Name: Sviluppo di Sulfidogenic fanghi da Marine Sedimenti e Tricloroetilene Riduzione in una coperta reattore Upflow anaerobica dei fanghi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: Scopri come sviluppare fanghi sulfidogenici da sedimenti marini in un reattore UASB per la riduzione del tricloroetilene. Questo metodo biotecnologico migliora la biorimediazione di inquinanti organici.

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Gli autori sono grati per il sostegno finanziario fornito dalle sovvenzioni dell'Instituto Politécnico Nacional 20120110, 20130399 e 20140239 SIP e anche dall'Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal Mexico (PICS 08-79, ICYT-DF, 2009-2012). Grazie anche a CONACYT – Messico per la borsa di studio per laureati (225806) assegnata a Selene Montserrat García-Solares e per il sostegno finanziario fornito dalla sovvenzione 82627.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig1highres.jpg" width="450" /> Figura 1. Schema per le fasi del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 1. Raccogliere marine sedimenti per la Formazione dei fanghi <ol><li> Identificare un&#39;area sottomarina accessibile sia vicino a sorgenti idrotermali (a causa della presenza di solfuri, che può indicare una maggiore solfato riducendo l&#39;attività) o ad una zona in cui i residui della sostanza organica sono rilevabili. </li><li> Ai fini di questo lavoro, richiede circa 3 o 4 kg di sedimenti e drenare l&#39;acqua fuori i campioni. Mettere i campioni in sacchetti di plastica scuri. Non è necessaria alcuna refrigerazione. </li><li> Una volta in laboratorio, tenere le borse con i campioni in frigorifero, se non sono in corso per essere utilizzata immediatamente. Ai fini di questo lavoro, SAMPles può essere in frigorifero per settimane o mesi prima di utilizzarli. </li><li> Prendere una grande porzione del campione di sedimento (cioè, 1 o 2 kg) e usare una rete appropriata (0,2 cm) per eliminare dai sedimenti grande detriti di materiale carbonioso che possono essere trovati o alcune rocce che possono essere presenti. Nota: In questo caso una maglia di 0.20 cm di diametro (0,0767 in) è stato utilizzato, ma può essere di dimensioni diverse a seconda delle dimensioni delle particelle nel campione. <ol><li> Dopo aver superato il sedimento attraverso la maglia, mescolare la porzione selezionata di promuovere che la porzione è omogenea. </li><li> Prendere campioni più piccoli separati (cioè, da 2 a 3 g) determinare i solidi sospesi volatili (VSS) Opere seguendo i metodi standard 11. Nota: Vedere la Figura 2 per i passaggi 1.2 a 1.4. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig2.jpg" /> Figura 2. Le fotografie dei campioni di sedimento.Campioni (A) del sedimento appena dopo essere prese. Campione (B) del sedimento dopo il passaggio attraverso la rete. (C) Campione prelevato per la pesatura prima solidi sospesi volatili (VSS) determinazione. La piastra di Petri non ha bisogno di essere sterilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Bioreattore Set Up <ol><li> Ai fini di questo lavoro, utilizzare un reattore in vetro UASB con un volume totale di lavoro 3 L. In alternativa, utilizzare un reattore di vetro del volume 1 o 2 L. </li><li> Sulla base del contenuto VSS dei sedimenti calcolare la quantità di sedimenti da utilizzare come inoculo per ottenere 5 g di VSS in 1 L. </li><li> Tener conto che se la quantità di sedimenti dopo il calcolo è troppo grande, quindi circa il 25% al ​​30% del volume del bioreattore dovrebbe essere occupato da sedimenti invece. <ol><li> Registrare il contenuto VSS in quantocambierà quando la comunità microbica si arricchisce nel bioreattore. Il contenuto VSS è necessario per i calcoli di solfato di ridurre l&#39;attività nel bioreattore. </li></ol></li><li> Assicurare che la concentrazione finale della soluzione tampone medio basale nel bioreattore è simile al riportato da Guerrero-Barajas et al. (2014) 12. <ol><li> Assicurarsi che i volumi finali dei sedimenti, medio basale, soluzione tampone e acidi grassi volatili sono pari al volume finale di lavoro del reattore. Il basale medio ricetta 12 contiene le concentrazioni adeguate per la metalli in tracce e vitamine soluzione. </li><li> Preparare una soluzione stock di soluzione tampone terreno di base e in una concentrazione appropriata per il volume di lavoro del reattore utilizzato (ad esempio, 2, 3 o 4 volte più concentrato di quello riportato al punto 2.4) per garantire che quando viene diluito è alla concentrazione riportata da Guerrero-Barajas et al. (2014)12). Nota: La soluzione madre per mezzo base è sempre necessario, tuttavia, la soluzione tampone è necessaria solo all&#39;avviamento. Non è necessario aggiungere soluzione tampone dopo questo tempo. </li><li> Preparare una soluzione stock di acidi grassi volatili: acetato, propionato e butirrato in 2.5: 