Shape Memory Polymers per la Cultura cella attiva

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare cellule in un substrato con una topografia che cambia nel tempo. Ciò si ottiene programmando prima un polimero a memoria di forma in una forma permanente che può essere ricordata. Il polimero a memoria di forma viene quindi programmato in una forma temporanea su cui le celle vengono successivamente placcate.

La fase finale della procedura consiste nell'innescare il ritorno del polimero a memoria di forma alla sua forma permanente aumentando la temperatura, alla fine si possono ottenere risultati che mostrano un cambiamento nel comportamento cellulare attraverso la microscopia a fluorescenza. Ciao, mi chiamo Pat Mather. Sono un professore di ingegneria biomedica e chimica e direttore del Syracuse Biomaterials Institute qui alla Syracuse University.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto agli apparecchi commerciali o personalizzati per l'allungamento delle cellule è che in un singolo sistema polimerico siamo in grado di applicare un'ampia varietà di ceppi complessi alle cellule. Mi chiamo Jay Henderson. Sono un ricercatore universitario di Ingegneria Biomedica e Chimica e membro del Syracuse Biomaterials Institute.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanobiologia, come ad esempio il modo in cui le cellule rispondono ai cambiamenti dinamici nel loro ambiente fisico. Mi chiamo Kevin Davis e sono uno studente di dottorato presso la Syracuse University nel Dipartimento di Ingegneria Biomedica e Ingegneria Chimica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia meccanica 2D, può essere utilizzato anche per altri sistemi come gli scaffold 3D per l'ingegneria tissutale.

Prima di iniziare questa procedura, preparare una camera di polimerizzazione personalizzata utilizzando un vetrino di vetro, un distanziatore in teflon di un millimetro di spessore e una piastra di alluminio. Fissare la camera utilizzando piccole clip per legare per iniziare, iniettare NOA 63 nella camera attraverso un foro nel distanziatore in teflon utilizzando un ago calibro 18. Quindi posizionare la camera in una piastra calda impostata a 125 gradi Celsius.

Lasciare riscaldare la camera a una temperatura uniforme per cinque minuti dopo il riscaldamento della camera. Procurare il NOA 63 per 20 minuti posizionando una lampada UV a 6,5 centimetri dalla superficie del vetro. Rimuovere il NOA 63 dalla camera mentre è ancora caldo utilizzando una lama di rasoio.

Quindi post-polimerizza il polimero a memoria di forma sotto la luce UV per tre ore e 40 minuti direttamente sulla piastra calda a 125 gradi Celsius. Per caratterizzare la memoria di forma del NOA 63, preparare un campione di manubrio pressando a caldo la pellicola polimerizzata con un punzone personalizzato. Infine, detestare il campione in un analizzatore meccanico dinamico con dispositivo di trazione.

Impostare lo strumento in modalità forzata controllata e programmare la procedura di test come indicato nel protocollo scritto che accompagna questo video. Il risultato della procedura è un polimero a memoria di forma isotermicamente polimerizzato o un film SMP, che posiziona il CSMP in una piastra calda e imposta la temperatura su un valore superiore alla temperatura di transizione vetrosa per ridurre il modulo e facilitare il taglio. Per preparare campioni individuali dal film s e p polimerizzato isotermicamente.

Tagliare la pellicola s e p con un rasoio alla dimensione del campione desiderata. La forma temporanea può essere fissata in diversi modi. Qui. Una pressa idraulica da banco con piastre che possono essere riscaldate e raffreddate viene utilizzata per goffrare una topografia temporanea.

Innanzitutto, impostare la temperatura dei PLA a una temperatura superiore alla tg. Per questa dimostrazione, è stato realizzato un goffratore polimerizzando la resina epossidica su un disco in vinile per produrre una forma temporanea di solchi paralleli. Il goffratore può essere realizzato con altri materiali e con diverse topografie, ma deve essere più rigido del NOA 63.

Alla temperatura di goffratura, posizionare i campioni s e p a faccia in giù sulla goffratura. Quindi posizionare i campioni e il goffratore nella pressa. Applicare circa 100 kilo di pascal di precarico per entrare in contatto tra i PLA riscaldanti e i campioni vengono mantenuti per circa cinque minuti per consentire ai campioni di raggiungere una temperatura uniforme.

Una volta raggiunta una temperatura uniforme, applicare da uno a sei megapascal sui campioni e tenere premuto per un minuto. L'SMP si romperà. Se viene applicata una sollecitazione maggiore.

Applicare sollecitazioni più piccole per introdurre topografie con ampiezze più piccole. Dopo aver applicato la pressione, ridurre la temperatura al di sotto del TG utilizzando la capacità di raffreddamento ad acqua delle piastre della pressa. Quando la temperatura è inferiore alla tg, rimuovere la forza applicata prima di iniziare l'esperimento di coltura cellulare attiva.

La luce UV della cabina di sicurezza biologica viene utilizzata per sterilizzare i campioni. Disporre i campioni a faccia in giù in piatti sterili senza coperchio e accendere la luce UV per sei ore. Quindi capovolgere i campioni in nuove piastre sterili in posizione rivolta verso l'alto.

