggio qualitativo. Le sezioni 1 e 7 evidenziano le principali fasi di lavorazione per l&#39;ottenimento di dati spettrali assoluti che possono essere utilizzati per il montaggio quantitativa dei biomarcatori ottici. Background e basale sottrazione sono essenziali per consentire all&#39;utente di eseguirele misurazioni DOS in normali condizioni di luce. Sezione 8 fornisce i modelli ed equazioni necessarie per descrivere topi atimici prima e dopo l&#39;irraggiamento x-ray necessarie. Qui, la scelta di assorbitori appropriati è fondamentale per una descrizione accurata di spettri misurati. E &#39;consigliabile che l&#39;utente indagare a fondo nella letteratura assorbitori chiave che dominano la gamma di lunghezze d&#39;onda e tessuto di interesse utilizzato in un dato studio prima della costruzione di un modello di raccordo biomarker ottica. Infine, le sezioni 3-5 descrivono il trattamento dei topi atimici durante l&#39;acquisizione DOS. Per evitare di interrompere la vascolarizzazione locale, utilizzare dolce forza per posizionare la sonda DOS sulla superficie della pelle del mouse. Mentre relativamente poco costoso rispetto ai sistemi di telecamere iperspettrali 3,4, un chiaro limite dell&#39;approccio DOS descritto è l&#39;uso di una sonda punto per la misurazione di riflettanza diffusa. Questa necessità di geometria riflettanza delicato contatto con la pelle eha il potenziale per introdurre incertezza di misura disperdendo il sistema vascolare, se coerente pressione Sonda-pelle non è impiegato. progetti futuri della sonda DOS possono incorporare un sensore di pressione per mantenere i risultati coerenti. Inoltre, mentre l&#39;uso di close sorgente-detector separazione (&lt;2-3 mm) consente profondità di sondaggio ottici specifici alla superficie della pelle, la migliorata specificità giunge in una perdita di risoluzione spaziale rispetto al 2D imaging iperspettrale. Per ridurre al minimo questa limitazione, una scansione quadranti 5 punti che cattura il volume irradiato generale è stato impiegato. Nonostante la mancanza di risoluzione spaziale, lavori precedenti nei topi 5 ha dimostrato la capacità di biomarcatori ottici media su un&#39;area sparse per differenziare non solo la pelle irradiato e non irradiato, ma anche l&#39;impatto di skin sparing farmaci interventistiche quali Vasculotide 6. Occorre notare che mentre il disegno complessivo sistema può essere modificato per la pelle diversa<html> modelli, la forma sottostante base spettri e dispersione possono avere bisogno di essere ottimizzato. In particolare, mentre ossi- e deossi-Hb e designare un modello di topo atimici, l&#39;applicazione dello stesso modello di pelle più scura possono richiedere l&#39;aggiunta di melanina per montaggio ottimale. Inoltre, l&#39;estensione del DOS banda per lunghezze d&#39;onda più elevate&gt; 950 nm richiederebbero l&#39;aggiunta di acqua, che domina a lunghezze d&#39;onda maggiori. Inoltre, i modelli animali con diversi spessori di pelle possono richiedere una diversa separazione alla fonte-detector per ottimizzare la sensibilità di profondità. Infine, la caratteristica glabro rende algoritmi più semplice. Anche se i modelli non senza peli possono essere ottimali per alcune domande di ricerca, essi richiedono la rimozione dei capelli prima misure DOS, e irritazione della pelle da questo processo possono influenzare i risultati. Per la ricerca in cui la funzione immunitaria totale è di fondamentale importanza, un mouse senza peli immunocompetenti (ad esempio, SKH-1) può servire come un modello migliore per la sua natura eutimia. ent &quot;&gt; Considerazioni importanti per le misure della sonda DOS