1: 1 COD proporzione. Prendere in considerazione per il calcolo del sodio acetato incluso nel terreno di base. La concentrazione finale COD nel reattore deve essere 2,7 g / L. Attenzione: Preparare questa soluzione in una cappa aspirante. Indossare guanti di nitrile e occhiali per la preparazione di questa soluzione. Considerare la stechiometria delle reazioni di solfato con acidi grassi volatili che viene mostrato in figura 3. </li><li> Preparare una soluzione stock di solfato di sodio (Na 2 SO 4) in una concentrazione appropriata per fornire al reattore una concentrazione finale di 4,000 mg / l di ione solfato (SO 4 2-). In alternativa, includere °e quantità di solfato richiesto nel terreno di base invece di aggiungere da una soluzione madre finché il solfato finale (SO 4 2-) concentrazione è giusto. </li></ol></li><li> Posizionare i sedimenti nel reattore mescolato con una parte del terreno di base per assicurarsi che raggiungano il fondo del reattore. <ol><li> Aggiungere il resto della soluzione tampone basale medio e mescolato con la soluzione di acidi grassi volatili e la soluzione di solfato. Assicurarsi che la soluzione di acidi grassi volatili viene versato nel liquido. Nota: Effettuare questa operazione in una cappa aspirante. </li><li> Impostare le connessioni e tubazioni del reattore per la pompa di riciclo. Impostare la portata di riciclaggio a 60 ml / min. Impostare il bioreattore nella camera di temperatura a 34 ° C. Regolarmente controllare che le variazioni di temperatura sono piccole (ad esempio, 34 ± 1,7 ° C) </li><li> Impostare i collegamenti alla colonna di spostamento del gas. Nota: La Figura 4 passi da 2.1 a 2.5. </li> &lt;/ ol&gt; </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Stechiometria di riduzione solfato con VFA (acetato, propionato e butirrato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig4highres.jpg" width="400" /> Figura 4. UASB reattore. (A) tempo iniziale. (B) il regime continua dopo 300 giorni di funzionamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Il funzionamento del reattore per promuovere Sulfidogenesis e crescita dei microrganismi Nota: Consenti per l&#39;inoculo di consumare la volatile acidi grassi e solfato. A questo scopo, attendere una settimana per effettuare la prima analisi solfato, solfuro e consumi COD. <ol><li> Dopo una settimana di incubazione prelevare un campione di 5 a 7 ml di liquido per condurre un&#39;analisi per COD, solfato e solfuro contenuti e pH seguenti metodi standard 11, 13. <ol><li> Analizzare solfuro nella spettrofotometricamente liquido (ad una lunghezza d&#39;onda (λ) di 670 nm) seguendo il metodo di metilene blu 13. <ol><li> Porre 5 ml di una soluzione di acetato di zinco (2% w / w) in un matraccio da 25 ml, aggiungere 200 ml di rapidamente il campione alla soluzione di acetato di zinco. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di N, N -dimethyl- p-fenilendiamina ossalato soluzione (DMP) (0,2% w / w in 20% H 2 SO 4) e 125 ml di ferro (III) soluzione di solfato di ammonio (10% w / w 2% in H 2 SO 4) e terminare con acqua distillata 25 ml in matraccio tarato. Attendere 30 minuti per la reazionea verificarsi, momento in cui il colore blu è stabilizzato. 13. Nota: Attendere almeno 15 minuti, ma non più di 60 minuti per testare i campioni nello spettrofotometro. Effettuare la lettura della soluzione finale blu nello spettrofotometro. </li></ol></li><li> Analizzare solfato secondo metodi standard 11. Qui, come quantificare solfato di bario solfato utilizzando un metodo turbidimetrico. <ol><li> Mettere 5 ml di una soluzione di condizionamento (acido cloridrico HCl 1: 1) in un pallone tarato da 25 ml, aggiungere 1 ml di campione precedentemente centrifugato (a 11.320 xg), completare l&#39;25 ml del pallone tarato con acqua distillata e aggiungere 1 g di cloruro di bario. </li><li> Miscelare la soluzione per 1 minuto in un vortice. Attendere 4 min per il solfato di bario per formare e leggere il campione nel spettrofotometro a (λ) di 420 nm 11. </li></ol></li><li> Analizzare COD secondo metodi standard 11. In alternativa, utilizzare un COD DeterminaKit zione. <ol><li> Prima della determinazione COD, centrifugare il campione a fondo (a 11.320 xg) per rimuovere il solfuro restando che potrebbero interferire nella determinazione. Se necessario, centrifughi due volte: la prima volta immediatamente dopo il prelievo del campione e la seconda volta attendere 6 o 8 ore e quindi effettuare l&#39;analisi COD. </li><li> Aggiungere 2 ml di campione in una fiala reazione del kit di determinazione del COD, sigillare il flacone e omogeneizzare la miscela agitando con prudenza. Preparare un vuoto aggiungendo 2 ml di acqua distillata in un altro flacone di reazione e omogeneizzare la miscela. </li><li> Posizionare le fiale nel reattore digestione a 150 ° C per 2 ore. Rimuovere le fiale e lasciateli raffreddare