Realizzazione di una sede a PCL Bioactive, "Self-fitting" Shape Memory Polymer Ponteggio
23 ottobre 2015
Sono interessanti gli scaffold in grado di adattarsi ai difetti ossei cranio-maxillo-facciali (CMF) mentre mostrano osteoconduttività e bioattività. Questo protocollo descrive la preparazione di un'impalcatura a memoria di forma a base di policaprolattone diacrilato (PCL-DA) utilizzando un metodo di lisciviazione del particolato con colata di solvente (SCPL) che impiega un modello di sale fuso e l'applicazione di un rivestimento bioattivo in polidopamina.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è fabbricare un impalcatura in polimero a memoria di forma, o SMP, in grado di adattarsi autonomamente a un difetto cranio-massofacciale irregolare al fine di promuovere l'osteointegrazione e la guarigione ossea. Questo risultato si ottiene innanzitutto formando un modello fuso di sale mediante la tecnica di fusione in solvente e la polimerizzazione fotochimica del diacrilato di policaprolattone. Sopra il modello di sale si forma un'impalcatura con una porosità altamente interconnessa, necessaria per l'osteoconduttività.
Come secondo passaggio, il scaffold viene rivestito con polidopamina, che ne conferisce bioattività. Successivamente, il scaffold viene trattato con soluzione salina calda, che ne permette l'inserimento forzato in un modello irregolare. I risultati del difetto mostrano un auto-adattamento, una scarsa interconnessione e una limitata bioattività, basati sui risultati dell'inserimento forzato, sull'immagine ottenuta mediante microscopia elettronica a scansione e sulla formazione in vitro di idrossiapatite.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'autotrapianto, è che l'adattamento conformabile ottenuto sostiene in modo critico l'osteointegrazione e la guarigione ossea. Lindsey Nail, ricercatrice dottoranda nel mio laboratorio, dimostra questa procedura. Per iniziare la preparazione dello scaffold, setacciare prima il cloruro di sodio attraverso un setaccio da 425 micron e trasferire 1,8 grammi del materiale in un vial di vetro da tre litri; aggiungere lentamente 146 milligrammi di acqua deionizzata al vial, mescolando con una spatola metallica.
Dopo ogni aggiunta, chiudere la provetta con un tappo, avvolgerla in un fazzoletto di carta e posizionarla verticalmente in un tubo da centrifuga. Centrifugare il tubo per 15 minuti, quindi togliere il tappo e lasciare asciugare la soluzione all'aria durante la notte. Dopo aver sintetizzato P-C-L-D-A come indicato nel protocollo testuale, preparare una soluzione macerante contenente 150 milligrammi di P-C-L-D-A per millilitro di clorometano in una provetta di vetro, chiudere la provetta con un tappo, avvolgerla in alluminio e sottoporla a vortex per un minuto.
Successivamente, preparare una soluzione di iniziatore fotochimico contenente 115 milligrammi di DMP in un millilitro di one vinyl, two Perone in un vial di vetro. Chiudere nuovamente il vial, avvolgerlo nella pellicola di alluminio e sottoporlo a vortex per un minuto. Pipettare la soluzione di iniziatore fotochimico nella soluzione macer per ottenere una miscela al 15% in volume e sottoporre il vial a vortex per un minuto.
Successivamente, avvolgere il vial contenente l'impalcatura salina con della pellicola di alluminio e aggiungere la miscela maceratrice di iniziatori fotochimici fino a coprire il sale. Chiudere il vial, avvolgerlo in un fazzoletto di carta e posizionarlo verticalmente all'interno di un tubo da centrifuga. Centrifugare il tubo per 10 minuti.
Successivamente, rimuovere la lamina di alluminio, togliere il tappo della provetta ed esporre la soluzione alla luce ultravioletta per tre minuti. Quindi lasciare asciugare all'aria la soluzione durante la notte, fare un'incisione e rompere il vetro per rimuovere la parte superiore della provetta utilizzando pinze. Trasferire l'impalcatura in una soluzione acquosa di etanolo al rapporto uno a uno per quattro giorni, cambiando la soluzione ogni giorno.
Infine, rimuovere l'impalcatura in SMP ed essiccarla all'aria per tutta la notte. Per applicare prima il rivestimento di polidopamina, inserire un ago da 20 gauge a metà dell'impalcatura in SMP, quindi avvolgere un filo intorno al bocchettone dell'ago. Immergere l'impalcatura in 200 millilitri di una soluzione di dopamina sotto agitazione e mantenere il bocchettone dell'ago al di sopra della soluzione fissando il filo al bordo del becher.
Successivamente, inserire una siringa nel connettore dell'ago e tirare lo stantuffo per rimuovere l'aria dalla struttura porosa. Una volta completamente disgassata, lasciare la struttura porosa immersa per 16 ore. Rimuovere la struttura porosa dalla soluzione ed estrarre l'ago.
