CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come utilizzare il chip COMET per eseguire misurazioni del danno al DNA ad alto rendimento nelle cellule di mammifero. Ciò si ottiene caricando prima le cellule di mammifero nel chip COMET. Il secondo passo consiste nel trattare le cellule con sostanze chimiche note per causare danni al DNA.

Successivamente, le cellule vengono lisate ed Electro East utilizzando i tradizionali protocolli di analisi COMET. Il passaggio finale è l'imaging a fluorescenza del DNA cellulare per visualizzare la migrazione del DNA danneggiato. In definitiva, il software di analisi delle immagini viene utilizzato per quantificare l'entità del danno al DNA.

Quindi il test com è in circolazione da molto tempo ed è un test molto utile per esaminare molti tipi diversi di danni al DNA. Ma il problema è stato che il throughput è davvero basso e manca di sensibilità. Così abbiamo creato il chip COMET, che fondamentalmente è una versione ad alto rendimento del test COMET che consente di eseguire screening ad alto rendimento per lo screening dei farmaci, ad esempio, e per gli studi epidemiologici.

Lo studente laureato Jing GA nel mio laboratorio dimostrerà la procedura. Il chip di coma è un gel con una serie di micro pozzetti prodotti da un micro timbro fabbricato con micro perni con diametri piccoli come quello di una singola cellula per iniziare a essere collocato in un film di gel bond rettangolare a un pozzetto con il lato rivolto verso il basso. Dopo aver lavato il gel due volte in 25 millilitri in uno, XPBS posizionare la virgola su una lastra di vetro, quindi etichettare l'orientamento del gel di conseguenza.

Ora premere delicatamente una piastra rovesciata senza fondo a 96 pozzetti nel gel, assicurandosi che tutti i 96 pozzetti si trovino all'interno dell'area del gel. Quindi agganciare entrambi i lati della piastra a 96 pozzetti alla lastra di vetro con clip per legante da 1,5 pollici. Infine, aspirare l'eccesso di PBS da ciascuno.

Raccogliere bene le cellule in sospensione o aderenti secondo le procedure standard e diluire le cellule con il terreno fino a una concentrazione finale di 100.000-1 milione di cellule per millilitro. Assicurarsi che si ottenga una sospensione a cella singola passando attraverso un filtro a cella, se necessario. Pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto, la piastra a 96 pozzetti del chip cometa una volta terminata.

Coprire la piastra con la pellicola di gel bond per evitare l'evaporazione, quindi riporla in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per 30 minuti dopo aver rimosso la piastra dall'incubatrice. Trascorsi i 30 minuti, aspirare bene il supporto da ciascuno, quindi rimuovere le clip del raccoglitore e la piastra a 96 pozzetti senza fondo Tenere il chip cometa con la lastra di vetro inclinata e risciacquare delicatamente con un XPBS per rimuovere eventuali celle in eccesso sopra l'aros. Ora osserva la lastra attraverso una lente obiettivo quattro x su un microscopio a campo chiaro per verificare il carico ottimale delle celle Dopo aver caricato un numero sufficiente di cellule, posizionare un chip com su una superficie piana, una sovrapposizione con agros a basso punto di fusione all'1% che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Lasciare solidificare il rivestimento a temperatura ambiente per tre minuti, quindi posizionarlo a quattro gradi Celsius per cinque minuti per una completa dose per dosare le cellule con le sostanze chimiche di interesse. Per prima cosa, allinea attentamente i pozzetti del chip cometa con i pozzetti di una nuova piastra a 96 pozzetti senza fondo e premi verso il basso. Fissare la piastra a 96 pozzetti alla piastra di vetro con le clip per raccoglitori come prima.

Quindi posizionare la piastra sul ghiaccio e aggiungere 100 microlitri della sostanza chimica di interesse alla dose desiderata A ciascun pozzetto lasciare che la sostanza chimica in esame rimanga sulle cellule con il periodo di tempo desiderato dopo il dosaggio, aspirare la soluzione chimica da ciascun pozzetto e risciacquare con un XPBS se necessario. Taglia il gel in pezzi separati. Quindi, per studiare la cinetica di riparazione, aggiungere terreni di coltura ai pozzetti, incubare e procedere alla lisi cellulare in punti temporali specifici per le cellule LY per il saggio della cometa alcalina.

Preparare circa 25 millilitri di tampone di lisi alcalina di lavoro per ciascun chip aggiungendo l'1% di Triton X 100 alla soluzione madre di lisi alcalina. Quindi pre-raffreddare a quattro gradi Celsius. Decantare il tampone di lisi alcalina in un contenitore appena più grande del chip della cometa.