nel buio. Prendere le letture dei flaconi nella spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 620 nm. </li></ol></li><li> Ottenere il volume di gas dalla colonna spostamento gas. </li></ol></li><li> Attendere fino a un altro 5 a 7 giorni fino a quando il solfato è consumato. Solfato e COD devono essere consumati in unpproximately 85% al ​​90% prima che sia avviato un nuovo lotto alimentato. </li><li> Una volta solfato (e COD) sono consumati, completamente ripetere il punto 2.4. Fornire un mezzo fresco e nuove sostanze nutritive per ciascun lotto. </li><li> Ripetere i punti 3.1 e 3.2. A questo punto ogni partita dovrebbe durare tra i 7 ei 10 giorni. </li><li> Quando sono state completate da 3 a 4 lotti, ripetere il passaggio 2.4 ma aumentare la concentrazione di COD 4 g / L. </li><li> Ripetere il passaggio 3.1 e punto 3.2. <ol><li> Ripetere il punto 3.3, ma aumentare la concentrazione di COD 6 g / L. </li><li> Ripetere 3.6 e 3.6.1 aumentando gradualmente concentrazione COD finché è 10 g / L. Nota: rendere il grafico che presenta la concentrazione di solfato (mg / L) rispetto al tempo (d). </li></ol></li><li> Quando il consumo solfato è superiore all&#39;80% in meno di 24 ore e questo avviene per più di una settimana, commutare il funzionamento del reattore a modalità continua. Per il funzionamento continuo impostare il tempo di ritenzione idraulica (HRT) a 24 ore e mantenere la concentrazione di solfato a 4 g / L e il CODa 10 g / L. Nota: Nel corso del tempo il consumo di solfato dovrebbe essere veloce. </li></ol> 4. Solfato Ridurre test Attività <ol><li> Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore in regime continuo presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente. </li><li> In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Una volta che il bioreattore è alimentato, prendere 5 a 7 ml di campioni di liquido e per eseguire analisi COD, solfato, solfuro (passo 3.1) e pH ogni ora. Registrare il volume di gas prodotto. </li><li> Calcolare il solfato ridurre l&#39;attività secondo la letteratura 14. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq1.jpg" /></li></ol> SRA = solfato riducendo l&#39;attività (mg COD-H 2 S) / gVSS * d m H 2 </em&gt; S = concentrazione di solfuro espressa come mg COD-H 2 S VSS = volatili concentrazione di solidi sospesi t = tempo (d o ore) <ol start="5"><li> Fare le corrispondenti grafici che mostrano la percentuale di consumo di solfato in funzione della concentrazione di solfuro nel tempo in mg / L. Rendere i grafici che mostrano percentuale del consumo COD nel tempo. Rendere i grafici che mostrano la variazione di pH nel tempo. </li></ol> 5. tricloroetilene (TCE) Riduzione di prova <ol start="1"><li> Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore lavora in regime continuo e presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente. Non iniziare il test se riduzione solfato nel bioreattore è inferiore al 90%. </li><li> Preparare una soluzione stock di tricloroetilene (TCE) tenendo conto che la concentrazione finale di questo composto nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 micron. Si consideri il partitioning del composto allo spazio di testa utilizzando la costante adimensionale legge Henry&#39;s (H&#39;) per TCE a 34 ° C. H&#39;at 34 ° C per il TCE è 0,4722. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq2.jpg" /> Attenzione: Preparare questa soluzione in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi. <ol><li> Ad esempio, per una soluzione madre 5.000 micron, calcolare come seguito: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq3.jpg" /> Concentrazione TCE fase gassosa = (0,4722) * (5000) = 2.139 micron. Includere questa concentrazione nella preparazione della soluzione di riserva poiché questa quantità di TCE sarà nello spazio di testa. Poi nel liquido (acqua) della soluzione madre, la concentrazione effettiva TCE sarà: 5,000 + 2,139 = 7.139 pM. Densità TCE = 1,43 g / ml. Convertire il 7139 pM a mg e poi in base alla densità del TCE calcolare il volume del TCE per soluzione madre. Nota: La concentrazione della soluzione madre TCE may essere inferiore a 5.000 micron, cioè, 3000 o 1000 pM, questo dipende dalla quantità di volume di tale soluzione può essere consegnato al bioreattore secondo il volume fase liquida. </li></ol></li><li> Preparare curve standard nel gascromatografo per TCE, cis--1,2 dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etene. Preparare i cis -1,2-dicloroetilene e trans -1,2-DICLOROETILENE curve standard da una soluzione madre di questi composti seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione 5.2 TCE magazzino. Preparare le curve standard per il cloruro di vinile e etilene diluendo la concentrazione di ciascun gas dagli standard (cilindri gas). <ol><li> Preparare le curve standard di questi composti in una gamma da 20 a 300 