Quindi risciacquare l'impalcatura con acqua deionizzata e asciugarla in forno sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 ore. Posizionare l'impalcatura in un forno di essiccazione a 85 gradi Celsius per un'ora. Infine, rimuovere l'impalcatura e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
Per prima cosa, preparare un modello di difetto praticando un foro irregolare con un diametro medio di circa sei millimetri in un foglio di plastica rigida spesso cinque millimetri. Successivamente, immergere l'impalcatura in materiale a memoria di forma (SMP) in un becher contenente acqua deionizzata a circa 60 gradi Celsius per due minuti. Verificare che l'impalcatura si sia notevolmente ammorbidita utilizzando pinzette per manipolarne la forma.
Rimuovere l'impalcatura ammorbidita dall'acqua con pinzette e premervela manualmente all'interno del modello di difetto. Lasciare raffreddare l'impalcatura a temperatura ambiente, quindi rimuoverla dal modello di difetto. Osservare la nuova forma temporanea stabilizzata per visualizzarne porosità, interconnessione e dimensioni.
Per prima cosa, immergere l'impalcatura SMP nell'azoto liquido per un minuto utilizzando pinzette. Quindi, fratturare l'impalcatura lungo la metà con una lametta pulita. Successivamente, fissare una delle metà dell'impalcatura con la superficie fratturata rivolta verso l'alto sullo stadio del campione.
Utilizzando nastro di carbonio, sottoporre l'impalcatura a un rivestimento con lega di oro e platino mediante sputtering fino a una profondità di circa quattro nanometri. Caricare il campione nel microscopio elettronico a scansione (SEM) e acquisire quindi l'immagine a una tensione di accelerazione compresa tra 10 e 15 chilovolt. Per caratterizzare la bioattività in vitro.
Tagliare innanzitutto un impalcatura cilindrica di SMP a metà lungo il bordo circolare utilizzando una lama pulita. Posizionare una metà dell'impalcatura in un tubo contenente 30 millilitri di fluido corporeo simulato, quindi inserire il tubo in un bagno d'acqua stazionario a 37 gradi Celsius dopo 14 giorni. Rimuovere l'impalcatura dal tubo e lasciarla asciugare all'aria per 24 ore.
Successivamente, fissare l'impalcatura con la superficie tagliata rivolta verso l'alto sul portacampioni di un microscopio elettronico utilizzando nastro di carbonio. Quindi, ricoprire la superficie dell'impalcatura con un lega di oro e platino mediante sputtering, fino a uno spessore di circa quattro nanometri. Come in precedenza, inserire il campione nel microscopio elettronico a scansione (SEM) e acquisire l'immagine con una tensione di accelerazione compresa tra 10 e 15 chilovolt.
Un impalcatura in SMP diventa malleabile riscaldandola a 60 gradi Celsius e può essere adattata all'interno di un modello di difetto. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, l'impalcatura in SMP viene rimossa e mantiene la sua nuova forma temporanea fissata. Nell'immagine ottenuta tramite microscopia elettronica a scansione dell'impalcatura in SMP non rivestita sono visibili la struttura porosa e la morfologia altamente interconnessa.
L'attività biologica del telaio polimerico a memoria di forma rivestito con polidopamina è dimostrata dalla formazione di idrossiapatite nei pori, come mostrato nella microfotografia al microscopio elettronico a scansione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un telaio polimerico a memoria di forma bioattivo e autoadattabile, mediante un processo che prevede la colata di solvente su un modello di sali e la successiva rimozione delle particelle di sale, nonché l'applicazione di un rivestimento di polidopamina.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla fabbricazione di un impalcatura in polimero a memoria di forma progettata per adattarsi a difetti cranio-massofacciali irregolari, promuovendo l'osteointegrazione e la guarigione. L'impalcatura viene creata utilizzando un modello di sale fuso ed è rivestita con polidopamina per migliorare la bioattività.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biomateriali
- Medicina Rigenerativa
Sfondo
- I difetti cranio-masseterici richiedono soluzioni innovative per una guarigione efficace.
- I polimeri a memoria di forma possono adattarsi a forme irregolari, migliorando l'adattamento e la funzionalità.
- I rivestimenti bioattivi potenziano l'interazione tra lo scaffold e i tessuti biologici.
- L'osteoconduzione è fondamentale per l'integrazione riuscita degli scaffold nella riparazione ossea.
Scopo dello studio
- Sviluppare un'impalcatura che si adatti autonomamente ai difetti cranio-massofacciali.
- Valutare le capacità di osteointegrazione dell'impalcatura.
- Valutare l'efficacia del rivestimento in polidopamina nel potenziare la bioattività.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di un stampo in sale fuso mediante fusione in solvente.
