Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Questo studio mira a sviluppare tessuti cardiaci 3D biometrici utilizzando impalcature elettriche a fusione e cellule cardiache derivate da iPSC umane per migliorare la modellazione delle malattie, i test sui farmaci e le applicazioni di medicina rigenerativa. I cardiomiociti con cellule staminali rimangono immaturi, limitandone la funzionalità. Inoltre, è difficile riprodurre la grave complessità richiesta per modellare il tessuto cardiaco in 3D.

Questo modello imita meglio il miocardio nativo, consentendo complesse interazioni con la matrice extracellulare 3D per la modellazione della malattia, i test farmacologici e le applicazioni specifiche del paziente. Offre un'alternativa più pertinente alle culture 2D e ai modelli animali. In futuro, la nostra ricerca si concentrerà sullo studio di modelli cardiomicologici, sul miglioramento dei protocolli di maturazione tissutale 3D e sullo sviluppo di costrutti più grandi per terapie precliniche di infarto miocardico in modelli animali di grandi dimensioni come i suini.

Per iniziare, collegare la siringa a un tubo di alimentazione dell'azoto pressurizzato e introdurla all'interno della camera di riscaldamento. Accendere l'attrezzatura di scrittura per elettrofilatura a fusione e impostare i regolatori di temperatura a 80 gradi Celsius per la camera e 65 gradi Celsius per l'ugello. Dopo 30 minuti, spostare la piastra di raccolta fino a quando la testina di stampa non si trova su un bordo della lastra o nella posizione desiderata.

Regolare manualmente la distanza tra la camera di riscaldamento e la piastra del collettore a 10 millimetri nel piano z. Chiudere lo sportello dell'apparecchiatura, che collega automaticamente l'alimentazione del campo elettrico. Impostare la tensione a sette kilovolt di pressione dell'azoto a due bar per l'estrusione attraverso la punta del calibro 23.

Caricare il codice G del disegno nel software per stampare impalcature con una geometria quadrata. Regolare la velocità del collettore a 1080 millimetri al minuto. Quindi premere il pulsante Avvio ciclo per avviare la stampa.

Al termine della stampa, rimuovere con cautela l'impalcatura dal raccoglitore. Tagliare la rete stampata utilizzando un punzone di sei millimetri di diametro per ottenere gli scaffold finali per la fabbricazione dei tessuti. Trattare gli scaffold per cinque minuti con plasma di ossigeno.

Sterilizzare le maglie immergendole in etanolo al 70% per 30 minuti. Lavateli abbondantemente con acqua distillata sterile per 30 minuti, quindi lasciateli asciugare. Dopo aver staccato i cardiomiociti iPSC umani, risospendere il pellet cellulare nel terreno di generazione tissutale e contare le cellule utilizzando la camera di Neubauer.

Allo stesso modo, dopo aver staccato i fibroblasti cardiaci iPSC umani, sospendere nuovamente il pellet cellulare nel terreno di generazione tissutale e contare le cellule. Mescolare le cellule totali necessarie in una nuova provetta e fare riferimento al contenuto come Cell Mix. E centrifugare a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi risospendere la miscela cellulare nel volume richiesto di terreno di generazione tissutale. Per generare la miscela di idrogel, aggiungere il volume richiesto di fibrinogeno alla provetta a temperatura ambiente e mescolare accuratamente. Seminare la miscela di idrogel su una superficie di politetrafluoroetilene per prevenire l'adesione della fibrina alla piastra.

Pipettare metà del volume del fazzoletto, lasciandolo a goccia. Posiziona un'impalcatura di policaprolattone, o PCL, sopra ogni goccia e aggiungi il volume rimanente sull'impalcatura. Ora, aggiungi la quantità necessaria di trombina e mescola rapidamente l'idrogel, evitando accuratamente le bolle.

Incubare i tessuti a 37 gradi Celsius per un'ora per completare la polimerizzazione della fibrina. Prelevare delicatamente ogni tessuto dal bordo utilizzando una pinzetta sterile e trasferirli su piastre a 12 pozzetti contenenti terreno di generazione tissutale integrato con aprotinina. Incubare i tessuti a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno seguente, rinfrescare il terreno con due millilitri di terreno di mantenimento tissutale, rimuovendo i residui di KSR e Y-27. La semina di una miscela otto a due di cardiomiociti iPSC umani e fibroblasti cardiaci iPSC umani in idrogel di fibrina determina una distribuzione uniforme delle cellule attraverso i pori dell'impalcatura entro un'ora dalla polimerizzazione. Le immagini confocali in immunofluorescenza hanno mostrato una distribuzione cellulare mista delle cellule attraverso il tessuto 3D che interagisce con l'impalcatura del LCP, con la maggior parte dei cardiomiociti iPSC umani colorati per actinina sarcomerica intervallati con fibroblasti cardiaci iPSC umani marcati con vimentina.

I cardiomiociti iPSC umani mostrano una struttura sarcomera ben organizzata dalla proteina acticina sarcomerica regolarmente distanziata. Le cellule hanno iniziato a battere spontaneamente entro il secondo giorno con una frequenza media di battito di 30 battiti al minuto al settimo giorno, mostrando una contrazione stabilizzata in tutta la mesh. Nel tempo è stato osservato un graduale declino, raggiungendo i 17 BPM entro il giorno 14.

Nonostante ciò, l'attività metabolica è rimasta stabile tra il settimo e il quattordicesimo giorno, confermando la vitalità cellulare sostenuta. Infine, l'analisi dei punti di traccia dei tessuti battitori ha mostrato una velocità di contrazione di 38 micrometri al secondo e un'ampiezza di contrazione di 29 micrometri.