micron. Utilizzare il metodo riportato da Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 per l&#39;analisi di questi composti nel gascromatografo. Attenzione: Preparare questi standLe soluzioni ard in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi. </li></ol></li><li> In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Una volta che il bioreattore viene alimentato, aggiungere il TCE direttamente al liquido nel bioreattore dalla soluzione madre preparata in 5.2, la concentrazione finale TCE nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 pM. Impostare la HRT di 12 ore. <ol><li> Alla fine di un ciclo HRT prelevare campioni di liquido (500 a 1,000 microlitri) e l&#39;analisi condotta per COD, solfato e solfuro (passi 3.1.1, 3.1.2 e 3.1.3). Prelevare campioni di spazio di testa (100 a 250 microlitri) e condurre analisi per TCE, cis -1,2-dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etilene nel gascromatografo. </li></ol></li><li> Ripetere il punto 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Non ripetere qualsiasi test riduzione TCE fino al bioreattore presenta oltre 9Riduzione 0% solfato e meno del 10% di variazione in entrambi, riduzione solfato e solfato rimanente nel bioreattore. </li><li> Ripetere 5.4, 5.5 e 5.6 due o tre volte di più. </li><li> Dai campioni di sedimento (0,5 g) per condurre l&#39;identificazione dei microrganismi subito dopo un test di riduzione TCE è terminata. Fare questo dopo 2 o 3 test di riduzione del TCE. </li></ol> 6. Solfato Ridurre test attività dopo TCE Riduzione Experiment <ol start="1"><li> Ripetere il punto 4 completamente. </li></ol> 7. Individuazione dei Microrganismi <ol><li> Prelevare campioni di fanghi di circa 0,5 g ciascuno e condurre l&#39;estrazione di RNA totale secondo il metodo standard 12. </li><li> Amplificare il gene 16S rRNA con la trascrizione inversa e condurre la reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) Rinforzo un passo 12. </li><li> Progettare i primer per amplificare o usare come un primo approccio quelli proposti nella letteratura 11. Seguire la amplifProcedura icazione suggerito in letteratura 12. </li><li> Costruire le librerie 16S rRNA. Ampliconi della PCR possono essere clonati utilizzando un kit di clonazione-11. Tipicamente, 10 colonie da ciascuna piastra (ogni colonia rappresenta un prodotto PCR) possono essere clonati. Preparare il DNA plasmidico per sequenziamento secondo quanto suggerito in letteratura 12. </li><li> Condurre il sequenziamento dei frammenti. Re-amplificare circa 1.400 bp dei prodotti esterni PCR con il protocollo per l&#39;amplificazione PCR precedentemente descritto (passo 7.4) e clone secondo quanto suggerito in letteratura 12. Isolare il plasmide ricombinante da E. colonie coli come suggerito in letteratura 12. Non condurre la gara parziale per il sequenziamento con M13 primer universali 12. </li><li> Effettuare l&#39;analisi di sequenze. Allineare le sequenze nucleotidiche tramite Clustal X e regolare manualmente nell&#39;editor di testo. Effettuare ricerche BLAST delle databas NCBIe. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12. </li><li> Ottenere i numeri di accesso sequenza nucleotidica. Depositare le sequenze nucleotidiche dei cloni individuati nel database sequenza nucleotidica EMBL (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) sotto i corrispondenti numeri di accesso (ad esempio, per le sequenze da JQ713915eJQ713925 ampliconi) 12. </li></ol>

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<li>Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfate+reduction+and+trichloroethylene+biodegradation+by+a+marine+microbial+community+from+hydrothermal+vents+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+and+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments.</a> International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).</li>
</ol>

Gli autori Selene Montserrat García-Solares, Claudio Garibay-Orijel e Claudia Guerrero Barajas hanno presentato (in qualità di inventori) nel 2012 la domanda per ottenere un brevetto intitolato: "Processo per il trattamento anaerobico di acque reflue industriali ad alto contenuto di solfato e composti clorurati". Questa presentazione è stata approvata fino alla fase di formattazione. La presentazione ha l'Instituto Politécnico Nacional come titolare dei diritti.

Ci sono diverse applicazioni di sulfidogenesis della biotecnologia ambientale, una delle applicazioni più utilizzate del metabolismo dei batteri solfato riducenti in consorzi con fermentazione batteri è in trattamento delle acque reflue. Reattori UASB sono tra i principali approcci di ingegneria al trattamento delle acque reflue industriali con alte concentrazioni di solfato. In questo lavoro, vi presentiamo un protocollo per ottenere fanghi sulfidogenic da sedimenti marini in un reattore UASB. Le fasi critiche nel prot...