- Polimerizzazione fotochimica del diacrilato di policaprolattone (PCL-DA).
- Rivestimento dell'impalcatura con polidopamina.
- Trattamento con soluzione salina calda per l'inserimento forzato nei modelli.
Risultati principali
- Il scaffold ha dimostrato capacità di auto-adattamento in modelli irregolari.
- La microscopia elettronica a scansione ha rivelato la porosità interconnessa dello scaffold.
- Test in vitro hanno mostrato una formazione riuscita di idrossiapatite.
- I risultati hanno indicato una buona bioattività e osteoconduzione.
Conclusioni
- Il supporto sviluppato è promettente per applicazioni cranio-massofacciali.
- Il rivestimento di polidopamina migliora significativamente la bioattività.
- Sono necessari ulteriori studi per valutare l'integrazione a lungo termine e i risultati della guarigione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo affronta una sfida fondamentale nell'ingegneria tissutale cranio-massillare: la creazione di impalcature in grado di adattarsi a difetti ossei irregolari mantenendo al contempo bioattività e integrità strutturale. L'impalcatura in polimero a memoria di forma consente un autoadattamento al difetto mediante attivazione termica, favorendo l'osteointegrazione e riducendo la complessità chirurgica. Questo approccio migliora l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici di rigenerazione ossea fornendo una piattaforma regolabile e bioattiva per l'implantazione specifica del difetto.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi osteoinduttivi in microambienti biomimetici adattativi ai difetti.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per valutare le interazioni tra impalcatura e ospite in condizioni fisiologicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera strutture porose standardizzate e interconnesse per un'agevole semina cellulare e una diffusione uniforme dei nutrienti.
- Valore operativo: Consente un'analisi ad alta fedeltà di rivestimenti biomaterici e agenti bioattivi in architetture tridimensionali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la riparazione di difetti di dimensione critica con attuazione a memoria di forma, migliorando la rilevanza anatomico nei studi preclinici.
- Valore operativo: Collega la fase di scoperta agli studi abilitanti per l'IND mediante una fabbricazione scalabile basata sulla tecnica di solvent-casting, compatibile con flussi di lavoro vicini alle buone pratiche di produzione (GMP).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la selezione di biomateriali nelle fasi iniziali, il perfezionamento iterativo della progettazione e la validazione della funzionalità bioattiva prima della selezione del candidato principale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui segnali osteogenici mediati dai materiali in nicchie dinamiche adattabili ai difetti.
- Screening: Fornisce scaffold pronti per i saggi, con interconnessione porosa quantificabile e bioattività superficiale, per la valutazione di composti o rivestimenti.
- Analisi: Permette la valutazione quantitativa della formazione di idrossiapatite e del recupero della forma come parametri funzionali delle prestazioni del biomateriale.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla ricerca di base alla validazione preclinica simulando geometrie di difetto clinico e condizioni fisiologiche di attivazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare per l'ottimizzazione iterativa dei biomateriali in diverse indicazioni craniofacciali e ortopediche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la validazione degli obiettivi riducendo i falsi negativi derivanti da un inadeguato adattamento tra scaffold e difetto nei saggi di guarigione ossea.
- Valore operativo: Garantisce coerenza tra diversi lotti mediante parametri standardizzati di lisciviazione salina e fotopolimerizzazione.
- Valore strategico: Riduce i rischi nell'avanzamento preclinico dimostrando conformità al difetto e bioattività in modelli pertinenti.
- Impatto sul portafoglio: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione dei programmi sui biomateriali integrando precocemente parametri di prestazione strutturale e biologica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sintesi di polimeri, nell'uso della tecnica di colata da soluzione e nei rivestimenti di biomateriali.
- È vincolato alla disponibilità di infrastrutture per la polimerizzazione UV e di attrezzature per cicli termici controllati, necessarie per l'attivazione della memoria di forma.
- Necessita di protocolli standardizzati per la valutazione dell'interconnessione dei pori e della quantificazione della bioattività tra diversi gruppi di lavoro.
- Deve tenere conto della variabilità nella dimensione delle particelle di sale e nella concentrazione del polimero, che influiscono sulle proprietà meccaniche e sulla degradazione dell'impalcatura.
- È limitato dalla necessità di un controllo preciso della temperatura durante l'impianto dell'impalcatura, per evitare un recupero di forma prematuro.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:38
Preparation of the Shape Memory Polymer (SMP) Scaffold
4:13
Applying the Polydopamine Coating to the SMP Scaffold
5:24
Demonstrating the Self-fitting Behavior of the SMP Scaffold
6:20
Characterization of the SMP Scaffold using Scanning Electron Microscopy
8:14
Results: Shape Memory Behavior and Properties of SMP Scaffolds
9:04
Conclusion