sono coerenti RT e la stima della zona irradiata. fluttuazioni di temperatura possono influenzare il tessuto Hb e STO 2 livelli. Misurare un gruppo di 3 animali non irradiati in ogni momento la raccolta dei dati può servire come base per che indesiderate fluttuazioni ambientali nei valori dei parametri possono essere normalizzati. Inoltre, l&#39;area irradiata può essere difficile da stimare (se preparati lembo cutaneo non erano coerenti) prima che il danno comincia a manifestarsi visivamente intorno al giorno 5 (40 Gy). Se si utilizza pennarello indelebile nero per dot i confini della pelle radiazioni esposta, evitare l&#39;uso di inchiostro eccessiva per evitare sbavature d&#39;inchiostro, che può compromettere le letture. Una caratteristica aggiunta del sistema è la capacità di separare assorbimento dalla proprietà dispersive. Mentre i sistemi di imaging iperspettrale alternativi forniscono anche la possibilità di monitorare oxyHb e la concentrazione di emoglobina, la geometria dello spazio libero di iperspettrale di imaging I<html> s in grado di risolvere i cambiamenti di scattering. Questa limitazione può comportare imprecisioni nella tornata oxyHb, Hb e STO 2 parametri se i cambiamenti significativi nella dispersione verificano a causa di eritema (arrossamento). Inoltre, il monitoraggio dei cambiamenti di scattering utilizzando DOS potrebbe fornire biomarcatori ottici supplementari per la valutazione eritema. Come mostrato in figura 6, i risultati iniziali da Yohan et al. (2014) indicano che A e k mostrano una tendenza temporale dopo le radiazioni ionizzanti che non correlano con tendenze osservate da altri metodi alternativi, come sistemi di valutazione visiva. Ciò indica che i cambiamenti di scattering non si manifestano in modo visivamente descrittivo e possono essere infatti descrivono un processo biologico separata. Pertanto, rispetto ai metodi alternativi, DOS offre una risoluzione elevata per le modifiche di scattering superficiali, un viale per indagare nuovi biomarcatori di danno della pelle che può essere separato dai soliti misure Hb-based. jove_content &quot;&gt; Anche se il nostro modello si avvale di una grande dose singola di radiazioni (anziché più piccole dosi frazionate che vengono utilizzati in ambito clinico), questo imita la fisiopatologia di acuta radiotossicità pelle umana 21. E &#39;previsto che con un&#39;ulteriore ottimizzazione, DOS può fornire un approccio quantitativo per il punteggio automatizzata e standardizzata di reazioni cutanee indotte dalle radiazioni. Dopo aver imparato questa tecnica, le future applicazioni può includere il monitoraggio delle differenze tra la pelle terapie risparmiatori (ad esempio, confrontando i livelli oxyHb tra un controllo e trattamento sperimentale per la radioprotezione della pelle, o per la promozione la guarigione delle ferite ). Mentre ideale per screening di farmaci ad elevata capacità in modelli animali, il sistema DOS è potenzialmente adattabile all&#39;ambiente clinica a causa della facilità di usabilità e la capacità di misurare in condizioni normali di illuminazione. in questo caso, il disegno sonda può richiedere modifiche minori con un po &#39;più grandi separazioni optode per tenere conto dil&#39;aumento di spessore della pelle umana. Un sistema DOS clinica permetterebbe per la valutazione on-line di terapie interventistiche che potrebbe ridurre al minimo le reazioni cutanee dolorose e migliorare il comfort del paziente e la conformità. In futuro, potrebbe essere interessante per espandere la quantificazione DOS-based per le caratteristiche di radiazione indotta danni alla pelle cronica (ad esempio, fibrosi).