Uno dei contributi più importanti alla biotecnologia ambientale è stata la progettazione di bioreattori in cui il fanghi utilizzati (inoculo) era in grado di eseguire in condizioni solfato riducendo. Riduzione solfato (SR) consente il trattamento dei flussi di acque reflue che contengono elevate concentrazioni di solfato oltre alla rimozione simultanea di COD, metalli pesanti e inquinanti organici, un fatto che rende una caratteristica desiderabile SR dei fanghi 1. Alcuni esempi di effluenti contaminati con solfato provengono da conceria, carta, farmaceutico e manifatturiero industrie chimiche 1. Tuttavia, la maggior parte della letteratura si riferisce a sulfidogenic fanghi quando metanogenica fango granulare è stata adattata per sulfidogenesis 2. Questo adattamento è comunemente ottenuto manipolando il COD / SO 4 2- rapporto nel bioreattore e aggiunta di prodotti chimici per inibire methanogens del 2,3 fanghi. In aggiunta al tempo che may richiedere la formazione di granuli sulfidogenic, la competizione tra methanogens e riduttori di solfato e la tolleranza del fango ad alte concentrazioni di solfuro sono alcuni dei problemi principali che possono insorgere se l&#39;fanghi sulfidogenic utilizzato nel bioreattore è ottenuto dall&#39;adattamento di prevalentemente fanghi metanogenica di solfato condizioni riducenti. In questo lavoro, si descrive la procedura per ottenere un fango prevalentemente sulfidogenic da sorgenti idrotermali sedimenti (Punta Mita, Nayarit, Messico) in un anaerobico reattore fanghi coperta flusso verso l&#39;alto (UASB), poi si valuta il suo solfato riducendo l&#39;attività nel tempo e condurre un esperimento per valutare la sua applicazione su declorazione riduttiva. La posizione dei sedimenti è stato scelto perché è stato riferito che in quel sito vi è formazione di solfuri dovuta all&#39;attività solfato riducendo esibito dalla comunità microbica che abitano quel determinato posto 4. Ci sono severAl vantaggi nell&#39;ottenere questo fanghi sulfidogenic da sedimenti più di adattarsi metanogenica fango granulare a sulfidogenesis. Alcuni di questi vantaggi sono: (1) non è necessario formare granuli per il bioreattore di operare, (2) i fanghi tollera concentrazioni relativamente elevate di solfuro rispetto ad altri UASB che operano con adattato fanghi methanogenic, e (3) non viene competizione per substrato con methanogens anche se acetato è utilizzato nella miscela di acidi grassi volatili che è incluso nel mezzo di coltura per promuovere la formazione di fanghi. Questa procedura è stata seguita per promuovere sulfidogenesis perché sedimenti marini sono una piscina naturale di una grande varietà di microrganismi come batteri solfato riduzione, fermentazione batteri e dealogenante batteri solo per citarne alcuni 5,6. Il tipo di consorzio sviluppato da sedimenti marini utilizzando questo protocollo può presentare efficienza nella riduzione solfato e quindi, alti s<html> ulfate riducendo l&#39;attività nel tempo e maggiore tolleranza al solfuro a concentrazioni superiori al segnalato come tossici per methanogens e solfato riducendo batteri. D&#39;altro canto, è probabile che la capacità dealogenante è anche mostrato nei sedimenti seguendo il protocollo qui proposto ma può dipendere dalla comunità microbica originale. Questa ipotesi viene fatto sulla base del fatto che la declorazione riduttiva può avvenire sia con la respirazione o co-metabolismo, entrambe le condizioni che possono essere promossi nella comunità microbica marina 7. La coltivazione dei sedimenti per ottenere i fanghi è stata condotta utilizzando una miscela di acetato, propionato e butirrato come substrato perché questi acidi grassi volatili sono utilizzati da diversi ceppi di batteri solfato-riduzione. Questi acidi sono anche il tipo di composti di carbonio spesso si trovano nei sedimenti marini, secondo diversi rapporti in letteratura sul materiale carbonioso in sedimenti marini 5,6. content &quot;&gt; Infine, alcuni dei composti più tossici che si trovano in corpi idrici e altri acqua in tutto il mondo sono i solventi clorurati come il tricloroetilene (TCE) o percloroetilene (PCE). Questi composti sono tossici, non solo per l&#39;essere umano, ma anche a microrganismi, in particolare TCE, che è ancora considerato un inquinante prioritario dall&#39;Agenzia di Protezione Ambientale degli Stati Uniti 8. In questo lavoro abbiamo proposto un esperimento in cui i fanghi sulfidogenic è testato su sua capacità di ridurre TCE a concentrazioni che sono nella gamma riportato per composti clorurati biodegradazione in condizioni methanogenic 9,10. Vale la pena ricordare che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è stata condotta in condizioni methanogenic 9,10. Riteniamo che l&#39;esperimento con TCE proposto in questo protocollo è un buon esempio delle potenziali applicazioni del fango. L&#39;obiettivo di questo esperimento era di evalutare la tolleranza del fango al TCE e l&#39;effetto TCE sul solfato riduzione dell&#39;attività. Tenendo conto che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è effettuata in condizioni methanogenic, questo protocollo suggerisce la formazione di un fango può essere usato per simultaneamente: (1) rimuovere solfato, (2) rimuovere COD e (3) rimuovere composti clorurati. Un ulteriore passo potrebbe essere quello di valutare l&#39;fanghi sulla rimozione simultanea del TCE e metalli pesanti (in aggiunta a solfato e COD), due condizioni che non possono essere valutati in condizioni methanogenic.