Accendi la luce UV per altre sei ore. I campioni devono essere equilibrati in uno stato relativamente stabile prima di essere placcati con le celle. Posizionare i campioni in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 150 microlitri di crescita completa.

Mezzo per pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore a 30 gradi Celsius con il 5% di CO2 fino a raggiungere il recupero parziale desiderato. Per questa dimostrazione, i campioni vengono incubati per 30 ore per produrre un'ampiezza sufficiente ad allineare le cellule.

Una volta ottenuto il recupero parziale, i campioni possono essere placcati con le cellule. Posizionare i campioni in una nuova piastra da 96 pozzetti. Quindi aggiungere 150 microlitri di soluzione cellulare a ciascuno dei campioni qui, C3 H 10 t e mezzo.

La maggior parte dei fibroblasti embrionali viene utilizzata a 20.000 cellule per millilitro. Per ottenere cellule isolate, lasciare che le cellule si attacchino e si diffondano sulla topografia temporanea incubando a 30 gradi Celsius per 9,5 ore. Successivamente, analisi della morfologia cellulare prima della transizione, mediante la rimozione dei campioni e l'esecuzione della colorazione e dell'imaging a fluorescenza dei campioni.

Questo materiale mostra autofluorescenza attraverso la maggior parte dei raggi UV e della gamma visibile i quattro fluoro all'estremità rossa dello spettro, come Alexa Fluor 6 47 sono consigliati per ridurre il fondo per innescare il recupero dei campioni, spostare la piastra su un incubatore a 37 gradi Celsius e continuare la coltura per 19 ore. Ciò consente al materiale di riprendersi e alle cellule di adattare la loro morfologia alla nuova topografia. Dopo l'incubazione, applicare i coloranti appropriati come la fallina per l'imaging dell'actina filamentosa.

Come passaggio finale, le cellule possono essere visualizzate sulla nuova topografia mostrata qui è la memoria di forma unidirezionale di una singola cura NOA 63. Ripetuto tre volte dove l'asterisco indica l'esordio sperimentale curato. NOA 63 è un solido trasparente e vetroso che ha eccellenti proprietà di memoria di forma.

In questo caso, il materiale è stato polimerizzato e mostra una TG uniforme di 51,1 gradi Celsius determinata dall'inizio della caduta del modulo di stoccaggio. Il calo di deformazione osservato qui si verifica alla tg misurata. Una grande percentuale del 4,7% di deformazione applicata è stata fissata dopo lo scarico a 20 gradi Celsius corrispondente a un rapporto di fissaggio dell'89,3%La deformazione fissa è stata quindi recuperata a un rapporto dell'84,4% in un intervallo di temperatura relativamente piccolo durante il riscaldamento.

Le prestazioni della memoria di forma non hanno mostrato alcun deterioramento fino a tre cicli, come evidenziato da tutte le curve che seguono quasi esattamente lo stesso percorso. L'ampiezza della topografia temporanea diminuisce nel tempo a 30 gradi Celsius per 30 ore. A 30 gradi Celsius.

L'ampiezza è stata ridotta di circa il 50% indicato qui al tempo zero. Si riduce di un altro 10% nelle successive 9,5 ore. Quando il recupero viene attivato aumentando la temperatura a 37 gradi Celsius, l'ampiezza si riduce allo 0,5% dell'ampiezza iniziale entro 9,5 ore per la goffratura utilizzata e uno stress di goffratura di 4,9 megapascal.

Ciò corrisponde a una variazione funzionale di scanalature di 13 micrometri su una superficie quasi piana. Questo polimero si riprende nell'intervallo di temperatura da 30 a 37 gradi in condizioni di coltura cellulare. Ciò è dovuto all'assorbimento di acqua dal terreno di coltura, la plastica dell'acqua dimensiona il polimero, che abbassa la tg, consentendo il recupero a temperature inferiori al TG secco di 51 gradi.

Un esempio di comportamento cellulare controllato attraverso l'uso di substrati attivi di coltura cellulare è un cambiamento nell'organizzazione del citoscheletro su substrati scanalati temporanei. Prima che il recupero venga attivato, i micro filamenti di actina si allineano lungo la direzione delle scanalature. Dopo il recupero dovuto all'aumento della temperatura, i micro filamenti si sono riorganizzati e sono orientati in modo casuale.

Al contrario, i campioni di controllo che presentano scanalature statiche, piatte o statiche non si riorganizzano dopo l'aumento della temperatura. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la geometria della camera di polimerizzazione, la temperatura di transizione del polimero, il metodo di fissaggio della deformazione e la composizione del polimero stesso possono essere regolati per ottenere la transizione desiderata nel proprio esperimento Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR in tempo reale, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come cambia l'espressione genica in risposta alla stimolazione meccanica dal substrato dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della meccanobiologia cellulare per studiare il citoscheletro cellulare, il riarrangiamento e la fisica della materia morbida in due dimensioni. Grazie per il tuo interesse per il nostro lavoro e grazie per aver guardato.