I miglioramenti tecnologici in radioterapia pianificazione (RT) e la consegna ora consentono di dosi terapeutiche altamente conformazionale da consegnare alla regione tumorale, evitando contemporaneamente le normali strutture circostanti. Tuttavia, tossicità acuta ea volte gravi sono inevitabili quando il bersaglio dose elevata è in prossimità alla pelle. Se abbastanza grave, il danno ai tessuti normali risultante può influenzare negativamente il risultato del trattamento RT e la qualità della vita dei pazienti 1,2. Nonostante le conseguenze negative, la gestione attuale di eritema cutaneo radiazioni rimane aspecifica, utilizzando creme o unguenti che ignorano i meccanismi biologici sottostanti che portano a danni. Questi approcci sono basati su minimizzando sintomi piuttosto che la causa. Inoltre, i tempi e la somministrazione di terapie interventistiche è complicata dalla natura qualitativa e personale di valutazione radiazioni lesioni della pelle. Mentre molti riconosciutoorganizzazioni (RTOG, EORTC) fornire raccomandazioni ottiche di classificazione, le istituzioni variano nella loro scelta di punteggio preferita, oscurando così il confronto di normali tossicità dei tessuti ai fini della meta-analisi. Inoltre, tali sistemi di classificazione sono grezzo e soggetti a variabilità inter-osservatore, in modo tale che le differenze di radiazioni gravità delle lesioni possono essere indistinguibile in studi che valutano strategie di riduzione della tossicità. Piuttosto che descrivere visivamente il grado di eritema in pelle irradiato, un approccio alternativo è quello di misurare parametri che descrivono quantitativamente i sottostanti cambiamenti fisiologici che si verificano nell&#39;organo. Emoglobina (Hb), tessuto saturazione di ossigeno (STO 2) o livelli di emoglobina ossigenata (oxyHb) sono stati utilizzati come proxy per l&#39;eritema irradiazione indotta nei topi 3-6. A seguito di irradiazione, totale i livelli di emoglobina sono sottoposti a fluttuazioni, ma oxyHb o StO 2 subiscono una caratteristica forte aumento precoce, seguita da unacadere e un altro 3,6 rialzo più persistente. Quando irritanti vengono utilizzati per indurre eritema, livelli oxyHb vascolari correlano direttamente con la gravità della eritema locale e infiammazione 7. Diffuse spettroscopia ottica (DOS) impiega la luce nel vicino infrarosso per fornire informazioni funzionali sui componenti biochimici e microstrutturali dei componenti vitali tessuti. Questa tecnologia ottica non invasiva quantitativa offre un metodo per misurare la vasodilatazione indotta da citochine in vasi sanguigni che si verificano durante l&#39;eritema via surrogati funzionali di concentrazione Hb e StO 2. Recenti studi confrontando DOS parametri misurati con metodi di punteggio clinici controllati 8-11 indicano la potenzialità della tecnica per superare le limitazioni inerenti alla classificazione corrente sistemi. Qui si descrive un portatile, sistema DOS in-house che impiega surrogati funzionali per quantitativamente detedifferenze cting di tossicità cutanea indotta da radiazioni in un topo modello preclinico 5. La piattaforma descritto può fornire un mezzo di punteggio dell&#39;eritema standardizzati ad alta sensibilità per la diagnosi precoce e sottile differenziazione di risposta ai farmaci interventistica. Inoltre, con solo minimi adattamenti, la strumentazione può eventualmente essere impiegata clinicamente per il monitoraggio comodino tempo reale.

<table><tbody><tr><td>Topi nudi</td><td>ad esempio, Charles River</td><td>Nudo atimico Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, o nudo immunocompetente Crl:SKH1-Hrhr</td><td></td></tr><tr><td>Irradiatore di piccoli animali&nbsp;</td><td>ad esempio, Faxitron X-Ray Corp.</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia animale&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se si utilizza un vaporizzatore di isoflurano con camera di induzione, è necessario un tubo e un cono.</td></tr><tr><td>Maschera di piombo e tavolino in plexiglass</td><td>Realizzato</td><td></td> su misura <td>Se il dispositivo irradiatore espone l'intero corpo dell'animale alle radiazioni, è necessario utilizzare una schermatura in piombo per esporre solo il lembo di pelle.</td></tr><tr><td>Nastro medico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennarello indelebile/perforatore</td><td></td><td></td><td></td>per orecchie</tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc., Natick, MA</td><td></td><td>con StatisticsToolbox&nbsp;</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments, Vaudreuil-Dorian, QB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOS system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplexer ottico</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modello MPM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modello S200</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di luce bianca</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modello LS-1</td><td></td></tr><tr><td>Intralipid-20%</td><td>Kabi Pharmacia, New York, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard di riflettanza</td><td>INO, Quebec City, QB</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diffuse spettroscopia ottica per la valutazione quantitativa di acuta radiazioni ionizzanti tossicità cutanee indotte utilizzando un modello di topo

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Le tossicità cutanee acute da radiazioni ionizzanti (IR) sono un effetto collaterale comune dei cicli terapeutici di radioterapia a fasci esterni (RT) e hanno un impatto negativo sulla qualità della vita del paziente e sulla sopravvivenza a lungo termine. I progressi nella comprensione dei percorsi biologici associati alle normali tossicità tissutali hanno permesso lo sviluppo di farmaci interventistici, tuttavia, gli attuali studi di risposta sono limitati dalla mancanza di metriche quantitative per valutare la gravità delle reazioni cutanee. Qui presentiamo un approccio spettroscopico ottico diffuso (DOS) che fornisce biomarcatori ottici quantitativi della risposta cutanea alle radiazioni. Descriviamo la progettazione della strumentazione del sistema DOS e l'algoritmo di inversione per l'estrazione dei parametri ottici. Infine, per dimostrare l'utilità clinica, presentiamo dati rappresentativi da un modello murino preclinico di eritema indotto da radiazioni e confrontiamo i risultati con un punteggio visivo comunemente impiegato. Il metodo DOS descritto offre una valutazione obiettiva e ad alto rendimento della tossicità cutanea attraverso una risposta funzionale traducibile in ambito clinico.