Quindi immergere il chip alcalino nel tampone di lisi alcalina di lavoro raffreddato, metterlo in frigorifero e lasciare che la lisi proceda per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il chip cometa dal tampone di lisi e farlo rapidamente con un XPBS. Quindi posizionare il chip in una camera di elettroforesi con il lato della pellicola di gel rivolto verso il basso e fissarlo con nastro biadesivo.

Portare la camera nella cella frigorifera a quattro gradi Celsius e riempire la camera con un tampone per elettroforesi alcalina fredda a un livello che copra appena il gel. Quindi lasciare il truciolo a quattro gradi Celsius per 40 minuti per consentire lo svolgimento alcalino. Infine, fai scorrere il gel a un volt per centimetro e 300 milliampere per 30 minuti.

Nella cella frigorifera, regolare il volume del tampone per elettroforesi nella camera per ottenere la corrente di funzionamento desiderata. Per il saggio della cometa neutra, creare un tampone di lisi neutro funzionante aggiungendo l'1% di Triton X 110% di DMSO alla soluzione madre di lisi neutra. Ancora una volta, preparando circa 25 millilitri di tampone di lisi funzionante per ogni chip.

Posizionare il tampone di lisi neutro funzionante nell'incubatore impostato a 43 gradi Celsius per preriscaldare. Dopo che il tampone di lisi neutro si è riscaldato, immergere il chip di virgola nel tampone di lisi neutro e metterlo in un incubatore a 40 gradi Celsius per una notte. Il giorno successivo, rimuovere il tampone di lisi neutro e quindi ripetere due volte con il tampone neutro per elettroforesi per 15 minuti a quattro gradi Celsius Ogni volta, fissare il chip nella camera di elettroforesi e trasferirlo nella cella frigorifera.

Come prima, riempire la camera di elettroforesi con un tampone neutro freddo per elettroforesi a un livello che copra appena il gel e lasciare che il gel rimanga in una stanza fredda per 60 minuti, far funzionare il gel a 0,6 volt per centimetro e sei milliampere per 60 minuti nella cella frigorifera. Anche in questo caso, regolare il volume del tampone per elettroforesi nella camera per ottenere la corrente di funzionamento desiderata, se necessario. Dopo aver rimosso il chip com dalla cella frigorifera, neutralizzare i gel lavando e neutralizzando il tampone due volte per 15 minuti ciascuno a quattro gradi Celsius.

Rimani nel chip con una colorazione fluorescente del DNA come l'oro cyberg o il bromuro di iridio. Secondo le istruzioni del produttore e l'immagine al microscopio a fluorescenza, le comete Microwell rappresentative di TK sei linfoblasti sono mostrate nel pannello superiore di questo diagramma. Quelli di TK sei celle esposte a 50 micromolari di perossido di idrogeno nel pannello centrale e 100 micromolari di perossido di idrogeno nel pannello inferiore.

Tutte le esposizioni sono state di 20 minuti a quattro gradi Celsius. Questo grafico a linee mostra la risposta alla dose di perossido di idrogeno di TK a sei cellule. Ogni punto dati è la media di tre esperimenti indipendenti in cui la percentuale mediana del DNA della coda di almeno 50 singole comete è stata ottenuta in ogni esperimento.

Questo grafico mostra la variazione da campione a campione del saggio del chip a virgola per TK, sei celle esposte, perossido di idrogeno percentuale, i dati del DNA della coda di ciascun pozzetto sono mostrati qui. Ogni casella rappresenta la mediana di almeno 50 singole comete da ogni pozzo. La media di 12 pozzi è 77 virgola 53%La deviazione standard è 3,99% e il coefficiente di variazione è 5,2%Questo grafico mostra la variazione da esperimento a esperimento.

La stessa esposizione al perossido di idrogeno è stata ripetuta sei volte e i dati di ogni ripetizione sono mostrati come una barra grigia. Ogni casella rappresenta la percentuale mediana di DNA della coda di almeno 100 singole comete da ogni ripetizione. La media di sei ripetizioni è del 49,57% mostrata come la barra posteriore qui.

La deviazione standard di sei ripetizioni è del 4,99% e la barra di errore della media è del 2,04% rappresentata come la barra d'aria nella figura Come il test comune tradizionale. I ricercatori sono liberi di apportare modifiche a questa procedura o di utilizzare altri pasticci, come l'inclusione di enzimi specifici della lesione purificati per rispondere a ulteriori domande sul tipo di danno al DNA prodotto nelle cellule. La tecnica del chip cometa ha aperto la strada agli studi sulle cellule dei mammiferi per conoscere i danni e la riparazione del DNA.

E poiché è ad alta produttività, consente di eseguire studi clinici ed epidemiologici che prima non erano possibili a causa del numero di campioni.