<table><tbody><tr><td>tricloroetilene&nbsp;</td><td>sigma Aldrich</td><td>251402</td><td></td></tr><tr><td>cis-1,2-dicloroteilene</td><td>sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trans-1,2-dicloroetilene</td><td>sigma Aldrich</td><td>D-62209</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di vinile scotty standard</td><td>supelco</td><td></td><td>1.000 ppm v/v in azoto</td></tr><tr><td>etene scotty standard</td><td>supelco</td><td></td><td>99% purezza</td></tr><tr><td>pompa</td><td>Masterflex</td><td></td><td>modello 7553-75</td></tr><tr><td>spettrofotometro</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siringhe a tenuta di gas&nbsp;</td><td>qualsiasi</td><td></td> reattore in vetro UASB da <td>100 e 200 microlitri</td></tr> qualsiasi <tr><td></td><td></td><td></td> gascromatografo <td>in fase di progettazione</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>rivelatore FID</td></tr>, <tr><td>colonna capillare, SPB-624</td>, pHmetro <td>supelco</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo in viton,</td> terreni basali <td>Masterflex,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>reagenti</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metalli in tracce</td>, <td>reagenti qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vitamine, reagenti in soluzione</td>, <td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solfato di sodio</td>, <td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acido grasso volatile,</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit per la determinazione del COD</td><td>, gamma HACH</td><td></td><td>, 0-15.000 mg/L</td></tr>, <tr><td>kit di clonazione TOPO-TA, pCR&reg; 4,0&nbsp;</td><td>Invitrogen, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S.N.A.P. TM Kit di Miniprep&nbsp;</td><td>Invitrogen, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di miniprep per plasmidi rapidi Pure link TM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di sulfidogenic fanghi da marine sedimenti e tricloroetilene riduzione in una coperta reattore upflow anaerobica dei fanghi

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

L'importanza della riduzione microbica dei solfati si basa sulle varie applicazioni che offre nella biotecnologia ambientale. La riduzione ingegnerizzata del solfato viene utilizzata nel trattamento delle acque reflue industriali per rimuovere grandi concentrazioni di solfato insieme alla domanda chimica di ossigeno (COD) e ai metalli pesanti. L'approccio più comune al processo è con bioreattori anaerobici in cui i fanghi solfidogenici sono ottenuti attraverso l'adattamento di fanghi granulari prevalentemente metanogenici alla solfidogenesi. Questo processo può richiedere molto tempo e non sempre elimina la competizione per il substrato a causa della presenza di metanogeni nei fanghi. In questo lavoro, proponiamo un nuovo approccio per ottenere fanghi solfidogenici in cui i sedimenti delle bocche idrotermali sono la fonte originale di microrganismi. La comunità microbica sviluppata in presenza di solfato e acidi grassi volatili è sufficientemente ampia da sostenere la riduzione del solfato per un lungo periodo di tempo senza mostrare inibizione dovuta al solfuro. 
Questo protocollo descrive la procedura per generare i fanghi dai sedimenti in un tipo di reattore a copertura anaerobica di fanghi (UASB). Inoltre, il protocollo presenta la procedura per dimostrare la capacità dei fanghi di rimuovere mediante declorazione riduttiva un modello di un inquinante organico altamente tossico come il tricloroetilene (TCE). Il protocollo è diviso in tre fasi: (1) la formazione del fango e la determinazione della sua attività di riduzione del solfato nell'UASB, (2) l'esperimento per rimuovere il TCE dal fango e (3) l'identificazione di microrganismi nel fango dopo la riduzione del TCE. Sebbene in questo caso i sedimenti siano stati prelevati da un sito situato in Messico, la generazione di un fango solfidogenico utilizzando questa procedura può funzionare se viene prelevata una diversa fonte di sedimenti, poiché i sedimenti marini sono un pool naturale di microrganismi che possono essere arricchiti in batteri solfato-riduttori.

Un comportamento tipico della riduzione solfato nel bioreattore è mostrato in Figura 5. E &#39;importante notare che durante le prime settimane di riduzione solfato funzionamento sarà lenta. Tuttavia lento, il consumo di oltre il 90% di solfato nel tempo indica che l&#39;inoculo sta sviluppando una comunità microbica in grado di ridurre solfato e quindi arricchito in solforiduttori batteri. I diversi periodi della cifra indicano che la riduzione del solfato aumentava la sua velocità nel...

La riduzione microbica del solfato è un processo di grande importanza nella biotecnologia ambientale. Il successo dei reattori solfidogenici dipende, tra l'altro, dalla composizione microbica dei fanghi. Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare fanghi solfidogenici da sedimenti di bocche idrotermali in un reattore UASB per scopi di declorazione riduttiva.