La tecnica riflettanza DOS fornisce un&#39;alternativa obiettivo di metodi tradizionali qualitativi di valutazione radiazioni indotto tossicità cutanea. modifiche visive aspetto della pelle seguenti dosi tossiche di radiazioni presenti come alterazioni sia la grandezza e la forma degli spettri di riflettanza misurata. Entrambi sono legati a cambiamenti funzionali nella microstruttura cellulare sottostante e lo stato del tessuto fisiologico. In questa sezione, i risultati rappresentativi di lavoro precedentemente pubblicato da Yohan et al. 2014 5 sono rivisti. Figura 3 (a sinistra) mostra rappresentativi spettri (sottili righe blu) misurato a un 260 micron fonte di separazione in un modello di topo atimici di eritema cutaneo 6 giorni dopo 40 Gy di irradiazione. Rispetto al pre-irradiazione (Figura 3, pannello di destra), si osservano differenze nella forma spettrale a ~ 550-650 nm, likely a causa di un aumento della emoglobina ossigenata. Un piccolo aumento riflessione assoluto è anche visto che è correlato ad un aumento della potenza di scattering tessuto. Gli spettri osservato il giorno 6 dopo irradiazione correlato ad un punteggio visivo della pelle di 0,75. Una valutazione dei cambiamenti di riflettanza dopo irradiazione a selezionare lunghezze d&#39;onda non fa uso dello spettro di riflettanza completa e porta anche il potenziale problema di sensibilità al rumore. Tuttavia, il montaggio lo spettro completo consente l&#39;intero set di dati per essere convertito in biomarcatori ottici intuitive (H B, STO 2). Figura 3 mostrano le crisi derivanti (solida linea verde) dei dati misurati (sottile linea disturbata) utilizzando le equazioni presentati nella sezione si osserva 4. eccellente accordo, che conferma che la scelta di cromofori di base e la forma dispersione adeguatamente descrivono il modello di pelle del mouse. <p class="jove_content"fo:. keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; A causa delle non invasiva e di auto-calibrazione natura del sistema DOS, le misure possono essere effettuate comodamente su più giorni in diverse condizioni di illuminazione figura 4 mostra i cambiamenti relativi in pelle StO 2 per vari punti temporali (6, 9, 12 giorni) in una coorte irradiato topo (n = 8), mentre la figura 5 mostra i punteggi reazione cutanea qualitativi corrispondenti. Un aumento progressivo StO 2 si osserva che è statisticamente differente rispetto ai valori pre-irradiazione oltre ogni 3 giorni (p &lt;0.05). Queste tendenze rispecchiano gli aumenti osservati visivamente in gravità danni alla pelle che il picco al giorno 12 (punteggio medio di ~ 3) dimostrando il potenziale di StO 2 come un surrogato di punteggio visivo (Figura 5). Va notato che nessun cambiamento statisticamente significativi sono stati osservati per qualsiasi biomarker ottiche restituiti per lanon irradiato gruppo di controllo (n = 3) nei 12 giorni di misurazione (dati non mostrati). Variazioni A e k possono anche essere monitorati nel tempo (figura 6), e questi indicano che le proprietà di diffusione della pelle cambiano in risposta alla radiazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig1.jpg" /> Figura 1. strumentazione DOS. (A) Schema della geometria di misurazione riflettanza diffusa (B) la sonda a fibra ottica. La sonda ottico è costituito da una schiera lineare di 200 micron fibre ottiche fondamentali che confluiscono in un ago metallico 18 G e distanziati 260 micron a parte. Due fibre di origine sono accoppiati a due diodi emettitori di luce a banda larga, mentre una fibra di rilevamento è collegato ad uno spettrometro ottico. Con sequenza di accensione di ciascuna delle fonti, lo spettrometro può raccogliere riflettanza diffusa a distanze di 260 um e520 micron da ciascuna delle fibre sorgente (C) Sistema completo DOS compresi laptop, sonda e ottica box fibra ottica collegata:. Un programma di acquisizione automatica dei dati viene utilizzato per pilotare la raccolta sequenziale di spettri. L&#39;elettronica sono alloggiati in una scatola di acquisizione che si collega alla sonda a fibre ottiche tramite connettori SMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig2.jpg" /> .. Figura 2 elaborazione spettrale Tutte le scale di asse x sono in nm: (A) grezzo spettri relativa, la linea di base è la lettura di circa tra 900 - 1.000 nm e circa uguale al segnale di fondo (B) valori di fondo relativa (C.. ) Contesto e base sottratti relativi s<html> pectra. (D) Assolutamente calibrato spettro seguente scala di spettri elaborati mostrato in (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig3.jpg" /> Figura 3. tipico bianco di riflessione alla luce gli spettri di (a destra) della pelle del mouse 6 giorni non irradiato (a sinistra) e irradiati post-irraggiamento. Eccellente accordo tra la misurazione (rumoroso blu) e si adatta (verde solido) sono stati osservati in genere. Due differenze fondamentali sono state osservate tra i due gruppi: 1) un aumento complessivo di riflessione assoluto e 2) un netto cambiamento nella forma spettrale tra 550-600 nm. Con il permesso da Yohan et al. 2014 5.&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig4.jpg" /> Figura 4. Variazione nella frazione ossigenazione della pelle del mouse dopo 40 Gy di irradiazione. La differenza media al basale-normalizzato tra i due gruppi (per mouse) è significativo per Giorni 6 (Box 1), 9 (riquadro 2) e 12 (Box 3 ). Con il permesso da Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig5.jpg" /> Figura 5. media della pelle qualitativa reazioni punteggi (n = 8) in funzione dei giorni seguenti 40 Gy irradiati pelle topi. Adattato da Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig6.jpg" /> Figura 6. cambiamenti relativi in A e K della pelle del mouse seguenti 40 Gy di irradiazione nei giorni 6 (Box 1), 9 (riquadro 2) e 12 (riquadro 3). La variazione di A (lato sinistro) e K (lato destro) il giorno 6 (Box 1, a sinistra ea destra) è risultata essere significativa (p &lt;0,026). Con il permesso da Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un approccio spettroscopico ottico diffuso (DOS) che fornisce biomarcatori ottici quantitativi della risposta cutanea alle radiazioni. Descriviamo la progettazione della strumentazione DOS, gli algoritmi di estrazione dei parametri ottici e le procedure di manipolazione degli animali necessarie per produrre dati rappresentativi da un modello murino preclinico di eritema indotto da radiazioni.

Diffuse spettroscopia ottica per la valutazione quantitativa di acuta radiazioni ionizzanti tossicità cutanee indotte Utilizzando un modello di topo

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di spettroscopia ottica diffusa è sviluppare un biomarcatore quantitativo per descrivere l'eritema acuto indotto dalle radiazioni. Questo metodo può essere utilizzato nel campo della radioterapia come biomarcatore predittivo per identificare i pazienti a rischio di tossicità cutanea grave da radiazioni. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una metrica oggettiva e sistematica per quantificare le tossicità cutanee da radiazioni.Dimostrerò la tecnica di spettroscopia ottica diffusa, mentre Elina, una ricercatrice del Loo Lab, si occuperà dei topi. Accendere l'elettronica e attendere l'avvio del sistema. Quindi spegnere tutte le luci al neon nella stanza e posizionare delle luci a incandescenza a una certa distanza dal dispositivo di misurazione per fornire una minima illuminazione di lavoro.Successivamente, impostare lo strumento per effettuare misurazioni dalla pelle del mouse. Impostare i parametri del segnale come segue: impostare il tempo di acquisizione a 25 millisecondi, il numero medio di segnali a 25 e la larghezza del filtro boxcar a uno.Questi parametri offrono un ragionevole compromesso tra tempo di acquisizione e rapporto segnale-rumore. Successivamente, utilizzando il software di acquisizione programmato su misura, acquisire automaticamente una lettura di fondo con il LED spento. Quindi, acquisire una lettura con riflettanza diffusa a due distanze di separazione tra sorgente e rivelatore.Eseguire una misurazione a 260 micron e la seconda a 520 micron. Il tempo di acquisizione totale dovrebbe essere di circa due secondi. Dopo aver anestetizzato il topo, spostarlo nell'area sterilizzata per la sonda DOS.Posizionarlo sul fianco e fissare il muso a un cono nasale che eroga gas isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia. Sterilizzare ora la sonda con etanolo al 70%, ma non tentare di sterilizzare la pelle. Applicare delicatamente la sonda sterilizzata sulla pelle del fianco.Non premere troppo forte, poiché la vascolarizzazione locale non deve essere dispersa dalla pressione della sonda. Tenendo la sonda, acquisire i dati di riflettanza su un'area quadrata di due centimetri da irradiare. Raccogliere i dati secondo una formazione di cinque punti simile a quella di un dado.Mantenere questo schema e la stessa pressione di sondaggio in tutte le misurazioni successive. Dopo aver effettuato le misurazioni, posizionare il topo in una gabbia di recupero. Mentre il topo si riprende, ripetere la procedura sul topo successivo.Questa procedura è adattata all'irradiatore disponibile. Modificarla secondo necessità per irradiare una piccola sezione della pelle. Dopo aver anestetizzato un topo, afferrare delicatamente una piega di pelle sul fianco e fissarla con del nastro adesivo in modo da formare una linguetta.Quindi posizionare il mouse su una piastra in Plexiglas e coprirne il corpo con un’apposita maschera in piombo. Utilizzare una scatola in piombo accessibile su due lati e dotata di un’apertura per irradiare la pelle. Successivamente, far passare il lembo di pelle attraverso l’apertura della maschera e fissare il lembo alla piastra con del nastro adesivo.Se il mouse non è immobilizzato dal supporto, somministrare un'iniezione anestetica. Quindi posizionare la piastra con il supporto e il mouse nell'irradiatore. Calcolare la dose di irradiazione richiesta.Ad esempio, una sorgente a raggi X con picco di tensione di 160 kilovolt posizionata a 11 centimetri di distanza irradierebbe adeguatamente la cute, funzionando a 6,3 milliampere per 2,5 minuti. Successivamente, somministrare la dose calcolata. Dopo la somministrazione della dose all'animale, riporlo in una gabbia di recupero.Dopo il recupero dall'anestesia, riportare il topo al suo normale contenitore di allevamento condiviso. I topi sono stati irradiati e misurati come descritto. Prima dell'irradiazione, è stato registrato uno spettro di base con una separazione della sorgente di 260 micron in un modello murino atimico della pelle.La linea verde spessa mostra un adattamento matematico della linea blu sottile. Rispetto alle misurazioni effettuate sei giorni dopo un'irradiazione di 40 gray, sono state osservate differenze nella forma spettrale tra 550 e 600 nanometri, probabilmente dovute a un aumento dell'emoglobina ossigenata. Si osserva anche un lieve aumento della riflettanza assoluta, che potrebbe essere correlato a un incremento del potere di scattering del tessuto.I dati interpolati forniscono biomarcatori ottici quantitativi che possono essere monitorati in funzione del tempo dopo l'irradiazione. Ad esempio, le misurazioni della saturazione tissutale di ossigeno sono progressivamente aumentate in seguito all'irradiazione. Questi dati quantitativi hanno mostrato una correlazione con un punteggio visivo della tossicità cutanea, che è anch'esso progressivamente aumentato dopo l'irradiazione.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la spettroscopia ottica diffusa per la valutazione quantitativa delle tossicità cutanee da radiazioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre minuti, se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante premere delicatamente la sonda DOS per evitare la dispersione della vascolarizzazione.Questa tecnica può essere utilizzata nel campo della radioterapia come metodo per correlare parametri fisiologici nella descrizione della risposta dei tessuti normali alle radiazioni.

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Diffuse spettroscopia ottica per la valutazione quantitativa di acuta radiazioni ionizzanti tossicità cutanee indotte Utilizzando un modello di topo (Video) | JoVE Journal

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