Sviluppo di Sulfidogenic fanghi da Marine Sedimenti e Tricloroetilene Riduzione in una coperta reattore Upflow anaerobica dei fanghi

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un fango solfurogeno a partire da sedimenti marini in un reattore A-U-A-S-B e valutarne le prestazioni nella riduzione del TRICLOROETILENE o TCE. Questo viene ottenuto raccogliendo sedimenti marini per ottenere un pool di una grande varietà di microrganismi arricchiti in batteri riduttori di solfato, quando posti in un ambiente contenente il minerale appropriato, vitamine del mezzo e acidi grassi volatili da utilizzare come donatori di elettroni. Come secondo passaggio, i sedimenti marini vengono utilizzati come inocolo in un reattore A-U-A-S-B, che viene impostato e mantenuto in condizioni di riduzione del solfato per diverse settimane fino al raggiungimento di un'attività stabile di riduzione del solfato.Successivamente, il consorzio nel reattore UASB sulfidogenico viene valutato per la riduzione del TCE al fine di verificare la capacità del fango di trasformare inquinanti organici mentre la sulfidogenesi è ancora attiva. I risultati mostrano che la sulfidogenesi si è stabilizzata nel biorreattore e che il fango è stato in grado di ridurre il TCE in condizioni di riduzione del solfato, sulla base dell'analisi della comunità microbica, suggerendo che la riduzione del TCE è stata effettuata da un consorzio formato da batteri solfatoriduttori e batteri fermentativi. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come l'adattamento di consorzi metanogeni alla tossicità, è che il consorzio ottenuto è tollerante a concentrazioni più elevate di solfato e non presenta competizione per il substrato con i metanogeni.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché si aspettano una formazione immediata della nicchia. Potrebbero essere portate ad aggiungere i nutrienti e il solfuro nel biorreattore con una frequenza inferiore o superiore a quella richiesta. Questi approcci portano inevitabilmente a uno squilibrio del sistema.È conveniente eseguire analisi periodiche di COD, solfato e solfato per monitorare l'andamento della reazione e determinare il momento ottimale per il successivo prelievo. Abbiamo sviluppato per la prima volta l'idea di questo metodo perché desideravamo ottenere un impianto solfogenico altamente attivo, in grado di combinare la rimozione di materia organica e di inquinanti, obiettivo che non può essere raggiunto in condizioni metageniche, specialmente quando alcuni inquinanti sono mescolati con metalli pesanti. Abbiamo utilizzato un metodo generale con attrezzature adeguate per l'identificazione dei batteri nel consorzio.La regione genica 16 S-R-R-N-A è stata l'obiettivo dell'analisi, e abbiamo riscontrato interessanti generalità batteriche. Per iniziare questa procedura, raccogliere i campioni marini come descritto nel protocollo testuale. Una volta in laboratorio, prelevare una porzione consistente del campione di sedimento e utilizzare una maglia adeguata per eliminare i detriti grossolani di materiale carbonaceo dai sedimenti.Dopo aver fatto passare il sedimento attraverso il setaccio, mescolare la porzione selezionata per garantire che sia omogenea. Ai fini del presente lavoro, utilizzare un reattore in vetro a letto di fanghi anaerobici con flusso ascendente con un volume totale di lavoro di tre litri. Assicurarsi che i volumi finali della soluzione tampone del mezzo basale per i sedimenti e degli acidi grassi volatili siano uguali al volume totale di lavoro del reattore.Preparare una soluzione madre di mezzo basale contenente cloruro di fosfato, azoto, sali di magnesio, metalli traccia e vitamine con una soluzione tampone di bicarbonato, tenendo conto del volume operativo del reattore. Successivamente, preparare una soluzione nutritiva di acidi grassi volatili composta da acetato, propionato e butirrato. In un rapporto di domanda chimica di ossigeno (COD) di 2,5 a uno a uno, la concentrazione finale di COD nel reattore deve essere di 2,7 grammi per litro.Infine, preparare una soluzione madre di solfato di sodio a una concentrazione appropriata per fornire al reattore una concentrazione finale di 4.000 milligrammi per litro di ione solfato. Una volta preparate le soluzioni, posizionare i sedimenti nel reattore mescolati con una porzione del mezzo basale per assicurarsi che raggiungano il fondo del reattore. Mescolare il resto del mezzo basale e della soluzione tampone con la soluzione di acidi grassi volatili e la soluzione di solfato.Assicurarsi che la soluzione di acidi grassi volatili venga versata nel liquido. Successivamente, aggiungere le soluzioni combinate al reattore. Configurare le connessioni e le tubazioni del reattore sulla pompa di ricircolo.Quindi impostare la portata di ricircolo a 60 millilitri al minuto. Posizionare il bioreattore nella camera termoregolata a 34 gradi Celsius regolarmente. Verificare che le variazioni di temperatura siano minime.Infine, impostare le connessioni alla colonna di spostamento del gas. Dopo una settimana di incubazione, prelevare un campione di cinque-sette millilitri del liquido per effettuare l'analisi del contenuto di COD, solfato e solfuro e del pH. Analizzare il solfuro nel liquido utilizzando il metodo del blu di metilene, seguendo i metodi standard.Prima di tutto, versare cinque millilitri di una soluzione di acetato di zinco in un matraccio tarato da 25 millilitri. E aggiungere rapidamente 200 microlitri del campione alla soluzione di acetato di zinco. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di una soluzione di DMP e 125 microlitri di una soluzione di solfato ammonico ferrico.Completare fino a 25 millilitri nel matraccio con acqua distillata. Attendere 30 minuti affinché avvenga la reazione e il colore blu si stabilizzi. Al termine della reazione, attendere almeno 15 minuti, ma non più di 60 minuti.Per analizzare i campioni nello spettrofotometro, effettuare la lettura della soluzione blu finale nello spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 670 nanometri. Quantificare il solfato come solfato di bario utilizzando un metodo turbidimetrico. Prima, aggiungere cinque millilitri di una soluzione tampone in un matraccio tarato da 25 millilitri.Quindi aggiungere un millilitro del campione precedentemente centrifugato a 11.320 ×g. Portare a 25 millilitri nel matraccio con acqua distillata e aggiungere un grammo di cloruro di bario. Mescolare la soluzione per un minuto in un vortex. Attendere quattro minuti per la formazione del solfato di bario e leggere il campione al fotometro a una lunghezza d'onda di 420 nanometri.Per preparare la determinazione del COD, centrifugare accuratamente il campione per rimuovere il solfuro residuo che potrebbe interferire con la determinazione del COD. Dopo la centrifugazione, aggiungere due millilitri del campione in un vial di reazione del kit per la determinazione del COD. Chiudere ermeticamente il vial e omogeneizzare la miscela mediante un'agitazione delicata.Preparare un bianco aggiungendo due millilitri di acqua distillata in un altro vialino da reazione e omogeneizzare la miscela. Posizionare i vialini nel reattore di digestione a 150 gradi Celsius per due ore. Successivamente, rimuovere i vialini e lasciarli raffreddare al buio.Effettuare le letture dei campioni nel fotometro a una lunghezza d'onda di 620 nanometri. Successivamente, ottenere il volume del gas dalla colonna di spostamento del gas. Una volta che il solfato è stato consumato, fornire mezzo fresco e nuovi nutrienti per ogni partita.Come fatto in precedenza, quando il consumo di solfato supera l'80% in meno di 24 ore e questo si verifica per più di una settimana, passare al funzionamento del reattore in modalità continua. Impostare il tempo di ritenzione idraulico (HRT) a 24 ore regolando il flusso della pompa e mantenere la concentrazione di solfato a quattro grammi per litro e la COD a 10 grammi per litro ogni giorno. Fermare il reattore dopo un ciclo di HRT e fornire un nuovo mezzo fresco con nutrienti per ogni batch, come fatto in precedenza, utilizzando una concentrazione di COD di 10 grammi per litro.Dopo l'alimentazione del biorreattore, prelevare campioni di liquido di cinque-sette millilitri ed eseguire l'analisi di COD, solfato, solfuro e pH ogni ora. Registrare inoltre il volume di gas prodotto per il test del TCE. Preparare una soluzione madre di TCE tenendo presente che la concentrazione finale di questo composto nella fase liquida del biorreattore deve essere di 300 micromolare.Considerare il ripartizionamento del composto nella fase gassosa utilizzando la costante adimensionale di Henry per il TCE a 34 gradi Celsius. Successivamente, preparare curve standard nel cromatografo a gas per ciascuno dei composti da analizzare, utilizzando i metodi indicati nel protocollo testuale in qualsiasi giorno specifico. Arrestare il reattore dopo un ciclo di tempo di ritenzione idraulico (HRT) e fornire fresco mezzo e nuovi nutrienti per ogni batch, come fatto in precedenza, utilizzando una concentrazione di COD di 10 grammi per litro.Dopo aver alimentato il biorreattore, aggiungere il TCE direttamente nel liquido all'interno del biorreattore dalla soluzione stock. La concentrazione finale di TCE nella fase liquida del biorreattore deve essere di 300 micromolare. Impostare il tempo di ritenzione idraulico (HRT) a 12 ore al termine di un ciclo di HRT.Prelevare campioni del liquido ed eseguire l'analisi di COD, solfato e solfuro. Prelevare inoltre campioni dell'atmosfera gassosa e analizzarli mediante gascromatografo. Di seguito è riportato un andamento tipico della riduzione del solfato nel bioricettore.È importante notare che durante le prime settimane di funzionamento la riduzione del solfato sarà lenta. I diversi periodi indicano che la velocità di riduzione del solfato è aumentata nel tempo fino a quando 4.000 milligrammi per litro di solfato sono stati consumati in meno di 24 ore. Successivamente, il reattore ha operato in regime continuo.Lo sviluppo del fango è mostrato nei risultati rappresentativi del reattore sulla riduzione del solfato. Qui vengono mostrate la concentrazione di solfuro, il consumo di COD e le variazioni di pH nel tempo. Questi risultati sono stati ottenuti da esperimenti condotti dopo che il biorreattore aveva raggiunto un regime continuo da diverse settimane.Per l'esperimento in cui il fango è stato testato per la capacità di ridurre il TCE, i risultati ottenuti sono mostrati qui. L'attività di riduzione del solfato ottenuta è risultata leggermente inferiore rispetto a quella ottenuta prima dell'aggiunta del TCE. Il cromatografo gassoso ha rivelato che circa l'80% del TCE è stato ridotto a etene. Batteri riduttori di solfato, batteri fermentanti e batteri dealogenanti sono stati identificati nel fango sviluppato utilizzando questo protocollo.I generi di batteri come Sulfa vibrio de sulfa, microbial desulfide bacterium, Clostridium deha backer e SUL fossum sono stati associati alla riduzione del solfato e alla biodegradazione di composti clorurati. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in modo analogo con diversi sedimenti marini, purché venga effettuata correttamente. Il tempo necessario per lo sviluppo di questo sistema può dipendere dalla provenienza dei sedimenti. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordare che la cosa più importante è verificare periodicamente il bilancio di massa relativo al COD, al solfato e al solfuro.Più attivo è il lodge ottenuto, maggiore è la possibilità di utilizzarlo per la riduzione del TCE e, eventualmente, per la degradazione di qualsiasi altro composto tossico che possa essere degradato in condizioni di riduzione del solfato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare il Genics Lodge a partire da sedimenti marini in un reattore USB e di come valutarne le prestazioni nella riduzione del TC. Dovresti comprendere come inoculare il reattore, come seguire la reazione di riduzione nel tempo e come condurre un test sulla riduzione del TCE seguendo questa procedura.Altri metodi come il sequenziamento del periodo o l'analisi di altri geni possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quanti batteri abbiamo in generale, o in che modo il consorzio può degradare il TCE in un ambiente fotogenico.

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